本文所述的间皮清除实验利用荧光标记的细胞和延时视频显微镜技术，对卵巢癌多细胞球状体与间皮细胞单层之间的相互作用进行可视化观察和定量测量。该实验模拟了卵巢癌转移的早期步骤。
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摘要
摘要
卵巢癌是美国癌症相关死亡的第五大原因1。尽管患者对初始治疗反应良好，但70%至90%的卵巢癌女性患者会发展出新的转移灶，且复发常导致死亡2。因此，为了更好地治疗中晚期卵巢癌，有必要深入了解继发性转移灶的形成机制。卵巢癌的转移发生在恶性细胞从原发肿瘤部位脱落并扩散至腹腔的过程中。这些播散的细胞可形成多细胞簇，即球状体，它们可能保持游离状态，或种植于腹腔内的器官表面3（图1，视频1）。
腹膜腔内的所有器官均由单层连续的间皮细胞所覆盖4-6（图2）。然而，电子显微镜对切除的人类肿瘤组织切片的研究显示，在腹膜肿瘤团块下方不存在间皮细胞3,5-7（图2）。这表明间皮细胞被某种未知机制排除在肿瘤团块下方之外。
上一步 体外 实验表明，原发性卵巢癌细胞对细胞外基质的黏附效率高于对间皮细胞的黏附8，而最近的研究表明，原发性腹膜间皮细胞实际上对卵巢癌细胞的黏附和侵袭具有屏障作用（相较于未被间皮细胞覆盖的基质上的黏附和侵袭）9,10这表明间皮细胞可作为抵御卵巢癌转移的屏障。然而，直到最近，卵巢癌细胞突破该屏障并排斥间皮细胞的细胞与分子机制仍不明确。
在此我们描述了一种方法 体外 模拟卵巢癌细胞球体与间皮细胞相互作用的检测方法 在体 （图3，视频2）。我们的实验方案改编自先前报道的用于分析卵巢肿瘤细胞与间皮单层细胞相互作用的方法。8-16，并首次在一份报告中被描述，该报告指出卵巢肿瘤细胞利用整合素依赖性的肌球蛋白激活和牵引力，促进从肿瘤球体下方排除间皮细胞17该模型利用延时荧光显微镜实时监测两个细胞群体，提供细胞相互作用的空间和时间信息。卵巢癌细胞表达红色荧光蛋白（RFP），而间皮细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。表达RFP的卵巢癌细胞球体附着于表达GFP的间皮细胞单层上，随后球体铺展、侵袭，并将间皮细胞推开，在单层中形成一个空洞。该空洞在GFP图像中表现为负空间（黑色）。通过测量空洞面积，可对对照组与实验组卵巢癌细胞和/或间皮细胞之间的清除活性差异进行定量分析。该检测仅需少量卵巢癌细胞（每球体100个细胞 × 每条件20–30个球体），因此适用于珍贵的原代肿瘤细胞样本。此外，该检测易于扩展用于高通量筛选。
方案
1. 卵巢癌细胞球体形成
- 在10%基础培养基（一种含有199与MCDB105培养基以50:50比例混合的定制细胞培养基，添加10%灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素）中培养表达RFP的卵巢癌细胞。若需在未标记的卵巢癌细胞中表达RFP，可通过转染含有RFP的质粒并筛选表达RFP的细胞实现。或者，也可使用病毒载体瞬时表达荧光蛋白，或预先将细胞与红色荧光细胞示踪染料（Invitrogen）共孵育。
- 在形成卵巢癌细胞球之前，需准备低吸附96孔圆底培养板。为制备低吸附培养板，向Corning公司生产的96孔细胞培养板的每孔中加入30μl聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯（poly-HEMA）溶液（6mg聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯溶于1ml 95%乙醇中）。将96孔板置于37°C非湿润培养箱中孵育，使乙醇蒸发，从而在每孔内壁形成一层poly-HEMA薄膜。该poly-HEMA薄膜可防止细胞贴附于孔底，迫使细胞在悬浮状态下生长18。[也可直接使用Ultra-Low Attachment培养板（Corning）替代经poly-HEMA包被的培养板。]
- 在完成低吸附培养板的制备后，用胰酶消化一板卵巢癌细胞，在台式离心机（Heraeus）中以900 RCF离心3分钟收集细胞，吸除上清液，并用10%基础培养基重悬细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 调整细胞浓度，使每50μl 10%基础培养基中含有100个细胞。
- 将均匀悬....
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讨论
本文介绍的“间皮清除实验”利用延时显微技术，以高时空分辨率监测卵巢癌多细胞球体与间皮细胞单层之间的相互作用。此前，多个研究团队8-14已采用终点法实验表明，卵巢癌细胞能够附着并侵入间皮细胞单层。本实验的独特之处在于使用荧光标记的细胞，以区分肿瘤细胞与间皮细胞，从而在整个实验过程中动态观察这两类细胞群体的行为。细胞嵌入过程可被实时可视化，间皮清除速率也可随时间进行定量测量。延时显微技术的应用使得研究者能够在不同实验条件下密切监测两类细胞群体间相互作用的动力学特征。此外，可对少量间皮细胞或卵巢癌细胞用第三种荧光标记物进行标记，以追踪细胞群体中单个细胞的动态行为。通过随时间追踪单个细胞，可计算其迁移的方向性和速率。为了对间皮清除过程进行更高分辨率的分析，可采用全内反射荧光（TIRF）显微技术。若在间皮细胞中标记了黏着斑结构，则可如我们先前发表的研究17所述，监测肿瘤细胞的突起结构对间皮细胞黏着斑的解离过程。
该实验可用于比较经过基因修饰或药物处理的卵巢癌细胞球状体的侵袭能力，以阐明卵巢癌细胞球状体清除间皮单层的分子机制，或用于鉴定该过程的小分子.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
我们感谢哈佛医学院尼康影像中心，特别是Jennifer Waters、Lara Petrak和Wendy Salmon，为我们提供培训以及使用其延时显微镜的机会。我们还要感谢Rosa Ng和Achim Besser提出的宝贵讨论意见。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金5695837（资助M. Iwanicki）和GM064346（资助JSB）以及Dr. Miriam和Sheldon G. Adelson医学研究基金会资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| OVCA433 卵巢癌细胞 | 由 Dennis Slamon 博士惠赠 | ||
| ZT 间皮细胞 | 由 Tan Ince 博士惠赠 | ||
| Medium 199 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications 公司 | 117-500 | |
| 灭活胎牛血清（FBS-heat inactivated） | GIBCO，Life Technologies 公司 | 10082 | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep） | GIBCO，Life Technologies 公司 | 15070 | |
| 96 孔板 | Corning 公司 | 3799 | |
| 聚羟乙基甲基丙烯酸酯（polyhydroxyethylmethacrylate, poly-HEMA） | Sigma-Aldrich 公司 | 192066-25G | 配制 poly-HEMA 溶液：将 6 mg poly-HEMA 粉末溶于 1 ml 95% EtOH 中 |
| 乙醇（EtOH） | Pharmco-AAPER 公司 | 111ACS200 | 用 dH20 稀释至 95% |
| 细胞培养超净台 | Nuaire 公司 | NU-425-300 | |
| 组织培养孵箱 | Thermo Fisher Scientific 公司 | 3110 | |
| poly-HEMA 板专用孵箱 | Labline Instruments 公司 | Imperial III 305 | |
| 台式离心机 | Heraeus Instruments 公司 | 75003429/01 | |
| 6 孔玻璃底培养皿 | MatTek 公司 | P06G-1.5-20-F | |
| 纤连蛋白（Fibronectin） | Sigma-Aldrich 公司 | F1141-1MG | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Cellgro 公司 | 21-040-CV | |
| 显微镜 | Nikon Instruments 公司 | Ti-E 倒置电动荧光延时显微镜，配备集成的 Perfect Focus 系统 | |
| 物镜 | Nikon Instruments 公司 | 20X-0.75 数值孔径 | |
| 卤素透射光源 | Nikon Instruments 公司 | 0.52 NA 长工作距离聚光镜 | |
| 激发与发射滤光片 | Chroma Technology 公司 | GFP 激发 480/40，发射 525/50；RFP-mCherry 激发 575/50，发射 640/50 | |
| 透射光与落射荧光光路 | Sutter Instrument 公司 | 智能快门（Smart Shutters） | |
| 线性编码电动载物台 | Nikon Instruments 公司 | ||
| 制冷型电荷耦合器件相机 | Hamamatsu 公司 | ORCA-AG | |
| 配备温度与 CO2 控制的显微镜培养室 | 定制 | ||
| 防振台 | TMC 公司 | ||
| NIS-Elements 软件 | Nikon Instruments 公司 | 版本 3 |
参考文献
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M.
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