纳米盘是可将膜蛋白嵌入磷脂双分子层小区域的小型盘状颗粒。我们提供了一个可视化实验方案，展示MalFGK2转运蛋白逐步嵌入纳米盘的过程。
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摘要
摘要
纳米盘是一种盘状颗粒（直径约 10–12 nm），可将膜蛋白嵌入一小片磷脂双分子层中。纳米盘是研究膜蛋白的一种极具吸引力的选择，尤其是在配体-受体相互作用的研究背景下。该方法由 Sligar 及其同事首创，基于一种来源于载脂蛋白 A1 的经工程改造的高α-螺旋支架蛋白的两亲性特性。支架蛋白的疏水面与脂双层的脂肪酰基侧链相互作用，而其极性区域则朝向水环境。与脂质体相比，纳米盘中的膜蛋白分析具有显著优势，因为这些颗粒体积小、均一且可溶于水。此外，通常仅适用于可溶性蛋白的生物化学和生物物理方法也可应用于纳米盘，并可从膜的任一侧进行检测。在本可视化实验方案中，我们逐步展示了已充分表征的细菌 ABC 转运蛋白 MalE-MalFGK2 复合物的重建过程。盘状结构的形成是一个依赖于疏水相互作用的自组装过程，该过程发生在逐步去除去垢剂的过程中。我们描述了关键步骤，并强调了选择合适的蛋白-脂质比例的重要性，以限制聚集体以及更大、多分散性的类脂质体颗粒的形成。通过凝胶过滤色谱、天然凝胶电泳和动态光散射光谱等简单的质量控制手段，可确保纳米盘已正确重建。
方案
整体重组过程
重组过程首先将膜支架蛋白（MSP）与纯化的MalFGK2复合物在去垢剂溶解的磷脂存在下混合。随后通过一种称为Bio-Beads或Amberlite的吸附性聚苯乙烯材料缓慢去除去垢剂（图1）。自组装过程很可能源于疏水性磷脂、MalFGK2复合物与MSP两亲性蛋白表面之间的疏水相互作用。最终产物是由两个MSP分子包裹MalFGK2复合物形成的盘状颗粒。通过超速离心和分析型尺寸排阻色谱法将这些颗粒与加合物及聚集体分离。颗粒的表征采用天然凝胶电泳和动态光散射光谱法进行。
1. 膜支架蛋白（MSP）的制备
- His标签MSP（版本MSP1D1）1) 由质粒 pMSP1D1 表达产生 E. coli BL21 (DE3) 在 OD 诱导600~0.5，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37 °C诱导3小时 37 °C.
- 细胞在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟以收集 4 °C 并在含有TSG10缓冲液中重悬 100 μM 苯甲基磺酰氟
- 细胞在8,000 psi条件下使用高压均质器裂解3次，随后在5,000 × g离心10分钟以去除不溶性物质，温度为 4 °C通过在125,000 × g下超速离心45分钟，分离含有MSP的可溶组分。
- 使用约1.5 ml Ni Sepharose HP在TSG10缓冲液中通过镍螯合层析纯化MSP。用含50 mM咪唑的TSG10缓冲液洗去杂质。用含600 mM咪唑的TSG10缓冲液洗脱MSP。将纯化的蛋白在TSG10缓冲液中透析，并储存于-70 °C 在蛋白质浓度约为 10-15 mg/ml 的条件下。
2. MalFGK2 复合物的制备
- MalFGK2 在质粒 pBAD22-FGK 上表达的 MalK C 末端带 His 标签的复合物 E. coli BL21 (DE3) 且在 OD600~0.5，加入0.2% L-阿拉伯糖，37°C培养3小时 37 °C.
- 在步骤1.3的细胞裂解和离心后，将膜沉淀重悬于TSG20缓冲液中，终浓度为5 mg/ml。随后加入终浓度为1%（w/v）的正十二烷基-β-麦芽糖苷（DDM），在4°C下孵育3小时以溶解膜蛋白。 4 °C 轻柔振荡。
- 不溶性物质通过超速离心去除，步骤同1.3，收集含有可溶化成分的上清液 MalFGK2 复合物的收集与纯化步骤同1.4，但不进行透析。
- 进一步纯化通过在Superdex 200 HR 10/300柱上以0.5 ml/min流速，在TSGD缓冲液中进行凝胶过滤层析实现。
3. 磷脂的制备
- 将溶于氯仿的 E. coli 总脂质提取物分装至带螺帽的微量离心管中，每份含1,000 nmol。在温和的氮气流下蒸发溶剂，并在真空干燥器中过夜进一步干燥。
- 将脂质薄膜溶于TS缓冲液中，终浓度为5 nM，剧烈涡旋并进行超声处理。由于脂质在水性TS缓冲液中通常不溶，溶液会略显浑浊，但应保持悬浮状态。加入DDM至终浓度0.5%（约10 mM），溶液随即变为澄清。
- 将脂质混合物置于水浴中，脉冲式超声处理5次，每次约5秒。脂质混合物可于4 °C保存，最长不超过1周。
4. 生物珠的制备
- 将约 10–15 ml（干体积）Bio-Beads 加入一个 50 ml 离心管中。
- 依次用 50 ml 的 100% 甲醇、95% 乙醇、超纯水（milliQ H2O）和 TS 缓冲液各洗涤两次。
- 将洗涤后的 Bio-Beads 用约 10 ml TS 缓冲液悬浮，于 4 °C 保存。
5. 纳米盘重建
- 将MSP用TSGD缓冲液稀释至终浓度约为7 mg/ml（约0.3 mM）。
- 将约2 nmol纯化的MalFGK2复合物与MSP和脂质按蛋白质:MSP:脂质比例为1:3:60或1:3:400混合于TSGD缓冲液中。终浓度为6 μM MalFGK2、18 μM MSP和360 μM脂质（1:3:60）或2.4 mM脂质（1:3:400）。终体积为300 μl。DDM的终浓度为0.08%（约1.6 mM）。甘油的终浓度取决于所加脂质的量，但通常保持在5–10% v/v左右。
- 向管中加入约50 μl Bio-Bead悬浮液，并在4 °C下于摇床上孵育过夜。
- 通过重力沉降使珠子沉淀，并用细尖移液器将溶液转移，以尽可能避免带入Bio-Beads。
- 通过在100,000 × g下超速离心20分钟去除大颗粒沉淀物。使用TSG10缓冲液通过凝胶过滤层析纯化盘状颗粒，步骤同2.4。合并含有盘状颗粒的组分，并应取部分样品再次注入同一凝胶过滤柱以检测制备物的稳定性。
- 纯化后的盘状颗粒可在-70 °C长期保存。解冻时置于冰上，随后应按照步骤5.5进行超速离心，以去除可能形成的沉淀物。应取部分样品通过凝胶过滤层析分析，以确认在解冻过程中未发生明显的聚集或沉淀。
6. 天然凝胶电泳
- 通过天然PAGE6, 7（Tris-HCl pH 8.8，4-12%）分析1 μM的纳米盘（约0.2 mg/ml），以评估重组的质量（图3A）。
- также通过天然PAGE（图3A）评估MalE（1 μM）与在纳米盘中重组的MalFGK2-复合物的结合情况。
- 电泳后，凝胶用考马斯亮蓝染色10分钟，并脱色约1小时。
7. 动态光散射（DLS）
- 使用Superdex 200 HR 10/300柱，在TSG10缓冲液中以0.1 ml/min的流速通过凝胶过滤层析纯化纳米盘，操作步骤同2.4。合并含有纳米盘的组分，并使用Amicon离心过滤器浓缩至约10 mg/ml。
- 样品在进行DLS分析前需经0.22 μm滤膜过滤两次，使用DynaPro Nanostar仪器（Wyatt Technology）在内体积为1 μl的石英比色皿中检测。采用DYNAMICS软件（Wyatt Technology）对数据进行拟合，以估算颗粒的直径和分子量。
8. ATP酶活性测定
- 使用比色法测定MalFGK2-重组纳米盘的ATP酶活性8。
- 将1 μM纯化的纳米盘与1 mM ATP以及浓度递增的MalE混合，在37 °C下孵育20分钟，于660 nm处测定无机磷酸盐的释放量。
- 根据磷标准溶液绘制的标准曲线，计算所释放磷酸盐的含量。
9. 代表性结果
通过凝胶过滤色谱法纯化纳米盘（图2A，左侧）。色谱图显示，大部分重组后的纳米盘（黑色曲线）以单一峰的形式洗脱，而使用过量脂质制备的纳米盘（红色曲线）则在空体积中洗脱，并表现为一系列宽峰。纳米盘的质量进一步通过天然凝胶电泳和动态光散射光谱法（DLS）进行分析。正确重组的纳米盘在凝胶上迁移为一条清晰的条带，而在过量脂质存在下重组的样品则迁移为弥散条带（图2A，右侧）。DLS分析表明，纳米盘群体均一，平均直径为11.4 nm（图2B）。根据DLS估算，重组纳米盘的表观分子量为215 kDa。在过量脂质存在下重组的样品显示出半径分布广泛，约为100 nm，这是非均一样品的典型特征。
通过天然凝胶电泳评估 MalFGK2 复合物的质量，并通过 ATP 酶活性测定评估其活性（图 3）。麦芽糖结合蛋白 MalE 可高亲和力地结合 MalFGK2 转运蛋白9, 10。利用非变性凝胶电泳，可以检测到 MalE 与 MalFGK2 之间形成的复合物（图 3A）。MalE 对 MalK2 ATP 酶活性的刺激作用如 图 3B 所示。
图1. 重组实验方案的典型流程图。
图 2. 纳米盘制备的质量控制。A. 在低脂质比例（1/3/60；黑色曲线）或高脂质比例（1/3/400；红色曲线）条件下重组的纳米盘的凝胶过滤分析（Superdex 200 HR 10/300 柱）。相同纳米盘制备样品的天然凝胶电泳图。标示了以 kDa 为单位的分子量标记物。B. 相同纳米盘制备样品的动态光散射分析。 点击此处查看大图。
图 3. MalFGK2-纳米盘颗粒的分析。A. MalE 与不同浓度 MalFGK2-纳米盘颗粒孵育后的凝胶迁移分析。B. MalFGK2-纳米盘颗粒的 ATP 酶活性随 MalE 浓度的变化情况。
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讨论
我们描述了一种将麦芽糖转运蛋白重建到纳米盘中的简单方法。该转运蛋白具有ATP酶活性，并且可以重建其与可溶性结合伴侣MalE的相互作用（图3）。成功将转运蛋白重建到纳米盘中，为开展进一步的生物物理和生化分析提供了可能。尤其值得关注的是，在去垢剂、脂质体和纳米盘中对MalK ATP酶活性及麦芽糖转运活性进行系统的比较分析。ABC转运蛋白在转运循环过程中会发生构象变化，但脂质在这些构象变化中的作用仍有待探索。
制备纳米盘的过程相对简单，但若偏离最佳条件，仍可能导致蛋白质发生不可逆聚集。在本报告中，我们强调选择合适的蛋白质与脂质比例的重要性，因为过量的脂质将导致生成较大的多分散性类脂质体颗粒，这些颗粒不符合纳米盘的生物物理特性标准。先前一项研究在麦芽糖转运蛋白的重建中采用了极高的MSP与脂质比例（1/120，而本研究中为1/20），但所形成的颗粒未被进一步表征11。无论如何，必须使用除凝胶过滤之外的其他技术，如光散射光谱、分析型超速离心，或更简单的天然凝胶电泳，仔细分析重建产物的质量。在细菌视紫红质和P-糖蛋白的重建过程中，已突显出...
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致谢
本工作由加拿大卫生研究院资助。CSC 获得加拿大自然科学与工程研究理事会的博士后奖学金资助。FD 是加拿大研究讲席（二级）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra-4 50K 离心滤器 | Millipore | UFC805008 | 遵循制造商关于正确使用的说明 |
| Bio-Beads SM-2 吸附剂 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| E. 大肠杆菌 总脂质 | Avanti Polar Lipids | 100500C | 溶于氯仿中，应按照有机溶剂的适当操作规范进行处理 |
| Ni Sepharose HP 树脂 | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| 磷标准溶液 | Sigma-Aldrich | P3869 | |
| pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| 表 I. 特异性试剂。 | |||
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| 名称 | 组分 | 评论 | |
| DDM 储存液 | 10% w/v DDM | 用超纯水重悬并置于 -20 ℃ 保存 °C | |
| MalFGK2 储备液 | 1-2 毫克/毫升 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 0.03% w/v DDM | 储存于 -70 °纯化后的 C | |
| MSP 储备液 | 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 | 储存于 -70 °C 纯化后 &避免反复冻融，分装为小于1 ml的等份 | |
| 磷脂储备液 | 5 nM E. coli 总脂质 0.5% w/v（10 mM）DDM 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 50 mM NaCl | 4 ℃下保存 °C，持续1周 | |
| TS缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 50 mM NaCl | 4 ℃下保存 °C | |
| TSG10 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 | 4°C 保存 °C | |
| TSG20 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 8 100 mM NaCl 20% v/v 甘油 | 4°C 保存 °C | |
| TSGD 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 0.03% w/v DDM | 4°C 保存 °C，并在使用前立即加入 DDM | |
| 表 II. 溶液配方。 |
参考文献
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