纳米盘是可将膜蛋白嵌入磷脂双分子层小区域的小型盘状颗粒。我们提供了一个可视化实验方案，展示MalFGK2转运蛋白逐步嵌入纳米盘的过程。
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摘要
摘要
纳米盘是一种盘状颗粒（直径约 10–12 nm），可将膜蛋白嵌入一小片磷脂双分子层中。纳米盘是研究膜蛋白的一种极具吸引力的选择，尤其是在配体-受体相互作用的研究背景下。该方法由 Sligar 及其同事首创，基于一种来源于载脂蛋白 A1 的经工程改造的高α-螺旋支架蛋白的两亲性特性。支架蛋白的疏水面与脂双层的脂肪酰基侧链相互作用，而其极性区域则朝向水环境。与脂质体相比，纳米盘中的膜蛋白分析具有显著优势，因为这些颗粒体积小、均一且可溶于水。此外，通常仅适用于可溶性蛋白的生物化学和生物物理方法也可应用于纳米盘，并可从膜的任一侧进行检测。在本可视化实验方案中，我们逐步展示了已充分表征的细菌 ABC 转运蛋白 MalE-MalFGK2 复合物的重建过程。盘状结构的形成是一个依赖于疏水相互作用的自组装过程，该过程发生在逐步去除去垢剂的过程中。我们描述了关键步骤，并强调了选择合适的蛋白-脂质比例的重要性，以限制聚集体以及更大、多分散性的类脂质体颗粒的形成。通过凝胶过滤色谱、天然凝胶电泳和动态光散射光谱等简单的质量控制手段，可确保纳米盘已正确重建。
方案
整体重组过程
重组过程首先将膜支架蛋白（MSP）与纯化的MalFGK2复合物在去垢剂溶解的磷脂存在下混合。随后通过一种称为Bio-Beads或Amberlite的吸附性聚苯乙烯材料缓慢去除去垢剂（图1）。自组装过程很可能源于疏水性磷脂、MalFGK2复合物与MSP两亲性蛋白表面之间的疏水相互作用。最终产物是由两个MSP分子包裹MalFGK2复合物形成的盘状颗粒。通过超速离心和分析型尺寸排阻色谱法将这些颗粒与加合物及聚集体分离。颗粒的表征采用天然凝胶电泳和动态光散射光谱法进行。
1. 膜支架蛋白（MSP）的制备
- His标签MSP（版本MSP1D1）1) 由质粒 pMSP1D1 表达产生 E. coli BL21 (DE3) 在 OD 诱导600~0.5，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37 °C诱导3小时 37 °C.
- 细胞在 5,000 × g 条件下离心 10 分钟以收集 4 °C 并在含有TSG10缓冲液中重悬 100 μM 苯甲基磺酰氟
- 细胞在8,000 psi条件下使用高压均质器裂解3次，随后在5,000 × g离心10分钟以去除不溶性物质，温度为 4 °C....
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讨论
我们描述了一种将麦芽糖转运蛋白重建到纳米盘中的简单方法。该转运蛋白具有ATP酶活性，并且可以重建其与可溶性结合伴侣MalE的相互作用（图3）。成功将转运蛋白重建到纳米盘中，为开展进一步的生物物理和生化分析提供了可能。尤其值得关注的是，在去垢剂、脂质体和纳米盘中对MalK ATP酶活性及麦芽糖转运活性进行系统的比较分析。ABC转运蛋白在转运循环过程中会发生构象变化，但脂质在这些构象变化中的作用仍有待探索。
制备纳米盘的过程相对简单，但若偏离最佳条件，仍可能导致蛋白质发生不可逆聚集。在本报告中，我们强调选择合适的蛋白质与脂质比例的重要性，因为过量的脂质将导致生成较大的多分散性类脂质体颗粒，这些颗粒不符合纳米盘的生物物理特性标准。先前一项研究在麦芽糖转运蛋白的重建中采用了极高的MSP与脂质比例（1/120，而本研究中为1/20），但所形成的颗粒未被进一步表征11。无论如何，必须使用除凝胶过滤之外的其他技术，如光散射光谱、分析型超速离心，或更简单的天然凝胶电泳，仔细分析重建产物的质量。在细菌视紫红质和P-糖蛋白的重建过程中，已突显出.......
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致谢
本工作由加拿大卫生研究院资助。CSC 获得加拿大自然科学与工程研究理事会的博士后奖学金资助。FD 是加拿大研究讲席（二级）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amicon Ultra-4 50K 离心滤器 | Millipore | UFC805008 | 遵循制造商关于正确使用的说明 |
| Bio-Beads SM-2 吸附剂 | Bio-Rad | 152-3920 | |
| E. 大肠杆菌 总脂质 | Avanti Polar Lipids | 100500C | 溶于氯仿中，应按照有机溶剂的适当操作规范进行处理 |
| Ni Sepharose HP 树脂 | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
| 磷标准溶液 | Sigma-Aldrich | P3869 | |
| pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| 表 I. 特异性试剂。 | |||
| <表格 边框="1"> | |||
| 名称 | 组分 | 评论 | |
| DDM 储存液 | 10% w/v DDM | 用超纯水重悬并置于 -20 ℃ 保存 °C | |
| MalFGK2 储备液 | 1-2 毫克/毫升 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 0.03% w/v DDM | 储存于 -70 °纯化后的 C | |
| MSP 储备液 | 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 | 储存于 -70 °C 纯化后 &避免反复冻融，分装为小于1 ml的等份 | |
| 磷脂储备液 | 5 nM E. coli 总脂质 0.5% w/v（10 mM）DDM 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 50 mM NaCl | 4 ℃下保存 °C，持续1周 | |
| TS缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 50 mM NaCl | 4 ℃下保存 °C | |
| TSG10 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 | 4°C 保存 °C | |
| TSG20 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 8 100 mM NaCl 20% v/v 甘油 | 4°C 保存 °C | |
| TSGD 缓冲液 | 50 mM Tris-HCl，pH 7.9 100 mM NaCl 10% v/v 甘油 0.03% w/v DDM | 4°C 保存 °C，并在使用前立即加入 DDM | |
| 表 II. 溶液配方。 |
参考文献
- Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size. J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).
- Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L.
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