荧光染料的逆行运输可根据解剖投射标记特定神经元亚群。标记的轴突可进行可视化靶向 体内，允许对已识别的轴突进行细胞外记录。当神经元无法通过基因操作进行标记或难以使用“盲法”分离时，该技术有助于实现记录 体内 方法
本文内容
摘要
摘要
本方法的总体目标是从已确定的神经元群体中记录单个神经元的电生理反应。体内单个神经元的电生理记录对于理解神经回路在自然条件下的功能至关重要。传统上，这些记录是“盲法”进行的，即在记录开始时无法确定所记录细胞的身份。细胞身份后续可通过细胞内1、紧贴细胞2或松散膜片3电泳注入染料来确定，但这些方法无法在功能异质性细胞类型共存的脑区中预先靶向特定神经元。荧光蛋白可被特异性地表达于特定类型的细胞中，从而实现视觉引导下的单细胞电生理记录4-6。然而，许多模型系统尚不具备可用的遗传工具。即使在遗传操作可行的模型系统中，所需的启动子可能未知，或基因上均一的神经元可能具有不同的投射模式。类似地，病毒载体已被用于标记特定的投射神经元亚群7，但该方法的应用受限于毒性以及缺乏跨突触特异性。因此，亟需开发其他技术，以实现对已识别单个神经元进行体内电生理记录前的特异性可视化。在记录条件具有挑战性的情况下，目标神经元的预先可视化尤为有用，因为在这些情况下，传统的单细胞记录往往难以实施8-11。本文所描述的新技术利用钨针将荧光染料施加于神经通路下游区域，通过逆行运输快速且选择性地标记特定脑区内具有独特轴突投射的神经元亚群，从而提供视觉线索，实现在完整的脊椎动物中枢神经系统回路中对已识别神经元进行靶向电生理记录。
本方法最显著的创新之处在于利用荧光标记技术，在非遗传可及的模式系统中靶向特定细胞类型。弱电鱼是研究清醒且行为活跃动物神经回路的优良模型系统12。我们利用该技术研究弱电鱼类小鳍电鱼前外侧核（ELa）中“小细胞”的感觉信息处理。“小细胞”被认为是一类时间比较神经元，在检测突触前动作电位到达时间的亚毫秒级差异中起重要作用13。然而，由于其解剖学特征，如密集的髓鞘、被包裹的突触以及微小的胞体，使得传统方法极难对此类细胞进行记录11, 14。本文中，我们证明了该新方法可在28%的样本制备中实现对这些细胞的选择性标记，从而能够稳定、可靠地记录其对电感觉刺激的反应并进行特征表征。
方案
1. 准备染料包被的针头
- 通过电解法将直径为160 μm的钨丝 sharpen15。最终针尖直径应在5–50 μm范围内。所需针的数量取决于标记区域的大小。我们为向后外侧外侧核（ELp）进行3–5次注射准备了5根针。
- 实验前一晚，在每根针远端100 μm处滴加一滴（<0.25 μl）2 mM的葡聚糖偶联Alexa Fluor 10,000 MW染料。
- 将针在室温下自然晾干，使染料在针尖处浓缩。将针置于4 °C的避光容器中保存，避免光照。
2. 手术前准备动物
- 将鱼类置于含有 300 mg/L MS-222 的养殖水溶液中，以诱导全身麻醉。
- 称量鱼体质量，并测量叉长（从吻端至尾鳍分叉处）和体高（横断面上的最大背腹距离）。这些测量值应落在表1所示范围内，以确保鱼体可适配于足够小的记录室，从而能够置于水浸物镜下进行观察（图1）。
- 向鱼体背部肌肉注射 100 μl 浓度为 3 mg/ml 的箭毒（flaxedil），以实现固定并阻断其神经肌肉电活动。
- 用养殖水填充记录室（图1A）。将鱼腹侧朝下放置于记录室中央的平台上（图1）。通过将移液枪头插入鱼口，以 1–2 ml/min 的流速持续灌注含氧的 100 mg/L MS-222 溶液。使用固定在鱼体两侧蜡块中的金属杆稳定鱼体（图1C）。通过观察眼动脉中持续的血流以及正常的体色来监测鱼的健康状态。
- 沿平台长轴旋转平台，并降低平台后端，使鱼头部背侧的一侧露出水面，而鱼体其余部分仍浸没于水中。任何未浸没的皮肤区域应覆盖一小块 Kimwipe 纸巾，以防止干燥。
3. 手术（图2）
本文所述的基本手术方法已得到充分确立，并被可靠地用于 Mormyrid 鱼类的盲法体内记录16。对于其他应用，应暴露所需区域以进行标记和记录。目标细胞轴突末梢所在的区域必须能够被涂有染料的针头触及。同一轴突更近端部分所在的区域，其组织上方必须留有足够的空间，以容纳水浸物镜的工作距离（本实验中为 2 mm）。
- 使用棉签在头部暴露的表面涂抹0.4%的利多卡因溶液。
- 使用手术刀片沿皮肤切出一个矩形区域的边缘，然后用镊子取下该矩形组织。矩形大小应根据鱼体大小调整，对于体长6.2 cm的鱼，矩形尺寸约为3 mm × 5 mm（图2A）。矩形的外侧边缘应与眼睛中心对齐，前缘应位于眼睛后方稍远处，内侧边缘应位于鱼体中线稍外侧。
- 将暴露的颅骨区域向头侧和内侧扩展，以暴露一个额外的2.5 mm见方、无重叠的区域（图2B）。
- 使用手术刀片刮除所有多余组织，并用Kimwipe纸和压缩空气干燥，彻底清洁并干燥暴露的颅骨表面（图2C）。
- 使用强力胶将金属柱粘接到前内侧暴露的颅骨区域。等待胶水完全干燥（图2D）。
- 移除一块大小约为2 mm × 4 mm的颅骨（适用于体长6.2 cm的鱼）。使用牙科钻配直径约0.5 mm的球形碳化钨钻头，将矩形区域的边缘磨薄。然后使用手术刀和镊子沿矩形边缘切割并剥离该骨片，以暴露下方脑组织。必要时可进一步使用钻头或小剪刀剪切，以完全暴露外侧背核（EL）（图2E）。若出现肌肉出血，可使用电凝设备止血。
- 使用弹簧剪或针头剪除硬脑膜（有色素）和软脑膜（透明），并用镊子移除剪下的组织。此时外侧背核（EL）的前部（ELa）和后部（ELp）均已可见（图3A）。
4. 逆行标记目标轴突
- 将装有染料的微针（按步骤1制备）固定在操纵器上，并移至目标区域上方，该区域包含本研究关注的轴突，此处为ELp。
- 迅速将微针插入组织约25 μm深度。等待15-30秒，直至所有染料释放完毕，然后撤出微针。
- 根据需要更换新的染料微针，每次插入不同位置，以确保染料在目标区域内均匀分布。每个样本通常使用3-5根微针。
- 用Hickman's ringer溶液冲洗腔体，去除多余的染料。
- 至少等待2小时，以确保染料被充分摄取并完成运输。
5. 目标轴突的可视化
- 将记录室连同鱼类置于直立式固定载物台的落射荧光显微镜物镜下方。由于鱼体阻碍光线穿透，白光和荧光光源均需来自上方。在颅腔上方精确放置光纤光源可获得满意的明场图像。进行落射荧光观察时，荧光滤光片的参数应与染料的吸收/发射光谱相匹配。
- 切换呼吸液为新鲜的水箱水，并保持相同的流速。将接地线置于暴露的脑腔内，并连接至记录头级的接地端（参见6.3）。
- 将一对记录电极放置在尾部基部附近，并连接至差分放大器和记录装置（例如 音频监视器、示波器或计算机）来监测电器官放电指令（EODC）。在鱼从麻醉状态恢复后，可通过EODC来评估其生理状况。
- 在低倍镜下观察脑区，绘制按比例缩放的示意图。包含主要血管作为解剖标志（个体间可能存在差异），用于定位仅在高倍镜下可见的标记轴突的精确位置图3D).
- 确认染料位置。首先在明场照明下观察整个组织以确定方位（图 3A）。然后在荧光照明下观察（图3B）。ELp 将呈现弥散性标记（图3B 和 3C）。尽量减少荧光激发，以降低染料的光动力和光毒性效应。
- 利用血管作为解剖标志，在高倍镜下定位ELa。在表面附近寻找标记的轴突时，使用荧光照明。图4).
6. 记录细胞外活动
- 使用外径1 mm、内径0.58 mm并带有细丝的硼硅酸盐毛细管玻璃管拉制负压记录电极。理想尖端尺寸取决于目标轴突的直径，在本实验中为0.1–0.2 μm17。针对本应用，电极尖端直径为1.5 ± 0.4 μm（范围：1.0–2.4 μm），具有一段5 mm长的细杆，以便在不扰动周围致密组织的情况下接近标记的轴突。
- 用滤过的Hickman任氏液填充电极。最终尖端电阻为45.2 ± 38.0 MΩ（范围：16–155 MΩ）。
- 将电极插入带有压力接口的电极夹中，并连接至安装在操纵器上的放大器前置放大级。从压力接口引出一条压力管路，连接至一个T型接头，其两端分别接压力计和注射器，用于监测和控制压力。
- 将前置放大级连接至放大器和模数转换采集装置。
- 在电极管路中施加30 mbar的外向压力，将电极置于标记轴突旁。使用与成像软件连接的低光照相机观察移液管的位置。从组织表面附近开始，逐步推进电极靠近轴突。当接近轴突时，外向压力应引起轴突轻微但可察觉的移动。
- 当电极位于轴突旁时（图4A，上图），在施加测试刺激的同时记录电极处的电位（在本实验中，我们使用持续100毫秒的单相正负横向脉冲，强度为20 mV/cm；图1A）。此时不应观察到动作电位，但可记录到电刺激伪迹，表明记录/刺激正常（图4A，下图）。
- 释放电极中的外向压力，重复刺激/记录过程。此时仍不应观察到动作电位（图4B）。
- 对电极施加轻微负压（125 ± 25 mbar），并重复刺激/记录。此时应能观察到对刺激产生响应的动作电位（图4C），也可能出现自发性活动。若未观察到动作电位，应释放负压，用轻微正压冲洗电极，轻微移动电极位置后再次尝试施加负压。一旦观察到动作电位，即关闭压力管路。
- 按需进行刺激与记录。
7. 终止与处理
- 完成所有所需记录后，改用含 100 mg/L MS-222 的水进行呼吸，直至电感受器官放电（EODC）完全停止。应至少连续 10 分钟未检测到 EODC。
- 根据所在机构的指导原则及批准的动物护理规程处理鱼类。
8. 代表性结果
针对我们的特定应用，我们关注的是中枢感觉神经元对刺激的编码特性。对标记轴突的成功记录可实现对感觉刺激下单神经元反应的分析18。图5A展示了使用位于记录室左右内壁的双极电极进行横向电感觉刺激所诱发的典型动作电位。放电时间可表示为放电序列 raster 图（图5B）。刺激前25毫秒的记录窗口显示了较低水平的自发性活动。该特定ELa“小细胞”在刺激强度为6 mV/cm时，对刺激持续时间呈长通调谐特性，随着刺激持续时间的增加，每次重复的放电次数也随之增加（图5C）。其平均首次放电潜伏期为4.28 ± 0.16毫秒，与ELa中小细胞预期的潜伏期一致11。
图 1. 可置于固定式载物台落射荧光显微镜物镜下方的记录室规格示意图。 (A) 按比例制作的方形记录室，由有机玻璃制成，显示其顶部、侧面和背面视图。在边缘处成对设置的刺激电极（星号标记）可用于横向（红-黑）或纵向（蓝-黄）刺激。角落处另有一块有机玻璃，其中心带有一个衬有橡胶的孔（橙色），用于固定吸液管，以维持恒定的水位。两个垂直的不锈钢杆（实心绿色）拧入记录室底部，并通过可调节圆盘夹具连接至固定鱼体平台（浅灰色，详见 C）的不锈钢杆（绿色轮廓）。下方为该记录室的照片。 (B) 用于将平台固定在垂直杆上的圆形塑料圆盘夹具的单独及组装视图。每个圆盘夹具均设有用于固定杆的凹槽（绿色）和用于紧固螺钉的中心孔。安装时将两个圆盘夹具的凹槽相互垂直放置，旋紧螺钉（红色）即可将杆牢固夹紧，防止平台进一步发生垂直或旋转移动。 (C) 用于固定鱼体的有机玻璃平台的正面和侧面按比例视图。平台表面涂有一层石蜡（蓝色），用于固定木制销钉（黑色条状物）以支撑鱼体。用于向鱼体供气的管路穿过平台“头板”上的孔洞，并以移液管头插入鱼口。一根不锈钢头部固定杆（灰色条状物）通过球形关节连接至平台，可实现360度旋转。两根水平不锈钢杆（绿色）则分别拧入平台两端。 点击此处查看大图。
图 2. 从上方观察头部背侧表面的手术示意图。 (A) 按照所示顺序进行四次切割，以移除一块矩形皮肤（红色）。(B) 将切口向前内侧延伸，以移除另一块矩形皮肤（绿色）。(C) 按箭头所示方向移动手术刀片，刮除残留的脂肪或韧带，并使用Kimwipes和热风彻底干燥表面。(D) 使用强力胶将不锈钢柱固定于颅骨上。标尺在A中适用至A-D。(E) 使用牙科钻按照所示顺序进行四次切割，以移除一块矩形骨片（蓝色），暴露前外侧核和后外侧核（分别为ELa和ELp）。点击此处查看高清大图。
图3. 注射葡聚糖偶联的Alexa Fluor 568后3小时，外侧后核的荧光标记。 （A） 以上方明场照明观察到的前外侧核（ELa）和后外侧核（ELp）。请注意，ELa 内部广泛的髓鞘化使其呈现相对较亮的外观，从而与 ELp 相区别。 （B） 使用TRITC滤光片通过落射荧光观察的同一区域。 （C） 使用蓝色表示A（明场）和红色表示的合并图像 B （TRITC） （D） ELa 和 ELp 的比例示意图，包含可作为定位标记的主要血管（红线），用于确定仅在高倍镜下可见的标记轴突的精确位置（血管的确切位置因鱼而异）。虚线表示 ELa 与 ELp 之间的边界。 (E) 使用TRITC滤光片从5个不同样本中获取的示例图像，展示了ELa中小细胞轴突和胞体标记效果良好的多种成功染色模式。 单击此处查看大图.
图 4. 来自标记轴突的单细胞胞外记录。 (A) 在正压下，记录电极（箭头）被放置于ELa中一条标记的小细胞轴突旁（上图），仅记录到边缘伪迹（箭头），该伪迹由持续100毫秒、强度为20 mV/cm的单相、对侧为正的横向方波脉冲刺激引发（下图）。 (B) 释放电极的外向压力（箭头）导致轴突轻微向电极移动（上图），但对刺激仍无反应（下图）。 (C) 施加轻微负压将轴突吸入电极内（上图，箭头），此时可观察到刺激起始引发的动作电位（下图，星号）。三幅图的下部均为对20次重复刺激的叠加反应。 点击此处查看高清大图。
图5. 使用该技术的代表性结果。 (A) 5条样本轨迹，显示由持续0.1毫秒、强度为6 mV/cm、单相、对侧为正、横向方波脉冲刺激诱发的动作电位。 (B) 点阵图，显示同一神经元在时间0给予6 mV/cm刺激后，20次重复记录75毫秒时间窗内的峰电位发生时间，右侧列出的是刺激持续时间范围。 (C) 持续时间调谐曲线，量化点阵图中每次刺激重复的峰电位响应次数。 点击此处查看大图。
| 质量 (g) | 叉长 (cm) | 体高 (cm) | |
| 平均值 | 2.42 | 6.20 | 1.14 |
| 标准差 | 0.64 | 0.52 | 0.18 |
| 范围 | 1.2-4.0 | 5.5-8.4 | 0.9-1.6 |
表1. 鱼类的最佳体重、体长和体深范围。 允许鱼类适配于图1所示记录室内的最佳体重、叉长（吻端至尾鳍分叉处）和体深（横断面上最大背腹距离）范围。体型过小的鱼可能手术后存活率较低，且外侧前部椭球体（ELp）较小，导致染料定位困难；体型过大的鱼其小脑体积较大并可能过度延伸，从而限制对前侧椭球体（ELa）和ELp的接近，并可能妨碍高倍水浸物镜下降至足够接近以聚焦于ELa和ELp。
| 应用部位 | 染料类型 | 尝试的鱼类数量 | ELa 中的标记 | ELp 中的标记 | 尝试的单位数 | 记录次数 |
| ELa | Alexa Fluor 注射 | 32 | 26 (81.2%) | 19 (59.4%) | 50 | 4 (8.0%) |
| ELa | 浸有 Alexa Fluor 的滤纸 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| ELa | 溶于 DMSO 的 Di-I | 8 | 6 (75.0%) | 0 | 0 | 0 |
| ELa | Di-O 晶体 | 5 | 3 (60.0%) | 2 (40.0%) | 9 | 0 |
| ELp | 固态 Alexa Fluor 晶体 | 2 | 0 | 2 (100%) | 0 | 0 |
| ELp | 涂覆 Alexa Fluor 的钨丝 | 43 | 29 (67.4%) | 41 (95.3%) | 119 | 26 (21.8%) |
表2. 各种染料注射方法的成功率。 各种染料注射方法的成功率。方法根据注射部位和染料类型进行分类。对于每种方法，列出了尝试注射的鱼类总数，以及在ELa和ELp区域实现成功标记的实验所占百分比。请注意，目标记录区域与施用部位相对（加粗框表示）。在注射部位，若神经元胞体和轴突均被标记，则视为染料摄取成功；而在记录部位，仅当轴突被标记的样本才被计为成功标记的实验。同时列出了尝试记录的单位总数，以及其中成功获得记录的单位所占百分比。
| 注射位点数量 | 每次注射的平均体积 (μl) | 每次注射体积范围 (μl) | 平均总注射体积 (μl) | 总注射体积范围 (μl) | |
| 使用 Hamilton 注射器的显微注射仪 | 3 或 4 | 0.144 | 0.091 - 0.91 | 0.516 | 0.378 - 0.669 |
| 使用玻璃毛细管的纳米注射仪 | 2 - 4 | 0.069 (固定) | 固定体积注射 1-6 次 | 0.621 | 0.414 - 0.966 |
| 使用玻璃毛细管的显微注射仪 | 2 - 6 | 0.093 | 0.058 - 0.202 | 0.360 | 0.252 - 0.540 |
表3. 三种不同方法向ELa注射Alexa Fluor时所用染料的用量 向ELa注射Alexa Fluor所采用的三种方法各自对应的染料用量（第一种方法来自表2）。ELa中的染料注射使用纳米注射仪或显微注射仪完成，注射工具为33号Hamilton注射器针头或拉制的玻璃毛细移液管。我们改变了注射位点数量、单次注射体积以及染料注射的总体积。
讨论
一旦掌握，该技术可实现对多种模式系统中已鉴定的神经元（包括单个轴突）进行体内记录。此外，该技术还能可靠地记录那些因具有独特解剖特征而难以采用传统体内记录方法的神经元的放电输出。我们已利用该技术对骨舌鱼目弱电鱼ELa区的“小细胞”进行了记录。此前，由于记录条件困难，研究“小细胞”调谐特性的尝试均未成功11, 14。类似的解剖特征也阻碍了从多种脊椎动物听觉和电感受神经元中获取单细胞单位记录8-10。为克服本系统中的这些挑战，我们利用了“小细胞”是ELa中唯一投射至ELp的细胞这一特性。因此，在ELp中施加染料后通过逆行运输，可使ELa中仅“小细胞”的胞体和轴突被标记。轴突的荧光标记使得电极能够精确定位于标记的轴突附近，从而在胞体难以接近的情况下仍可实现对已鉴定细胞的单细胞单位记录。我们曾尝试进行胞体记录，但未获成功，可能是因为胞体周围存在大量包裹性突触11,17。然而，胞体的标记清晰可见，提示该技术有望用于其他细胞类型和其他神经环路中的胞体记录。通过体内逆行运输对神经元进行荧光标记，此前已被用于指导体外靶向记录19-21。类似技术也曾用于斑马鱼脊髓运动神经元的靶向体内记录22。我们的工作代表了该方法的创新性拓展，即标记与记录均在脑内体内完成。本方法表明，利用逆行示踪剂对中枢神经系统区域进行体内标记，可进一步推广至其他具有类似选择性投射神经元的完整神经环路研究。例如，在哺乳动物听觉处理过程中，下丘（IC）是来自多个菱脑结构输入的重要中继中心23。向IC注射染料可选择性地标记这些核团中的投射神经元。上丘（SC）在视觉处理中具有类似功能24。脊髓制备特别适合该技术，因为脊髓易于接近，染料注射部位可远离记录位点，并且该方法可与细胞内记录及特定神经元的染料填充相结合，以获取更详细的解剖学信息25。最后，通路示踪是中枢神经系统中广泛使用的一种成熟技术，用于绘制复杂的神经环路26。我们的方法可用于为这类研究增加功能信息，正如钙敏感指示剂在猫视觉皮层研究中的应用所示27。
该手术技术成熟、可靠，常用于盲法体内记录16，必须在尽量减少出血且不损伤脑表面的前提下完成，以确保动物和组织的存活。经过练习，手术和染料应用可在30至45分钟内完成。我们在67%的样本中成功标记了“小细胞”轴突。大多数样本中仅可见1至2条标记轴突，但部分样本中多达8条。在119次尝试标记的神经元中，我们从分布在12个样本中的26个神经元获得了单神经元记录（表2）。因此，在含有标记轴突的样本中，有41%获得了数据，总体成功率为28%。
染料应用的关键在于标记深度。若钨丝插入过浅，染料会被冲洗掉；但若穿透过深，则标记的轴突将无法被观察到，从而难以进行靶向定位。此外，细胞必须受到一定程度的机械损伤，染料才能被充分摄取25, 28。然而，损伤过大会导致细胞死亡。我们曾尝试使用其他染料和其他方法进行标记（表2），包括通过向ELa注射染料进行顺行标记，并在ELp记录标记轴突的活动（表3）。我们推测顺行标记未能成功的原因在于，只有胞体受损的细胞才能被标记，而这些细胞已失去反应能力。此外，突触前终末可能也受到了干扰。相比之下，逆行标记可最大限度地减少上述两个问题。染料的应用量和位置可根据所研究的具体神经环路进行调整。当染料浓度最高时，标记效果最佳，我们通过使用包被钨丝实现了这一浓度。然而，在标记具有深部投射的轴突时，随着钨针的推进，染料可能会脱落。在这种情况下，压力注射更为合适。染料的摄取和运输速度较快，在本实验体系中，注射后2小时即可观察到标记的轴突，部分轴突甚至在注射后6小时才显现。因此，标记与记录可在同一天内完成，避免了与存活手术相关的技术难题。具体所需时间将根据染料运输的距离因实验而异。
另一个关键方面是电极的放置。必须在标记的轴突附近进入组织，以防止电极尖端堵塞。对于ELa等致密组织，记录电极应具有细长的探针，以最大限度减少周围组织的额外移动。如果首次尝试未能成功记录，应更换新的电极重复操作，直至获得记录或组织受损导致轴突不再可见为止。然而，也必须尽快将电极放置到轴突附近，以尽量减少荧光暴露时间，因为长时间暴露可能引起光毒性、荧光淬灭，并可能影响细胞的生理特性29-31。
一旦轴突的一段成功吸入记录电极，即可持续记录数小时。如果记录单位在不到1小时内频繁丢失，可考虑制作更小的电极尖端，以防止轴突滑出。另一方面，电极尖端过小可能导致堵塞、信噪比降低或对轴突造成损伤。若动作电位幅度持续下降，且通过进一步施加负压后信号重新出现，则提示电极尖端可能过大。过大的负压可能对轴突造成不可逆的损伤。一种解决方案是允许气路存在轻微泄漏，使压力缓慢恢复至零。快速平衡压力会导致短暂的相对向外“推力”，可能将轴突推出电极。
尽管该技术在获取特定投射神经元的靶向记录方面具有显著优势，但其无法用于区分局部中间神经元，因为染料会在注射部位被所有类型的细胞摄取。理论上，使用多种荧光染料并结合不同的注射位点，可能使该方法得到扩展。例如，通过比较单标记与双标记结果，可在对神经回路中两个位点进行双重注射后，区分中间神经元与投射神经元。32同样，逆行示踪剂可与其他先进成像技术结合使用，例如双光子成像，近期在斑胸草雀的高级发声中枢（HVc）研究中已实现这一应用。32此外，使用落射荧光显微镜时，记录区域仅限于组织表层附近，因为我们在组织前30 μm范围内仅能分辨出1 μm的结构。然而，通过采用其他显微技术（如双光子显微镜），可进一步扩展成像深度。33 或物镜耦合平面照明显微镜34总体而言，该技术代表了神经环路研究领域的一项重要进展 体内 因为它可用于在多种模式系统中记录单个神经元的活动，包括那些相对难以接近的神经回路。
致谢
本研究由美国国家科学基金会（NSF IOS-1050701 至 B.A.C.）、美国国立卫生研究院（NIH NS54174 至 S.M.，F30DC0111907 至 A.M.L-W.）、上山纪念基金会以及日本促进科学协会（G2205 至 T.K.）提供资金支持。我们感谢 Julian Meeks 在细胞外轴突记录研究方面提供的支持与指导。我们感谢 Carl Hopkins 提供的记录室原型装置。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三卡因甲磺酸盐 | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
| 加拉明三碘化物 | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
| 盐酸利多卡因 | Sigma-Aldrich | L5647 | |
| Hickman’s Ringer 溶液 | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
| 蠕动泵 | Gilson 或 Rainin | Minipulse 3 型号 312；RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm，或使用带流量计的重力供液系统 |
| 解剖显微镜 | Nikon | SM2645 | |
| 超级胶水 | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g 管装 |
| Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
| 球磨碳化钻头 #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 直径（钻头直径 = 0.48 mm） |
| 低温电凝套件 | World Precision Instruments | 500391 | |
| 手动显微操作器 | World Precision Instruments | M3301R | |
| 葡聚糖偶联 Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2 mM 浓度；10,000 MW。染料波长的选择应与显微镜滤光片设置相匹配 |
| 落射荧光显微镜 | Nikon | E600 FN | 配备远程调焦附件有助于精细对焦；TRITC 滤光片，或选择合适的滤光片以匹配不同染料波长的焦平面 |
| 低倍物镜 | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat 系列，4X N.A. 0.1，工作距离 30 mm |
| 高倍物镜 | Nikon | 93148 | CFI Fluor 系列，40X WI N.A. 0.8，工作距离 2.0 mm |
| 白光光源 | Dolan-Jenner | Model 190 | 光纤照明器 |
| 荧光光源 | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
| 低照度相机 | Photometrics | CoolSnap ES | |
| 数字压力计 | Omega Engineering | HHP-201 | |
| 电动显微操作器 | Sutter Instruments | MP-285 | |
| 前置放大器 | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
| 放大器 | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
| 数据采集系统 | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
| 隔离式脉冲刺激器 | A-M Systems | 2100 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | 本应用的程序设置：加热：斜坡 +1，拉力：’0’，速度：60，时间：90，盒式灯丝 |
| 移液管玻璃管 | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 含灯丝的硼硅酸盐毛细玻璃管（外径 1 mm，内径 0.58 mm） |
参考文献
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