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利用GST标记的突变型Rho蛋白（GST-RhoA(G17A)）从上皮细胞裂解液中亲和沉淀活性Rho-GEFs

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DOI：

10.3791/3932

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2012年3月31日

 ,  ,  ,  , 
1Keenan Research Centre, Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital , 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

本文所述方法通过利用一种对激活态GEFs具有高亲和力的突变型RhoA GST融合蛋白，检测培养细胞中RhoA特异性GDP/GTP交换因子（GEFs）的激活情况。GEFs从细胞裂解液中沉淀出来，经蛋白质印迹法检测，并通过密度测定法进行定量。

摘要

Rho家族的小GTP酶蛋白是细胞骨架的核心调控因子，控制着多种细胞过程，包括细胞迁移、基因表达、细胞周期进程以及细胞黏附1。Rho蛋白是分子开关，在与GTP结合时处于活性状态，而在与GDP结合时则处于非活性状态。其激活过程由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）蛋白家族介导。Rho-GEF是一个庞大的蛋白家族，具有重叠的特异性2。尽管在识别特定信号所激活的GEF方面已取得诸多进展，但关于这些蛋白在不同信号通路中的特异性调控机制仍存在许多未解问题。目前已发现超过70种Rho-GEF，且每种细胞通常表达多种GEF蛋白。此外，这些蛋白中的许多不仅可激活Rho，还能激活该家族的其他成员，进一步增加了调控网络的复杂性。重要的是，要研究GEF如何被调控，就需要一种方法来追踪在不同刺激条件下细胞中各个GEF的活性群体。本文提供了一种亲和沉淀法的逐步操作方案，用于评估和定量可获得的、具有活性的Rho特异性GEF。该方法由Burridge实验室数年前建立3,4，我们已在肾小管上皮细胞系中应用此方法5,6,7。该检测方法利用一种“无核苷酸”突变型RhoA蛋白，其对活性GEF具有高亲和力。该突变（G17A）使蛋白无法结合GDP或GTP，从而模拟了与GEF结合的中间状态。将该突变蛋白的GST标签形式在E. coli中表达并纯化后，固定于谷胱甘肽Sepharose珠上，用于从未经处理和经刺激处理的细胞裂解液中沉淀活性GEF。由于大多数GEF通过翻译后修饰或从抑制性结合状态中释放而被激活，其活性状态可在细胞裂解液中得以保留，因此可通过本方法进行检测8。捕获的蛋白可通过特异性抗体结合Western blot检测已知的GEF，或通过质谱分析鉴定由特定刺激所激活的未知GEF。

方案

1. 转化 E. coli pGEX-RhoA(G17A) 质粒构建体

  1. 制备LB琼脂：将2.5 g LB培养基和1.5 g琼脂溶解于100 ml去离子水（dH2O）中。高压灭菌后冷却至约50–55 °C，通常以手能舒适握住三角瓶为判断标准。
  2. 制备氨苄青霉素（Amp）母液：将50 mg/ml氨苄青霉素溶解于dH2O中，用注射器滤器过滤除菌，并将未使用的分装 aliquot 冷冻保存。向步骤1.1中的LB琼脂中加入100 μl氨苄青霉素母液（终浓度为50 μg/ml），轻轻旋转混匀，倒入直径10 cm的细菌培养皿中（每皿15–20 ml）。静置使其凝固（15–30分钟），未使用的平板倒置于4 °C保存2–3周。
  3. 转化大肠杆菌（E. coli）时，将一份DH5α感受态细胞在冰浴中快速解冻。加入1 μl浓度稀释至25–50 ng/μl的pGEXRhoA(G17A) DNA，轻弹管壁混匀，冰上孵育30分钟。42 °C热激45秒，再放回冰上2分钟。加入900 μl SOC培养基，在37 °C摇床中培养1小时。
  4. 用无菌弯头巴斯德吸管将50–100 μl转化后的菌液均匀涂布于LB琼脂-氨苄青霉素平板上。将平板正置于37 °C培养箱中孵育5分钟，随后倒置，过夜培养。
  5. 从平板上挑取单个菌落用于GST标签蛋白的制备（步骤2.1）。如需长期使用，可将平板倒置包裹后于4 °C保存约3周。此外，可通过将单菌落接种于2 ml无菌LB-氨苄青霉素培养基中，在37 °C摇床中过夜培养制备细菌保藏液。取部分菌液与无菌80%甘油按1:1体积比混合，分装后于-80 °C冷冻保存。

2. GST-RhoA(G17A) 珠的制备

  1. 通过将 25 g LB 加入 1 L dH2O 中配制 LB 培养基，并进行高压灭菌。冷却后，向 50 ml LB 中加入 50 μl 氨苄青霉素储存液（终浓度为 50 μg/ml）。接种一个分离良好的转化细菌单菌落，于 37 °C 振荡培养过夜。当菌液达到完全密度（OD600 > 1.0）时，用 450 ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基稀释，并在 37 °C 继续培养 30 分钟。
  2. 通过将 0.238 g 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶解于 10 ml dH2O 中，配制 100 mM 的 IPTG 储存液。分装后于 -20 °C 保存。向 500 ml 菌液中加入 500 μl 100 mM IPTG（终浓度为 100 μM），诱导细菌表达 Rho 蛋白。将温度降至 22–24 °C，继续培养约 16 小时。
  3. 在 4 °C 条件下，以 3600 g 离心 10 分钟收集菌体。如有需要，可将 500 ml 培养物分装至 50 ml 离心管中进行离心。将菌体沉淀于 -80 °C 冷冻至少 1 小时（或更佳为过夜）。
  4. 配制 200 ml 裂解缓冲液：含 20 mM HEPES（0.95 g），pH 7.5；150 mM NaCl（1.75 g）；5 mM MgCl2（0.203 g）；1% TX-100（2 ml）。分别配制 1 M DTT 储存液（1.542 g 溶于 10 ml dH2O）和 100 mM PMSF 储存液（0.174 g 溶于 10 ml 乙醇）。为配制含添加剂的裂解缓冲液（lysis buffer+），在 10 ml 缓冲液中加入 1 mM DTT（10 μl 储存液）、1 mM PMSF（100 μl 储存液）以及一片 Complete Mini 蛋白酶抑制剂片剂。
  5. 在冰上操作，向第 2.3 步所得菌体沉淀中加入 10 ml lysis buffer+。通过轻柔涡旋和移液充分重悬，避免产生泡沫。在冰上以 4 档、50% 脉冲模式超声处理 1 分钟。于 4 °C 以 15,000–20,000 g 离心 15 分钟，将上清液（澄清裂解液）转移至无菌带盖 15 ml 离心管中。
  6. 轻轻混匀含有 75% 悬液的谷胱甘肽 Sepharose 原液，取 335 μl 转移至 15 ml 离心管中。使用宽口吸头移取凝胶珠。加入 10 ml 冷 PBS，于 4 °C 以 500 g 离心 5 分钟。弃去上清液，加入 1 ml lysis buffer+ 重悬凝胶珠，再次离心洗涤。弃去上清液，加入 lysis buffer+ 重悬，制成 50% 悬液。
  7. 将 250 μl 平衡后的凝胶珠悬液加入第 2.5 步所得上清液中。于 4 °C 旋转孵育 45 分钟。
  8. 在 dH2O 中配制 500 ml HBS 缓冲液：含 20 mM HEPES（2.38 g），pH 7.5；150 mM NaCl（4.38 g）。分别配制 1 M MgCl2 储存液（0.952 g 溶于 10 ml dH2O）和 1 M DTT 储存液（1.542 g 溶于 10 ml dH2O）。使用前，向 100 ml HBS 中加入 5 mM MgCl2（50 μl 储存液）和 1 mM DTT（100 μl 储存液），配制成 HBS+。
  9. 将第 2.7 步的凝胶珠于 4 °C 以 500 g 离心 5 分钟。弃去上清液，依次用 10 ml lysis buffer+ 洗涤 2 次，再用 10 ml HBS+ 洗涤 2 次。最后一次洗涤后，用含 BD BaculoGold 蛋白酶抑制剂（每毫升 HBS+ 中加入 20 μl 50 倍浓缩液）的 HBS+ 重悬凝胶珠，制成 50% 悬液。
  10. 取 10 μl 最终制备的凝胶珠悬液，与含 β-巯基乙醇的 2x Laemmli 上样缓冲液混合。配制牛血清白蛋白（BSA）标准品：使用 2 mg/ml 储存液（0.02 g BSA 溶于 10 ml dH2O）。将 10 μl 储存液与 10 μl Laemmli 缓冲液混合（终浓度 20 μg）；5 μl 储存液与 5 μl dH2O 及 10 μl Laemmli 缓冲液混合（终浓度 10 μg）；2.5 μl 储存液与 7.5 μl dH2O 及 10 μl Laemmli 缓冲液混合（终浓度 5 μg）。所有样品煮沸 5 分钟。离心后取上清液，与 BSA 标准品及分子量标记物一同上样至 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
  11. 配制考马斯亮蓝染色液（0.1 g 溶于 10 ml 乙酸、40 ml 甲醇和 50 ml dH2O）和脱色液（500 ml dH2O、400 ml 甲醇和 100 ml 乙酸），室温保存。将凝胶染色 20–30 分钟，回收染色液（可重复使用多次），用脱色液漂洗两次。继续在轻柔摇动下脱色数小时，直至条带清晰可见。
  12. 以 BSA 标准品为参照，估算偶联在凝胶珠上的 GST-RhoA(G17A) 蛋白浓度（图 2）。将含约 10–15 μg 蛋白的等体积凝胶珠分装至 1.5 ml 微量离心管中。短期使用（1 天内）可于 4 °C 保存；若需在数日内使用，应按 3:1 比例与 HBS+/甘油混合后于 -80 °C 冻存。

3. 使用无核苷酸 RhoA(G17A) 珠进行 GEF 拉下实验

  1. 将细胞在10 cm培养皿中培养至融合。至少进行3小时的无血清饥饿处理，并根据需要进行相应处理。
  2. 按步骤2.4配制裂解缓冲液+。为每皿准备700 μl裂解缓冲液，并额外多准备一些以弥补移液误差。使用前立即加入蛋白酶抑制剂。
  3. 在冰上操作，从培养皿中移除培养基，并用预冷的HBS洗涤。彻底移除HBS后，向每皿中加入700 μl裂解缓冲液+。轻轻晃动培养皿使裂解液覆盖整个表面，刮取细胞并收集裂解物至编号的1.5 ml离心管中。在4 °C下以15,000 g离心1分钟。上清液将用于后续检测。
  4. 若所检测各培养皿中的细胞数量相等，可省略蛋白定量步骤，直接进入步骤3.5。否则，使用Bio-Rad快速蛋白定量试剂盒测定各上清液的蛋白浓度，并调整各上清液体积和浓度使其一致。总蛋白用量取决于所用细胞类型（通常LLC-PK1细胞为1–1.5 mg蛋白）。
  5. 取每份上清液30 μl，与30 μl 2x还原型Laemmli上样缓冲液混合，煮沸后置于一旁备用，待进行步骤3.7。将剩余的上清液加入步骤2.12中制备的GST-RhoA(G17A)珠子分装液中，在4 °C下旋转孵育45分钟。
  6. 在4 °C下以6800 g离心珠子10秒，弃去上清液。用裂解缓冲液洗涤珠子3次，每次洗涤间均以相同条件离心。最后一次洗涤液使用装有30 G针头的1 cc注射器彻底吸除，然后加入20 μl 2x还原型Laemmli上样缓冲液。煮沸5分钟，离心使珠子沉淀，上清液可立即进行电泳分析（推荐），或保存于-80 °C以备后续分析。
  7. 将20 μl总细胞裂解液以及全部沉淀的蛋白样品上样至适合目标GEF分子量的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，通过Western blotting使用特异性抗体检测目标GEF蛋白。

4. 代表性结果

本实验方案的第1和第2部分描述了将GST-RhoA(G17A)与GSH-Sepharose磁珠偶联的制备过程，并通过SDS-PAGE进行检测（参见图1中的方案概要）。图2展示了一块典型的考马斯亮蓝染色凝胶。洗脱蛋白样品应在约50 kDa处显示单一蛋白条带（图2，第6泳道）。可通过BSA标准品估算蛋白浓度。在图2所示示例中，RhoA(G17A)的浓度估计为15 μg/10 μl，因此将样品分装为每管10 μl。在我们的实验条件下，通常从10 ml细菌裂解液中可获得15–20 μg蛋白。本方案第3部分描述了亲和沉淀实验（参见图1中的概述）。图3展示了一项成功的GEF实验，用于检测交换因子GEF-H1的激活情况。RhoA(G17A)蛋白从对照组（未处理）细胞裂解液中捕获到部分GEF-H1，表明GEF-H1具有基础活性。然而，在经炎症性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）处理的细胞中，沉淀的GEF-H1量增加，这与TNF-α可激活GEF-H1的观点一致5,7。重要的是，总细胞裂解液中对照组与处理组的GEF-H1含量相近，表明处理未改变GEF-H1的表达水平，且实验中所用上样量相等。

细菌转化流程图；GST-RhoA(G17A)蛋白检测；包括SDS-PAGE、Western blotting。
图1. 实验方案概览。

SDS-PAGE 电泳结果，按分子量分离蛋白质，显示 BSA 和 GST-RhoA。
图 2. 珠粒制备方案的代表性结果。图中为经考马斯亮蓝染色的凝胶，显示 GST-RhoA(G17A) 珠粒成功制备。使用 10% 丙烯酰胺凝胶通过 SDS-PAGE 分离珠粒样品和牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准品。为检测珠粒，取 10 μl 含 GST-RhoA(G17A) 的终末珠粒悬液，按 1:1 比例加入还原性 Laemmli 上样缓冲液，煮沸 5 分钟。短暂离心后取上清液上样。上样样品如下：第 1 泳道：分子量标记物（MW）（FroggaBio BLUeye 预染蛋白 Ladder）；第 2–4 泳道：分别为 5、10 和 20 μg 牛血清白蛋白（BSA）；第 5 泳道为空；第 6 泳道：10 μl 新鲜制备的 RhoA(G17A) 珠粒。电泳完成后，用考马斯亮蓝染色凝胶，随后脱色以显现蛋白质条带。GST-RhoA(G17A) 蛋白的分子量约为 50 kDa，迁移位置接近 48 kDa 标记物。该样品中 GST-Rho 蛋白的浓度估计约为 15 μg/10 μl 悬液。

通过Western blot进行蛋白质分析；TNF-α对GEF-H1活性的影响；实验蛋白条带。
图3. 代表性GEF激活实验，显示TNF-α诱导GEF-H1的激活。将融合生长的LLC-PK1细胞用10 ng/ml TNF-α处理5分钟。处理后裂解细胞，并使用与GST-RhoA(G17A)结合的磁珠捕获活性GEF。通过Western blotting结合抗GEF-H1抗体（Cell Signaling）检测沉淀蛋白（上图）和总细胞裂解液样本（下图）中GEF-H1的存在。请注意，与未处理细胞相比，TNF-α处理组沉淀出的GEF-H1量增加，且相对于相应的上样量，表明实验结果成功。

Western blot 示意图，TNF-α 刺激下活性型与总 GEF-H1 的蛋白表达分析。
图 4. 一个“不良结果”。尽管此处展示的 GEF 下拉实验显示部分 GEF-H1 被磁珠捕获，但从对照组和 TNF-α 处理组细胞中沉淀的蛋白量相同。因此，在本实验中已知可激活 GEF-H1 的 TNF-α 并未诱导其活化。后续排查发现，该实验中所用的 TNF-α 可能不够新鲜，已发生降解。

讨论

本文所介绍的方法是目前唯一可用的非放射性GEF激活检测法，能够追踪细胞内GEF的活性群体。该检测法类似于用于监测小GTP酶以及Rac和Cdc42特异性GEF激活状态的沉淀检测法。这些检测法使用不同的GST标签蛋白，与本文所述方法存在细微差异，但基本步骤相同。因此，本实验方案可轻松适用于其他小GTP酶及GEF的激活检测。

最近，所展示的GEF检测方法已针对核组分的应用进行了改进9,10。通过进一步优化，该方法或许还可用于检测其他亚细胞区域中的GEF激活情况。

我们采用所述方法研究上皮细胞系中鸟苷酸交换因子（GEF）的激活5,6,7。经过适当优化，该检测方法应足以用于检测任何细胞系中的GEF。在适配特定细胞类型时，需确定待测GEF的最佳细胞数量、裂解缓冲液体积及检测方法（用于Western blotting的优质抗体至关重要）。在初次建立该检测体系时，建议使用已知可激活目标GEF的刺激物。当使用未知刺激物时，务必设置阳性对照，以验证检测体系的有效性。该方法可用于通过Western blotting检测已知GEF的激活状态，同时也适用于鉴定未知GEF。为此，应将对照组与刺激组样品中捕获的GEF在考马斯亮蓝染色凝胶上进行分析。仅在刺激组样品中出现的条带可能含有被激活的GEF，可送交质谱分析进行鉴定（例如5）。

最后，需要提出一个注意事项。该检测方法基于一个假设，即细胞裂解后，使鸟苷酸交换因子（GEF）活化的翻译后修饰仍能得以保留。事实上，对于许多GEF而言确实如此，自该方法建立以来，已有多个研究团队利用此方法检测了包括GEF-H1、p115RhoGEF和XPLN在内的多种GEF的活化状态（例如5,11,12,13）。然而，并非所有GEF的活性状态都能在裂解后得到保留，因此该检测方法可能并不适用于所有GEF。此外还需注意，许多GEF可对不止一种小GTP酶发挥活性作用。因此，在研究特定GEF时，建议结合针对其他小GTP酶的GEF沉淀实验，以及对RhoA、Rac1和Cdc42的功能性分析，以补充本实验的结果。

实验方案中的关键步骤：

应从新鲜且正确制备的平板上挑取转化细菌的菌落，以确保氨苄青霉素（Amp）的有效筛选、良好的复苏生长和产量。来自其他来源的感受态细胞的转化条件可能有所不同，应参考相应说明。

蛋白质制备方案（从步骤 2.3 开始）和检测（从步骤 3.2 开始）的所有操作步骤均应在 4°C 条件下进行，并使用预冷的溶液和离心机。

细菌裂解（步骤 2.5）应彻底完全，以获得均一的悬浮液。裂解细菌时，需在 4°C 条件下交替使用涡旋振荡和移液器吹打裂解液，并确保超声处理在冰上进行，以防止蛋白质变性。若使用不同型号的超声破碎仪，可能需要调整条件。裂解液与磁珠的孵育必须始终在 4°C 下于旋转仪上进行，以确保充分结合，同时应注意保持孵育时间的一致性。

GST-Rho 突变体在细菌中表达时稳定性较差，因此最好立即使用制备好的珠子，或在几天内使用完毕。

沉淀实验（第3部分）对时间和温度敏感，因为活性GEF容易从细胞裂解液中丢失，因此应尽快完成各步骤。

以下部分包含一些故障排除建议。

最终珠子样品中突变型 Rho 蛋白含量极少或几乎没有：这可能是由于诱导效率低下、细菌裂解不充分，或在制备过程或储存期间蛋白丢失所致。为帮助排查这些可能原因，可在诱导前后对细菌样品进行分析。若蛋白诱导效果不佳，可使用新划线平板上的单菌落或重新转化的感受态细胞重复实验。还应尝试不同的 IPTG 浓度和诱导时间。若裂解不充分（即蛋白仍存在于沉淀中而非上清液中），可尝试调整裂解缓冲液中的盐浓度和去污剂浓度。也可考虑采用不同的超声处理时间和参数，并通过显微镜检查超声前后的样品，以评估裂解效率。

未检测到沉淀的GEF，即使GST蛋白存在于珠粒上：这可能是由于沉淀实验过程中的技术问题，或所使用的刺激未能真实激活目标GEF所致。务必使用已知有效的刺激作为阳性对照，以验证实验体系的有效性。制备好的珠粒应在数日内使用。若在所有实验条件下沉淀实验均未能捕获到可检测量的目标GEF，请验证GEF是否存在于离心后的上清液中，并可在后续实验（步骤3.3）中被良好检测。确保所有缓冲液和蛋白酶抑制剂均为新鲜配制，并尽可能快速地在冰上完成所有操作步骤。可增加输入蛋白的量（例如，使用每样本两块培养板的裂解物）。若沉淀实验显示GEF存在基础水平的沉淀，但在对照组与刺激组之间无明显差异（图4），应首先通过其他已知效应验证所用刺激是否有效（例如，检测其他信号通路的激活情况）。可考虑调整处理条件和/或刺激浓度。参考文献中关于该刺激如何激活Rho或其他信号通路的报道，以预测合适的处理时间和浓度。在优化处理时间时，应同时设置较短和较长的时间点，因为GEF的激活可能在Rho蛋白明显激活之前的时间点最为显著。最后，由于细胞传代次数、细胞汇合度等因素可能导致细胞反应性变化，相同刺激可能引起不同程度的激活。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）（MOP-97774）和加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC，资助编号：480619）提供资金支持。KS 获得了 KRESCENT 新研究者奖（由加拿大肾脏基金会、加拿大肾病学会和加拿大卫生研究院联合颁发）以及安大略省研究与创新部早期研究者奖。FW 受李嘉诚奖学金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pGEX-RhoA(G17A) Addgene即将上线由北卡罗来纳大学Keith Burridge博士实验室制备（参考文献 3)
DH5αInvitrogen18258-012-80 保存°C
SOC培养基 BioShop CanadaSOC001.10
LBBioShop CanadaLBL407.1保持无菌
甘油BioShop CanadaGLY002.1
氨苄青霉素BioShop CanadaAMP201.25-20℃下储存储备液°C
琼脂BioShop CanadaAGR001.500
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷）Calbiochem420322将储备液在 -20 ℃ 保存°C
谷胱甘肽 Sepharose 微珠GE Healthcare17-0756-01
PBS 10xSigma-AldrichD1408
HepesSigma-AldrichH4034
NaClBioShop 加拿大SOD001.10
MgCl₂2Sigma-AldrichM-9272使用前立即添加
TX-100Sigma-AldrichX100
DTTOmniPur，EMD Millipore3860使用前添加
PMSFSigma-AldrichP-7626使用前立即添加
蛋白酶抑制剂 50xBD 生物科学51-21426Z使用前添加
完全型 Mini，无 EDTA，10 倍浓缩液罗氏集团11 836 170 001使用前立即添加
Laemmli 样品缓冲液 2x伯乐（Bio-Rad）161-0737
β-巯基–乙醇Sigma-AldrichM7154使用前立即添加
考马斯亮蓝伯乐（Bio-Rad）R-250
乙酸CALEDON1000-1
甲醇CALEDON6701-7
Bio-Rad 蛋白检测试剂盒伯乐（Bio-Rad）500-0114
BLUeye DNA标记FroggaBioPM008-0500
<强>表1. 使用的试剂
RC-5B 离心机Sorvall，赛默飞世尔科技SS-34 转子4℃下使用°C
离心机Sorvall，Thermo ScientificST-16R4 时使用°C
微型离心机Eppendorf5417R4℃下使用°C
细菌摇床INFORS HT EcotronAG CH-1403 巴塞尔-比廷根37℃下使用°C 或 22°C
超声波破碎仪布拉松Sonifier-450在室温下使用
旋转器Glas-Col099A CR40124时使用°C
<强>表2. 使用的特定设备

参考文献

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GEF SDS PAGE Sepharose

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