用于肌萎缩侧索硬化症（ALS）小鼠模型的临床检测与脊髓取出

摘要

对一种肌萎缩侧索硬化症（ALS）的小鼠模型进行临床和行为学评估。作为配套免疫组织化学分析的前提，本文详细展示了脊髓组织的制备过程。

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，导致运动神经元进行性退化。散发性疾病的发病高峰年龄约为60岁，而家族性疾病的发病高峰年龄约为50岁。由于其病情呈进行性发展，50%的患者在症状出现后30个月内死亡。为了评估该疾病的新治疗方案，已基于人类家族性SOD基因突变（如SOD1（G93A）突变）建立了ALS的遗传小鼠模型。在模型中需要评估的最重要方面包括总体生存期、临床病程和运动功能。本文展示了临床评估方法，演示了两种行为学运动测试的操作过程，并为所有参数提供了定量评分系统。由于对ALS小鼠模型的深入分析通常需要进行脊髓的免疫组织化学检查，我们详细展示了采用背侧椎板切除法进行脊髓标本制备的技术流程。文中还展示了典型的组织学结果。在ALS小鼠模型研究中全面应用这些检测方法，将使研究人员能够可靠地测试未来的治疗方案，为后续的人体临床试验提供基础。

方案

实验动物购自杰克逊实验室（Jackson Laboratory，货号 # 002726）¹。对动物进行临床评分，并进行运动功能检测（转棒实验）和肌肉力量检测（悬挂丝线实验）。所有这些实验操作，以及后续为制备脊髓而实施的动物安乐死，均严格遵循当地关于动物实验规范操作的指导原则进行。

1. 临床评分

除了检测小鼠体重外，还采用以下4分制评分系统评估其运动功能障碍的迹象²：

4分：正常（无运动功能障碍迹象）

3分：尾巴悬吊时可见后肢震颤

2 分：存在步态异常

1 分：至少一条后肢出现拖拽

0分：对称性瘫痪，无法自行翻身，或体重减轻超过最大体重的20%；出现此情况时，动物应立即实施安乐死，实验终止

2. 运动功能与肌肉力量测试

悬挂金属丝

该实验用于评估肌肉力量^{3, 4}。所有动物均在转棒实验后至少一至两天进行此项测试。将每只小鼠置于自制的金属丝网盖上，网孔间距为0.8 cm，随后小心地将网盖倒置，使其位于铺有垫料的底部上方60 cm处。在经过连续三次、每次至少180秒的训练后，开始测量小鼠的坠落潜伏期。每只小鼠最多进行三次尝试，每次尝试中其在倒置网盖上悬挂的最长时间不超过180秒，记录其中最长的一次悬挂时间。

转棒实验

采用 rotarod 装置（Ugo Basile，Comerio，意大利）评估运动协调性、平衡能力及运动学习能力^{3, 4}。良好的表现需要高度的感覺運動協調能力。实验时应将仪器置于安静且无干扰的环境中，以避免对测试动物造成干扰性刺激。该装置由一台计算机控制的电机驱动旋转轴组成，设有五个通道，可同时测试五只小鼠。当小鼠跌落时，会触碰底部的塑料板，系统可自动检测跌落事件。在以 15 r.p.m. 恒定转速连续训练三次、每次至少持续 180 秒后，记录动物在旋转杆上保持不跌落的时间。每只动物进行三次测试，记录其中最长的不跌落潜伏期。选择 180 秒作为截止时间，是因为在此时间范围内可检测到运动协调性方面的大多数显著差异。

3. 脊髓制备

1. 根据当地指南，通过二氧化碳（CO₂）吸入法处死动物，并立即经心脏灌注磷酸盐缓冲液（PBS），随后灌注4%多聚甲醛溶液。
2. 为准备已处死小鼠的脊髓，将动物置于手术台上，并固定四肢于两侧，以充分暴露背部。
3. 使用70%乙醇溶液对解剖区域进行短暂清洗，以清洁表面并压平毛发。
4. 然后用锋利的手术刀沿正中线切开皮肤。为便于切割，需将皮肤向两侧拉紧。若需制备腿部肌肉，也需切开相应部位的皮肤。
5. 完成皮肤切口后，用镊子将皮肤向两侧拉开，以暴露其下方的浅筋膜组织。
6. 需去除颈部肌肉及项韧带，并小心分离。注意避免切得过深而损伤脊髓。可同时去除肩部肌肉，以更充分暴露脊柱。
7. 随后，从整个脊柱全长去除椎旁肌。
8. 为打开脊柱，需进行多节段椎板切除术。操作应从枕骨髁关节处的颅侧上端开始。
9. 可先松解前肢固定并过度伸展颈部，以便更顺利地切除第一椎体的椎板。操作时应避免接触已暴露的颈段脊髓，将椎板完整移除。
10. 使用斜角剪刀在两侧横断椎弓，再牵拉棘突，以逐节去除更多椎骨。应清除残留的椎骨侧部结构，以便后续完整取出脊髓。
11. 腰段脊髓的一个解剖学标志是膨大区，该结构在颈段脊髓中同样存在。
12. 完成整个脊髓的椎板切除术后，需确保切断所有腹侧神经根，并将脊髓从脑膜的硬脊膜中完全游离。
13. 随后在颅侧切断颈段脊髓，并开始取出脊髓组织。
14. 最终在远端马尾处切断脊髓，使其完全游离。
15. 最后，将脊髓置于后固定液（如4%多聚甲醛）中过夜，随后进行进一步处理。我们通常对脊髓进行冷冻切片，以用于免疫组织化学分析。  

4. 代表性结果

本视频文章的重点是脊髓组织制备技术。该技术是后续组织切片以及最终进行脊髓切片免疫组织化学分析的必要前提。作为最终结果的示例，本文展示了野生型（wt）小鼠和SOD G93A转基因（tg）小鼠腰段脊髓前角区域的免疫组织化学处理结果。运动神经元可通过抗ChAT一抗以及随后的Cy3二抗荧光标记进行识别。此外，还使用DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）对细胞核进行了荧光复染（图1）。

图 1. 荧光显微照片显示了在 130 天龄的野生型（wt）（左侧）和 SOD G93A 转基因（tg）（右侧）小鼠腰段脊髓前角中，使用抗 ChAT 抗体（红色）对运动神经元进行免疫检测以及 DAPI（蓝色）对细胞核的复染结果。比例尺：40 μm。

由于SOD G93A小鼠的免疫组织化学分析并非本文的主要研究范围，建议参考最初描述这些转基因小鼠的原始文献以及近期研究治疗策略的相关文献以获取更多信息^{1, 5, 6}。若需在免疫组织学层面区分治疗效果，应采用明确定义的定量评估算法，并辅以体视学分析软件（例如参见⁷）。

讨论

SOD1（G93A）转基因小鼠模型是一种有价值的动物模型，可用于研究与人类肌萎缩侧索硬化症相似的进行性运动神经元丢失的疾病进程⁸。已有多种不同的治疗方案在此模型中得到评估，为后续开展人类临床研究提供了基础^8-10。为了能够在这些小鼠的实验治疗研究中检测到显著差异，至关重要的是纳入至少24只遗传背景相同、性别均衡且同窝出生的小鼠，并采用双盲设计⁸。类似于人类临床研究，应选择单一且统一的终点判断标准。本文中最为常用的标准是：将动物侧卧后，在30秒内无法自行恢复正常体位。一旦达到该标准，即对动物实施安乐死，并将其存活时间记录为生存期。

治疗研究可以在动物尚未表现出任何运动功能障碍迹象的临床前症状期开始（例如出生后第50天（DOL 50），甚至DOL 30），此时在我们的临床评分系统中评分为4分。另一种方法是采用症状期治疗方案，即在动物首次出现临床症状、且当其尾部被提起时已明显出现后肢震颤时开始治疗。此阶段定义为疾病 onset（发病），初始疾病阶段的临床评分为3分。在运动功能和肌肉力量测试中出现显著损伤通常要再过两到四周后...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠转棒实验	Ugo Basile	# 47600
悬挂式导线装置	定制制作
手术台 手术灯 防护手套
“虹膜” 剪刀，侧向倾斜	Fine Science Tools	14063-09
科汉-范纳斯直型弹簧剪	Fine Science Tools	15000-10
微型镊子	Hammacher，索林根，德国	HWC 111-10
手术刀 “präzisa plus”	Dahlhausen, Kö德国	11.000.00.510，图10