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利用荧光生成型DNA酶检测细菌

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DOI：

10.3791/3961

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2012年5月28日

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University , 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

本文内容

摘要

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）。

摘要

与食源性和医院获得性病原体相关的疫情每年导致数百万人死亡和住院，并造成巨大的经济损失。预防此类疫情暴发以及最大限度地减轻正在进行的流行病的影响，使得人们对能够在最早阶段准确识别致病病原体的分析方法的需求日益增长。尽管目前已有大量有效的病原体检测方法，但尚无任何一种方法能够同时满足理想检测方法所应具备的以下五项首要要求：高特异性（仅检测目标细菌）、高灵敏度（能够检测到低至单个活菌细胞）、快速出结果（数分钟至数小时）、操作简便（无需复杂的采样程序和专用设备）以及成本效益高。例如，传统的微生物学方法虽然特异性高，但获得明确结果需要较长时间（数天至数周）1。基于PCR和抗体的技术虽然等待时间较短（数小时至数天），但需要使用昂贵的试剂和/或复杂的仪器2-4。因此，科学界仍迫切需要开展研究，开发在上述一项或多项要求中性能更优的新型细菌检测方法。本实验室致力于探索DNAzyme作为一类新型分子探针在生物传感应用（包括细菌检测）中的潜力5。

脱氧核酶（也称为脱氧核糖酶或DNA酶）是人工合成的单链DNA分子，具有催化化学反应的能力。6-8 这些分子可以从一个庞大的随机序列DNA库（其中包含多达10^15个序列）中分离出来。16 个体序列）通过一种称为“体外 筛选或指数富集配体系统进化（SELEX）9-16 近年来，这些特殊的DNA分子已被广泛研究，作为生物传感应用的分子工具。6-8

我们实验室已建立 体外 分离RNA切割型荧光DNA酶（RFDs； 图 1并探讨了将RFD用作分析工具的方法。17-29 RFDs 在荧光基团（F）和淬灭基团（Q）之间的单个核糖核苷酸连接位点（R）处催化 DNA-RNA 杂合底物的切割。由于 F 与 Q 彼此靠近，未切割的底物荧光信号极弱。然而，切割反应导致 F 与 Q 分离，伴随荧光强度显著增强。

最近，我们开发了一种用于细菌检测的RFD分离方法5。这些特殊的RFD被分离出来，可在特定类型细菌在其环境或培养基中留下的粗提胞外混合物（CEM）存在时“发光”（图1）。使用粗提混合物可避免耗时的微生物目标物纯化与鉴定过程（该过程可能需要数月甚至数年才能完成），从而简化生物传感器的开发流程。采用胞外靶标意味着检测程序更为简便，无需进行获取胞内靶标的额外步骤。

采用上述方法，我们获得了一种能够切割其底物（FS1）的RFD； 图 2A仅在由CEM产生的条件下 E. coli (CEM-EC)5 这 大肠杆菌-感应型RFD，命名为RFD-EC1（图 2A），被发现仅对CEM-EC有严格响应，而对来自其他多种细菌的CEM均无响应（图 3).

本文介绍了建立实验体系的关键实验步骤 E. coli 使用 RFD-EC1 的检测实验及代表性结果

方案

1. 化学溶液的配制

  1. 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）：在 2 升（L）塑料烧杯中称取 186.1 克 EDTA（EM Science），加入 800 毫升（mL）灭菌去离子蒸馏水（ddH2O）。使用 NaOH 颗粒（EM Science）调节 pH 至 8.0。用 ddH2O 定容至 1 L。将溶液转移至玻璃瓶中，灭菌后于 4 °C 保存。
  2. 10× Tris-硼酸 EDTA 溶液（10× TBE；89 mM Tris，89 mM 硼酸，2 mM EDTA，pH 7.5）：称取 432 克 Tris 碱（BioShop Canada）和 220 克硼酸（BioShop Canada），分别加入 4 L 塑料烧杯中。量取 80 mL 的 0.5 M EDTA（pH 8.0）加入烧杯中。用 ddH2O 定容至 4 L。使用磁力搅拌子充分搅拌，直至各组分完全溶解。将溶液转移至玻璃瓶中，灭菌后于 4 °C 保存。
  3. 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶储备液：向 4 L 塑料烧杯中加入 1681.7 克尿素（BioShop Canada）、400 mL 10× TBE 和 1 L 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）溶液（BioShop Canada）。用 ddH2O 定容至 4 L。搅拌溶解尿素。将溶液分装至 1 L 棕色玻璃瓶中，于 4 °C 保存。（注意！丙烯酰胺在聚合前为神经毒素，操作时应佩戴手套、口罩、护目镜和实验服。）
  4. 2× 凝胶上样缓冲液（2× GLB）：在 200 mL 玻璃烧杯中加入 44 克尿素、8 克蔗糖（BioShop Canada）、10 毫克溴酚蓝（BioShop Canada）、10 毫克二甲苯青 FF（Sigma-Aldrich）、400 μL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS；BioShop Canada）和 4 mL 10× TBE。用 ddH2O 定容至 40 mL，并在 50 °C 轻微加热条件下使用磁力搅拌子溶解固体。将溶液分装为每管 1 mL，装入 1.5 mL 微量离心管中，于 4 °C 保存。根据我们的经验，使用前需将 2× GLB 短暂加热至 90 °C，因其在储存条件下会凝固。
  5. 1 M Tris-HCl（pH 7.5）：在 200 mL 玻璃烧杯中称取 12.1 克 Tris 碱，加入 60 mL ddH2O，用磁力搅拌器搅拌溶解。使用 1 M HCl（Sigma-Aldrich）调节 pH 至 7.5。用 ddH2O 定容至 100 mL，转移至玻璃瓶中灭菌。于 4 °C 保存。
  6. 5 M NaCl：在玻璃烧杯中称取 58.4 克 NaCl（BioShop Canada），用 150 mL ddH2O 溶解。用 ddH2O 定容至 200 mL。将溶液转移至玻璃瓶中，灭菌后于 4 °C 保存。
  7. DNA 洗脱缓冲液：在玻璃烧杯中混合 2 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、8 mL 5 M NaCl 和 0.4 mL 0.5 M EDTA（pH 8.0）。用 ddH2O 定容至 200 mL。灭菌后于 4 °C 保存。
  8. 2× 反应缓冲液（2× RB；100 mM HEPES，300 mM NaCl，30 mM MgCl2）：向 50 mL Falcon 管（BD Falcon）中加入 1.2 克 HEPES（BioShop Canada）、0.88 克 NaCl 和 0.30 克 MgCl2•6H2O（EMD Chemicals），再加入 30 mL ddH2O。轻轻振荡混合，直至各组分完全溶解。加入 10 N NaOH 溶液调节 pH 至 7.5，并用 ddH2O 定容至 50 mL。使用注射器驱动滤器单元（0.22 μm，Millipore）过滤溶液，于 4 °C 保存。
  9. Luria Bertani（LB）肉汤：在烧杯中称取 20.0 克 LB 粉末（Sigma-Aldrich），加入 1 L ddH2O。使用磁力搅拌子充分混匀，将溶液转移至锥形瓶中。灭菌后于室温保存。
  10. 1.5% LB 琼脂：在 250 mL 锥形瓶中称取 1.5 克琼脂（BioShop Canada），加入 100 mL 液体 LB。灭菌混合物后于室温保存。
  11. 琼脂平板制备：在微波炉中融化 LB 琼脂，冷却至约 50 °C。在火焰保护下将溶液倒入培养皿（Fisher Scientific）中。根据我们的经验，100 mL LB 琼脂可制备 5–6 块平板。

2. 通过模板介导的酶促连接构建 RFD-EC1 和 RFSS1

RFD-EC1（图 2A）是本研究中的特征性脱氧核酶，由催化序列 EC1 和底物序列 FS1 组成（在 图 2A 中分别以黑色和绿色线条表示）。RFSS1（图 2A）是 RFD-EC1 的打乱序列版本，其中催化序列 EC1 被部分重排为 SS1，而 FS1 区域保持不变。RFD-EC1 和 RFSS1 是通过在连接模板 LT1 存在下，以酶促连接方式将寡核苷酸 FS1 与寡核苷酸 EC1 或 SS1 进行模板介导连接而制备的（见 图 2A 中的插入框）。连接反应的操作步骤如下所述。FS1 来自耶鲁大学 Keck 寡核苷酸合成中心，按照先前建立的方案进行脱保护并经凝胶电泳纯化17-24。EC1、SS1 和 LT1 购自 Integrated DNA Technologies 公司，并通过凝胶电泳进行纯化。

  1. 使用ddH2O配制100 μM的FS1、EC1、SS1和LT1储备液。储存于-20 °C，待用。
  2. 将5 μL的FS1储备液分别转移至两个标记为1号管和2号管的1.5 μL微量离心管中。向每管中加入38.5 μL ddH2O，然后加入5 μL 10× T4多核苷酸激酶（PNK）反应缓冲液A（MBI Fermentas），该缓冲液含有500 mM Tris-HCl（pH 7.6，25 °C）、100 mM MgCl2、50 mM DTT和1.0 mM亚精胺。通过移液器吹打混匀（上下吹打数次）。
  3. 加入1 μL ATP（100 mM；MBI Fermentas），并通过移液器吹打混匀。
  4. 加入0.5 μL T4多核苷酸激酶（PNK；10单位/μL；MBI Fermentas），并通过移液器吹打混匀。将反应混合物在37 °C孵育30分钟。务必用铝箔覆盖管子，以尽量减少荧光染料的光漂白。
  5. 在90 °C加热5分钟以终止反应。将反应混合物在室温下冷却10分钟。
  6. 向1号管中加入5 μL EC1储备液，向2号管中加入5 μL SS1储备液。
  7. 向每管中加入5 μL LT1储备液，通过移液器吹打混匀。将反应混合物在90 °C加热1分钟，然后在室温下冷却10分钟。
  8. 向每管中加入118 μL ddH2O，然后加入20 μL 10× T4 DNA连接酶缓冲液（MBI Fermentas），该缓冲液含有400 mM Tris-HCl（25 °C时pH 7.8）、100 mM MgCl2、100 mM DTT和5 mM ATP。通过移液器吹打混匀溶液。
  9. 加入2 μL T4 DNA连接酶（5单位/μL；MBI Fermentas），并通过移液器吹打混匀。将反应混合物在室温下孵育1小时。
  10. 向每管中加入20 μL 3 M NaOAc（pH 7.0），涡旋混匀后离心。向每管中加入500 μL预冷的100%乙醇，涡旋混匀后将管子置于-20 °C冰箱中30分钟。
  11. 在4 °C下，使用冷冻离心机（Allegra X22-R，Beckman Coulter）以11,000 g离心20分钟，并通过移液小心去除上清液。
  12. 使用DNA浓缩仪（Savant DNA Speedvac，Thermo Scientific）干燥DNA沉淀10分钟。
  13. 将DNA沉淀重悬于30 μL 1×凝胶上样缓冲液（GLB）中，短暂涡旋后使用台式离心机（Minicentrifuge，VWR Scientific）离心。连接后的DNA样品即可用于上样至10% dPAGE凝胶。

3. 10% dPAGE 胶的制备

以下步骤简要描述了凝胶电泳装置及其设置方法。有关该装置、设置和操作的更多详细信息，请参阅我们此前发表的方案30,31。

  1. 清洗并干燥两块玻璃板、两个0.75 mm的间隔条和一个16孔梳子。用夹子将玻璃板和间隔条组装好，水平放置在平坦表面上，缺口朝上的玻璃板朝上。
  2. 将40 mL的10% dPAGE混合液转移至150 mL烧杯中。加入40 μL四甲基乙二胺（TEMED; Bioshop Canada）和400 μL 10%过硫酸铵（APS），用移液器轻轻混匀。
  3. 小心将混合液倒入玻璃板之间，并立即插入梳子。静置聚合10至20分钟。可通过观察烧杯中残留的凝胶混合液是否凝固来确认聚合是否完成。
  4. 聚合完成后，轻轻取出梳子，并用ddH2O冲洗加样孔，以去除孔内残留的凝胶溶液。
  5. 将玻璃板安装到凝胶电泳装置上，使无缺口的矩形玻璃板朝外，并在有缺口的玻璃板后方放置一块金属板。使用金属板有助于防止过热，从而避免玻璃板破裂。
  6. 向装置的上下两个电泳槽中加入1× TBE缓冲液。检查确认加样孔内已充满缓冲液，且凝胶的下边缘浸没在缓冲液中。
  7. 施加40 mA（或750 V）电流，预电泳10至15分钟。

4. 通过10% dPAGE凝胶纯化连接产物RFD-EC1和RFSS1

  1. 继步骤 3.7 之后，使用注射器和针头以 1× TBE 冲洗各孔。
  2. 使用移液器和凝胶上样吸头（Diamed）将 RFD-EC1 和 RFSS1（来自步骤 2.13）的连接产物分别加入 2 个孔中（每孔一个）。施加 40 mA（750 V）电流，直至底部染料（溴酚蓝）距离玻璃板底边约 5 cm 处。
  3. 从凝胶电泳装置中取出玻璃板，平放在实验台面上，小心移除间隔条。
  4. 小心地从凝胶上取下顶部玻璃板，并用塑料膜包裹凝胶（尽量避免塑料膜在凝胶表面产生褶皱或折叠）。
  5. 可通过紫外阴影法（260 nm）或透射光法（360 nm）观察连接产物，在 EC1 或 SS1 上方数厘米处可见 DNA 条带（可使用 100 pmol 的 EC1 或 SS1 作为标记物，并在步骤 4.2 中上样至一个孔中）。用记号笔标记目标 DNA 条带。
  6. 用无菌剃刀切下目标 DNA 条带，将凝胶切成小块，转移至新的 1.5 mL 微离心管中。
  7. 在微离心管中使用无菌移液器吸头（200 μL 规格）碾碎凝胶碎片。
  8. 向每根管中加入 500 μL DNA 洗脱缓冲液，并用铝箔覆盖以保护荧光染料免受光照。涡旋振荡样品 10 分钟。
  9. 在低温离心机（Allegra X22-R，Beckman Coulter）中以 11,000 g、4 °C 离心 4 分钟，小心吸取 350 μL 上清液转移至新的 1.5 mL 微离心管中（如需，可用 350 μL 新鲜洗脱缓冲液再次洗脱 10 分钟）。
  10. 向每根管中加入 35 μL（样品体积的 0.1×）3 M 醋酸钠（NaOAc，pH 7.0），涡旋混匀后短暂离心。再向每根管中加入 900 μL 冰冷的 100% 乙醇。用手轻轻摇动管子数秒以混匀各样品。将管子置于 -20 °C 至少 1 小时。
  11. 在低温离心机中以 11,000 g、4 °C 离心 20 分钟，小心用移液器吸除上清液。
  12. 加入 100 μL 冰冷的 70% 乙醇，轻轻冲洗管子内壁全部区域。再次以 11,000 g、4 °C 离心 7 分钟。吸除上清液后，使用 DNA 浓缩仪干燥沉淀 10 分钟。
  13. 将 DNA 沉淀溶解于 100 μL ddH2O 中并涡旋混匀。根据 260 nm 处的紫外吸光度测定 DNA 浓度。样品储存于 -20 °C，待用时取出。

5. 细菌的制备

  1. 首先将目标细菌菌株 E. coli K12 (MG1655) 及相关的对照菌株从甘油菌种接种至LB琼脂平板。在火焰旁或生物安全柜内，用无菌移液器吸头接触细菌甘油菌种，并轻轻在平板表面划线，避免损伤LB琼脂。
  2. 将划线后的平板倒置，在37 °C下培养14小时。培养结束后，用Parafilm（Pechiney Plastic Packaging）密封平板整个边缘，并在4 °C下保存。这些平板最多可保存4周。

6. 粗制胞外混合物（CEMs）的制备

  1. 使用移液枪（Corning）将 2 mL LB 培养基加入无菌的 14 mL 培养管（BD Falcon）中。
  2. 用无菌移液枪吸头从 5.2 步骤制备的琼脂平板上挑取单个菌落，并将其接种至培养管中。将培养管置于设定为 37 °C 的摇床（New Brunswick Scientific）中，以 250 rpm 振荡培养 14 小时。
  3. 1% 重新接种培养：将 2 mL 新鲜 LB 培养基加入 14 mL 培养管中，并加入 20 μL 第 6.2 步骤制备的菌液。在 37 °C 下以 250 rpm 振荡培养，直至各菌液的 OD600（在 600 nm 处测得的光密度）达到约 1。测量 OD600 时，将每种培养物 1 mL 转移至一次性比色皿中，使用紫外分光光度计（Genesys UV 10, Thermo Scientific）在 600 nm 处测定吸光度。
  4. 将每种培养物 1 mL 转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在室温下以 11,000 g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
  5. 将澄清的上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，如不立即使用，则在 -20 °C 下保存。

7. 使用荧光分光光度计检测

  1. 打开荧光分光光度计（Cary Eclipse，Varian Inc），设置数据采集参数，激发波长为 488 nm，发射波长为 520 nm。每分钟采集一次读数，持续 1 小时。
  2. 用 ddH2O 清洗 3 个石英比色皿（Varian Cary），然后用 100% 乙醇冲洗。用氮气吹干比色皿。将比色皿标记为 C1（对照 1）、C2（对照 2）和 T（测试）。
  3. 向 C1 中加入 24 μL ddH2O，向 C2 和 T 中各加入 24 μL CEM-EC。向每个比色皿中加入 25 μL 2× RB，然后将其放入荧光分光光度计中。开始采集前 5 分钟的荧光数据。
  4. 向 C2 中加入 1 μL RFSS1（来自 5 μM 储备液），向 T 和 C1 中各加入 1 μL RFD-EC1（来自 5 μM 储备液）。通过移液器吹打混匀各溶液。此步骤必须小心操作，以避免中断荧光读数。让反应在剩余的 1 小时采集时间内继续进行。
  5. 将数据保存为 Excel 文件格式，传输至个人计算机，并对数据进行处理以生成图形图像。

8. 琼脂糖凝胶电泳检测

步骤7.4中制备的相同反应混合物可用于凝胶电泳分析；或者可类似地制备新的反应体系，并在1.5 mL微量离心管中孵育。无论哪种情况：

  1. 反应1小时后，加入5 μL 3 M NaOAc和125 μL 100%乙醇以终止反应。通过涡旋振荡混合各溶液，并将离心管置于-20 °C冰箱中1小时。
  2. 在4 °C条件下，以11,000 g离心反应混合物20分钟，并用移液器小心吸除上清液。
  3. 使用DNA浓缩仪将沉淀物干燥10分钟。
  4. 将沉淀物重悬于20 μL 1× GLB中，短暂涡旋振荡混匀。用台式离心机（Minicentrifuge, VWR Scientific）短暂离心以使液体沉至管底。这些样品即可用于上样至dPAGE凝胶。
  5. 按3.1–3.7所述方法制备10% dPAGE凝胶。使用移液器和凝胶上样吸头（Diamed）将反应样品（来自步骤8.4）加入凝胶加样孔中。施加40 mA（750 V）电流，直至底部染料（溴酚蓝）距离玻璃板底边约5 cm处。
  6. 取下玻璃板，用自来水彻底冲洗以去除残留凝胶碎片。用无尘纸（Kimwipe, Kimberly-Clark Professional）擦拭玻璃板。
  7. 使用Typhoon扫描仪（Typhoon 9200，可变模式，GE Healthcare）对凝胶板进行荧光扫描。使用ImageQuant软件（Molecular Dynamics）分析数据。

9. 检测特异性

  1. 为测试细菌特异性，采用上述相同的培养步骤 E. coli，制备其CEM并进行切割反应检测可用于多种不同的细菌菌株，例如 B. subtilis, P. peli, Y. ruckeri, L. plantarum, P. acidilactici （如图所示） 图 3A).

10. 单细胞检测

通过连续稀释法配制1 mL浓度为2 CFU/mL（CFU：菌落形成单位）的大肠杆菌（E. coli）甘油菌种，并通过涂布平板法确认CFU浓度5。该菌种应含有0.2 CFU/100 μL。保存于-80 °C，直至使用。

  1. 准备10个含有2 mL LB培养基的培养管。
  2. 每个培养管中接种100 μL浓度为2 CFU/mL的甘油菌种，并在37 °C、250 rpm振荡条件下培养。使用全部甘油菌种（1 mL）应可获得10个培养物。
  3. 在以下时间点：4、8、12、16和24小时，从每个接种后的培养管中取样300 μL。剩余培养物继续培养至24小时。
  4. 测定OD600，并通过在11,000 g离心5分钟沉淀细胞。
  5. 将CEM转移至新的1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存备用。
    注意：由于在4、8和12小时时间点采集的样品可能无明显可检测的OD600值，需将剩余培养物继续培养至24小时，以鉴定含有细菌的培养物（通过浊度和OD值测定判断）。接种后，10个培养物中可能仅有一个或两个含有E. coli，其余试管中将不含任何细胞。
  6. 使用从阳性培养物（-20 °C保存）在指定时间点回收的CEM，与RFD-EC1进行切割反应，并按照第8节所述方法通过dPAGE凝胶电泳分析反应混合物。

11. 概念与代表性结果

利用RNA切割型荧光DNAzyme（RFD）进行细菌检测的概念如图所示 图1RFD 在由两个核苷酸夹在中间的单一RNA连接处（蓝色R）切割嵌合的DNA/RNA底物，这两个核苷酸分别标记有荧光团（F）和淬灭团（Q）。当目标细菌（例如 E. coli）在培养基中生长时，会留下一种粗制的胞外混合物（CEM）。随后将整个CEM直接用于 体外 通过筛选实验获得一种特异性响应CEM的RFD；推测该RFD与CEM中某种特定分子（紫色星号）相互作用，该分子为该细菌的标志性分子。当将CEM加入含有RFD的反应溶液中时，会触发RFD的RNA切割活性。切割事件使F与Q分离，从而产生荧光信号，可通过荧光计或凝胶电泳检测。

上述概念的实验验证是使用 CEM 进行的 E. coli （CEM-EC）。我们通过 体外 筛选，并将效率最高的一个命名为 RFD-EC1（图 2A).5 我们检测了RFD-EC1（以及一个名为RFSS1的突变序列）对CEM-EC的切割活性。RFD-EC1和RFSS1均通过将DNA酶部分与底物FS1进行酶促连接制备而成（所有序列均示于 图 2A）。在荧光测量实验中（图 2B），CEM-EC 单独孵育 5 分钟后，加入 RFD-EC1 或 RFSS1，再继续孵育 55 分钟。每分钟连续读取溶液的荧光强度，所得数据用于计算相对荧光值（RF；定义为时间 t 时的荧光强度与时间 0 时的荧光强度之比）。将 RF 值随孵育时间的变化绘制成图 图 2B研究发现，RFD-EC1在加入CEM-EC后产生了强烈的荧光信号；相比之下，RFSS1并未产生明显的荧光信号。因此，RFD-EC1在接触CEM-EC时产生荧光的功能具有序列特异性。

为了验证观察到的荧光增强是由于RNA连接被切割所致，我们通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（dPAGE）分析了反应混合物。RFD-EC1的切割预期将产生两个DNA片段：一个保留荧光基团的5′片段和一个保留淬灭基团的3′片段。荧光成像仅能检测到未切割的RFD-EC1（unclv）和5′片段（clv）。图2C所示的dPAGE结果表明，RFD-EC1与CEM-EC的反应混合物确实产生了预期的切割产物，而RFSS1/CEM-EC混合物则未产生。

使用从多种其他革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中收集的细胞外囊泡（CEM）检测 RFD-EC1 的特异性，结果如图 3A所示。只有含有 CEM-EC 的样本（蓝色曲线）产生了荧光增强。RFD-EC1 与其他细菌来源的 CEM 无交叉反应，表明其对E. coli具有高度选择性。

我们还检测了培养单个 E. coli 细胞以产生足以诱导 RFD-EC1 切割的 CEM 所需的时间。在本实验中，将含有已知 CFU（菌落形成单位）的 E. coli 样品充分稀释，使其浓度达到 1 CFU/mL。随后将 100 μL 稀释后的细菌样品与培养基混合，并分别培养 4、8、12、16 和 24 小时。收集每个时间点的 CEM，并检测其诱导 RFD-EC1 切割活性的能力。图 3B 所示的 dPAGE 结果表明，需要 12 小时的培养时间。

需要注意的是，在将RFSS1序列（作为阴性对照）加入CEM-EC（图2B；红色曲线）或将RFD-EC1加入其他细菌CEM（图3B；除蓝色曲线外的所有曲线）后，荧光检测中观察到的初始微弱信号上升，归因于FRQ模块的本征荧光（由于F被Q淬灭不完全所致）。因此，加入F和Q标记的序列会产生初始荧光增强是预期之中的现象。然而，只有RFD-EC1与CEM-EC的混合物才能随时间推移产生高水平的荧光信号。

RNA切割型荧光DNA酶示意图，展示通过RFD-靶标复合物进行细菌检测的原理。
图1. RNA切割型荧光DNA酶（RFD）探针的示意图，该探针在接触特定目标细菌细胞产生的粗制胞外混合物（CEM）后产生荧光。RFD在嵌合DNA/RNA底物的单一RNA连接位点（蓝色R）处进行切割，该位点两侧的核苷酸分别标记有荧光基团（F）和淬灭基团（Q）。在切割反应发生前，由于F与Q彼此靠近，RFD的荧光水平极低。切割发生后，Q与F分离，从而产生强烈的荧光信号。

基因编辑；连接过程示意图、反应图谱、凝胶电泳结果、DNA分析。
图2. 用于检测 E. coli 的RFD探针。（A）RFD-EC1 是一种可被 CEM-EC 激活的脱氧核酶探针；RFSS1 是 RFD-EC1 的随机序列，用作对照。RFD-EC1 和 RFSS1 分别通过在模板 LT1 存在下将 FS1 与 EC1 或 SS1 进行连接而制备。F：荧光素修饰的脱氧胸苷；Q：Dabcyl 修饰的脱氧胸苷；R：腺嘌呤核糖核苷酸。（B）RFD-EC1 和 RFSS1 在 CEM-EC 存在下的荧光信号谱。（C）B 中裂解反应混合物的 dPAGE 分析（反应时间：60 min）。图中为使用 Typhoon 扫描仪获得的 dPAGE 凝胶的荧光图像。泳道 NC：仅含反应缓冲液的 RFD-EC1 或 RFSS1；泳道 CEM-EC：含 CEM-EC 的反应缓冲液中的 RFD-EC1 或 RFSS1。Marker：经 0.25 N NaOH 处理的 RFD-CE1，该处理可导致 RNA 完全裂解。unclv：未裂解的 RFD-EC1；clv：含有荧光团的裂解片段。

蛋白质纯化、电泳结果；随时间变化的蛋白质切割图谱分析。
图 3. (A) 不同细菌细胞制备的胞外膜组分（CEM）中 RFD-EC1 的荧光信号谱。EC：Escherichia coli-K12；PP：Pseudomonas peli；BD：Brevundimonas diminuta；HA：Hafnia alvei；YR：Yersinia ruckeri；OG：Ochrobactrum grignonense；AX：Achromobacter xylosoxidans；MO：Moraxella osloensis；AI：Acinetobacter lwoffi；SF：Serratia fonticola；BS：Bacillus subtilis；LM：Leuconostoc mesenteroides；LP：Lactobacillus plantarum；PA：Pediococcus acidilactici；AO：Actinomyces orientalis。每种 CEM 样品均先孵育 5 分钟，随后加入 RFD-EC1。(B) RFD-EC1 与 CEM-EC 混合物反应 60 分钟后的 dPAGE 分析。泳道 NC1：仅含反应缓冲液中的 RFD-EC1；泳道 NC2：含 CEM-BS（由 Bacillus subtilis 制备的 CEM）反应缓冲液中的 RFD-EC1；标为 4、8、12、16 和 24 的泳道：分别对应在单个 E. coli 细胞培养物中生长 4、8、12、16 和 24 小时后提取的 CEM-EC 与 RFD-EC1 在反应缓冲液中反应后的结果。

讨论

目前大多数常见的细菌检测方法要么速度较慢（传统微生物学方法），要么技术要求较高（抗体法、PCR法）。因此，我们认为下一代检测工具应朝着更快、更简便的方向发展。为此，我们开发了一种可切割RNA并产生荧光信号的脱氧核酶（DNAzyme），可用于构建简单的检测体系，通过产生荧光信号来报告细菌的存在。本研究中所展示的DNAzyme探针RFD-EC1可被大肠杆菌（E. coli）在培养基中生长时产生的CEM所激活。由于本方法直接使用细菌的粗提胞外混合物作为检测靶标，无需繁琐的靶标提取与扩增步骤，因此可用于建立极为简便的“混合即读”型细菌检测方法。我们开发的DNAzyme不仅限于荧光检测。例如，可结合之前报道的滚环扩增技术与有机染料，设计基于同一DNAzyme系统的比色检测方法32。我们预计，将DNAzyme用于细菌检测是一条极具吸引力的途径，有望开发出操作更为简便的新型细菌生物传感器。

致谢

本工作的资助由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）以及哨兵生物活性纸张网络提供。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂BioShop CanadaAGR003
过硫酸铵（APS）BioShop CanadaAMP001
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（40%，29:1）BioShop CanadaACR004
硼酸BioShop CanadaBOR001
溴酚蓝Sigma-AldrichB8026
EDTAElectron Microscopy SciencesEXO539-1
HClSigma-Aldrich38281
HEPESBioShop CanadaHEP001
LB肉汤Sigma-AldrichL3022
MgCl2EMD MilliporeB10149-34
NaClBioShop CanadaSOD002
NaOAcEMD MilliporeSXO255-1
NaOHEMD MilliporeSXO590-1
SDSBioShop CanadaSDS001
TEMEDBioShop CanadaTEM001
Tris碱BioShop CanadaBST666
Tween 20Sigma-AldrichP9416
尿素BioShop CanadaURE001
二甲苯青FFSigma-AldrichX4126
DNA浓缩仪Thermo Fisher Scientific, Inc.Savant DNA SpeedVac 120
Millipore滤器单元EMD MilliporeSLGP033RS
加样枪头DiamedTEC200EX-K
ImageQuant软件Molecular DynamicsVersion 5.0
Kimwipes纸巾Kimberly-Clark Corporation34705
微型涡旋振荡器VWR international58816-121
Parafilm封口膜Pechiney Plastic PackagingPM996
培养皿Fisher ScientificFisherbrand 08-757-12
移液枪（Stripettor Plus）Corning07764714
石英比色皿Varian Inc., Agilent66-100216-00
摇床/培养箱New Brunswick ScientificClassic Series C24
Typhoon扫描仪GE Healthcare9200 Variable mode
离心机Beckman Coulter Inc.Allegra X22-R
紫外分光光度计Thermo Fisher Scientific, Inc.GenesysUV 10
荧光分光光度计Varian Inc., AgilentCary Eclipse

参考文献

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