大鼠胚胎神经细胞的分离与培养：一种快速方案

摘要

我们介绍一种从啮齿类动物胚胎中快速分离和培养海马及皮层神经元的方法。该方案使我们能够开展需要近乎纯化神经元培养的实验。

摘要

我们介绍一种快速分离和培养E15-17大鼠胚胎海马或皮层神经元的方法。该方法也可成功用于小鼠和人原代神经元及神经前体细胞的分离。分离得到的神经元可在无血清培养基中维持数周。这些培养物可用于核转染、免疫细胞化学、核酸制备以及电生理学实验。较成熟的神经元培养物也可通过慢病毒转导实现高效转染，而使用磷酸钙法或脂质体（如Lipofectamine）等脂质介导方法的转染效率则较低。

方案

1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：制备

1. 向5 mg聚-D-赖氨酸（PDL）中加入5 ml无菌去离子水（ddH₂O），配制成1 mg/ml的储备液。
2. 通过移液枪反复吹打混匀储备液。
3. 立即使用，或将聚-D-赖氨酸溶液储存于2–8 °C。

2. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：包被塑料细胞培养皿

1. 用无菌 ddH₂O 将 PDL 储存液稀释至终浓度为 10 μg/ml。
2. 取足量溶液加入 60 mm 培养皿中，以覆盖整个培养表面（60 mm 培养皿加 3 ml）。
3. 轻轻摇动，确保培养表面均匀包被。
4. 将包被好的培养板在室温（RT）孵育过夜。
5. 次日（通常为解剖当天），用移液器吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用 3 ml 无菌 ddH₂O 快速洗涤一次，重复该步骤一次。第二次洗涤后，彻底吸除残留液体。
6. 培养板可在 4 °C 保存长达三周。

3. 聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白：玻璃双室载玻片的制备与包被

1. 将 PDL（1 mg/ml）和层粘连蛋白（laminin，1 mg/ml）的储存液用无菌 ddH₂O 稀释，分别配制....

讨论

本文所述的大鼠海马和皮层神经元的分离与培养方法，可实现在化学成分明确的培养基中进行近乎纯化的神经元培养实验（图3）。尽管已有文献报道过在无血清培养基中培养近乎纯化神经元的方案^2,3,4，但我们的方法进行了若干重要改进。与传统方案（如Banker等）⁵不同，我们使用TrypLE Express替代胰蛋白酶，这是一种更为温和的细胞解离酶。此外，我们省略了两个可能影响神经元完整性的步骤：在酶消化前对皮层或海马组织进行机械切碎，以及使用DNase。同时，在Hibernate E培养基中进行胚胎组织解剖（步骤4.2）有助于维持细胞的活性与健康状态。Hibernate E是一种可在常氧二氧化碳水平下维持神经组织或细胞活性的营养培养基（Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY）。该培养基最初用于运输分离的脑区组织（如海马、纹状体和皮层），也可在神经组织分离过程中维持脑组织活性，或在显微观察、电生理记录及流式细胞术期间保持神经元的健康状态。事实上，图4展示了大鼠皮层神经元在玻璃双室载玻片上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal	98%
B27	2%
Glutamax	0.5 mM
表 I. Neurobasal/B27 完全培养基.
葡萄糖	16 mM
蔗糖	22 mM
HEPES	10 mM
NaCl	160 mM
KCl	5 mM
Na2HPO4	1 mM
KH2PO2	0.22 mM
庆大霉素	50 μg/ml
两性霉素B	250 ng/ml
pH	7.4
渗透压	320–330 mOsm
表 II. 解剖用培养基.
Neurobasal/B27 完全培养基	240
0.4% 台盼蓝染液	250
总量	490
表 III. 50 倍计数溶液.
Hibernate E	Brainbits	767171
Neurobasal	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
B27	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
两性霉素B	GIBCO, by Life Technologies	15290-018
硫酸庆大霉素	Sigma-Aldrich	G1264
200 mM Glutamax	GIBCO, by Life Technologies	35050
不含酚红的 TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies	12604
盐酸阿糖胞苷（Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride）	Sigma Aldrich	C6645
多聚-D-赖氨酸	Sigma Aldrich	P6407
层粘连蛋白 1 mg/ml	EMD Millipore	CC095
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
0.4% 台盼蓝染液	GIBCO, by Life Technologies	15250
表 IV. 特定试剂.
体视显微镜	Olympus Corporation	SZ61
大号镊子	Fine Science Tools	11022-14
尖头镊	Moria	MC40B
微型尖头镊	Moria	MC31
锋利剪刀	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6820
微型解剖剪	Fine Science Tools	91460-11
微型解剖弯头剪	Fine Science Tools	14067-11
双室玻璃培养皿	Lab-Tek	154461
60 mm 培养皿	BD Biosciences	353002
100 mm 培养皿	Corning	430167
15 ml 离心管	BD Biosciences	352099
1.5 ml 冻存管	Nalge Nunc international	375353
表 V. 特定设备.