我们介绍一种从啮齿类动物胚胎中快速分离和培养海马及皮层神经元的方法。该方案使我们能够开展需要近乎纯化神经元培养的实验。
本文内容
摘要
摘要
我们介绍一种快速分离和培养E15-17大鼠胚胎海马或皮层神经元的方法。该方法也可成功用于小鼠和人原代神经元及神经前体细胞的分离。分离得到的神经元可在无血清培养基中维持数周。这些培养物可用于核转染、免疫细胞化学、核酸制备以及电生理学实验。较成熟的神经元培养物也可通过慢病毒转导实现高效转染，而使用磷酸钙法或脂质体（如Lipofectamine）等脂质介导方法的转染效率则较低。
方案
1. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：制备
- 向5 mg聚-D-赖氨酸（PDL）中加入5 ml无菌去离子水（ddH2O），配制成1 mg/ml的储备液。
- 通过移液枪反复吹打混匀储备液。
- 立即使用，或将聚-D-赖氨酸溶液储存于2–8 °C。
2. 多聚-D-赖氨酸（PDL）：包被塑料细胞培养皿
- 用无菌 ddH2O 将 PDL 储存液稀释至终浓度为 10 μg/ml。
- 取足量溶液加入 60 mm 培养皿中，以覆盖整个培养表面（60 mm 培养皿加 3 ml）。
- 轻轻摇动，确保培养表面均匀包被。
- 将包被好的培养板在室温（RT）孵育过夜。
- 次日（通常为解剖当天），用移液器吸除聚-D-赖氨酸溶液，并用 3 ml 无菌 ddH2O 快速洗涤一次，重复该步骤一次。第二次洗涤后，彻底吸除残留液体。
- 培养板可在 4 °C 保存长达三周。
3. 聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白：玻璃双室载玻片的制备与包被
- 将 PDL（1 mg/ml）和层粘连蛋白（laminin，1 mg/ml）的储存液用无菌 ddH2O 稀释，分别配制成终浓度为 10 和 5 μg/ml 的混合溶液。
- 取足量溶液加入玻璃双孔培养板的孔中，确保完全覆盖培养表面（每孔加入 1 ml，适用于双孔玻璃培养板）。
- 轻轻摇动，确保培养表面均匀包被。
- 将包被好的培养板在室温下孵育过夜。
- 次日，用移液器吸除 Poly-D-Lysine-Laminin 包被液，并用 1 ml 无菌 ddH2O 快速洗涤两次；第二次洗涤后，彻底吸除残留液体。
- 包被后的培养板可在 4 °C 保存最多三周。
注意：任何玻璃培养皿载玻片均可按照本方案进行包被。我们通常使用双孔载玻片，因为每张载玻片可同时提供对照和实验组的实验设置（例如，未处理 versus 处理、未转染 versus 转染）。
4. 神经元分离与培养
- 将以下试剂在37°C水浴中预热 37 °C 水浴锅：
- TrypLE Express，原装100 ml瓶装。
- Neurobasal/B27 完全培养基（参见 表 I). 加热的体积取决于需要铺板的培养皿数量（例如，10个60 mm的培养皿需要30 ml）。
- 向四个60 mm培养皿中各加入3 ml冷的Hibernate E溶液，并向一个15 ml BD Falcon高透明度聚丙烯锥形管中加入13 ml。
- 加入25–30 ml冷的解剖液（参见 表 II，Olimpia Meucci 博士，个人通讯）加入三个 100 mm 培养皿中。这些含有大量培养基的培养皿将用于胚胎从羊膜囊中取出后立即进行清洗（步骤 4.7 和 4.8）。
- 通过 CO 对妊娠 17 天的孕鼠实施安乐死2 根据《公共卫生服务政策》关于实验动物的人道护理与使用的规定，并在机构批准的动物护理与使用方案下进行。
- 用70%乙醇喷洒下腹部，用剪刀沿中线剪开皮肤和肌肉，暴露子宫和胚胎。
- 取出所有胚胎，置于含有过量冷解剖液（25–30 ml，见步骤4.3）的无菌100 mm培养皿中。
- 用小型剪刀从羊膜囊中剪取胚胎，并将其置于第二个含有冷解剖液的100 mm培养皿中。
- 在室温下轻轻倾斜100 mm培养皿，洗涤胚胎5–10秒。随后，将洗涤后的胚胎转移至第三个含有解剖液的100 mm培养皿中。通常用过量的解剖液洗涤两次即可完全去除血液残留。如有必要，可使用一个新的含有25–30 ml冷解剖液的100 mm培养皿再洗涤一次。
- 使用体视显微镜和弯头镊子，通过拉开皮肤和颅骨取出每只大鼠胚胎的脑组织。将完整脑组织置于盛有冷Hibernate E培养基的60 mm培养皿中（通常每皿不超过5个脑组织）。将这些培养皿置于冰上保存。
- 一次取一个培养皿，在解剖显微镜下分离半球，并分离大脑皮层，去除中脑和脑膜。
- 可选：沿中线切开脑组织，取出海马体，并按照以下步骤分离海马神经元。
- 将所有解剖得到的皮层组织收集到一个含有13 ml冷Hibernate E培养基的15 ml透明锥形管中。将大脑皮层组织置于冰上，直至所有解剖操作完成。由于海马体积较小，解剖所得的海马可收集于1.5 ml离心管中，而非15 ml管。如有需要，此时可将皮层或海马组织转移至含有1 ml Hibernate E + 2% B27 + 庆大霉素的冻存管中50 μg/ml) + 两性霉素B（250 ng/ml），每瓶加入2-4个大脑皮层或2-4个海马组织。脑组织可保存于 4 °C 在避光条件下最多可保存一周（更长时间尚未测试）。必要时，使用精细镊子将脑组织转移至含有 Hibernate E 的 15 ml 管中，随后按照以下方案分离神经元。
- 将试管转移至组织培养罩中。让皮质组织沉降到试管底部，然后小心移除上清液。
- 向15 ml锥形管中加入13 ml新鲜的Hibernate E培养基，静置使皮质组织沉降至管底，小心吸除上清液。重复此步骤2次，最后一次洗涤后，小心彻底移除所有培养基。
- 通过向脑皮层中加入1-2 ml温热的TrypLE Express（根据皮层数量调整用量；若用于海马体分离，则使用较少体积）进行酶消化。用Parafilm密封离心管管口，并将离心管漂浮于水浴中 37 °C 水浴10分钟。
- 用70%乙醇喷洒管子后打开管盖，加入10 ml Hibernate E溶液。让皮层组织沉降至管底，吸去上清液。重复此步骤三次，以彻底清除TrypLE Express。最后一次步骤中，小心吸除所有培养基。
- 用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管（直径约1 mm），在2 ml Neurobasal/B27完全培养基中轻轻吹打匀浆4–5次。注意避免产生气泡。
- 用直径更小的无菌玻璃巴斯德移液管（即直径约为1/2-3/4 mm的移液管）重复吹打4-5次。切勿使用比此更细的巴斯德移液管，否则会破坏细胞。
- 让残留的组织碎片（通常极少或没有）自然沉降。
- 将上层单细胞悬液转移至新的15 ml离心管中，留下已沉淀的组织碎片。用Neurobasal/B27完全培养基将细胞悬液进一步稀释至10–12 ml。
- 充分混匀，并通过加入适当溶液稀释细胞以进行计数 10 μl 细胞悬液的量至 490 μl 50倍计数溶液（见 表 III在1.5 ml Eppendorf离心管中。
- 将细胞以 5.0 × 10⁵ 个/孔的密度接种于 PDL 包被的培养板中4/cm2. 如果要进行核转染，我们建议以较高浓度接种细胞（8-10 × 104/cm2).
- 通常情况下，每次实验解剖9-10只胎鼠，因为大约13 x 106 每个E17胎鼠可获得神经元。若需要更多胚胎，需确保整个操作过程不超过两小时。
- 如需要，分离后24小时 10 μM 可向每孔中加入阿糖胞苷（cytosine-β-D-arabinofuranoside, AraC），以抑制胶质细胞增殖。然而，此步骤并非必需，因为根据制造商说明（Invitrogen/Gibco），Neurobasal/B27 培养基本身即可抑制胶质细胞增殖。
- 神经元在培养4-5天后可用于实验 体外，尽管具体时间取决于所需的分化阶段。我们已将神经元培养长达4周，未观察到存活率显著下降（图1).
- 长期培养时，每周更换一次培养基，使用新配制的Neurobasal/B27完全培养基。
5. 代表性结果
培养在玻璃腔室载玻片上的神经元可进行免疫细胞化学染色。图1展示了一张典型的图像，皮层神经元在培养五天后固定，并用抗MAP-2抗体进行免疫标记，以显示神经元的突起结构。
图2展示了大鼠海马神经元在培养3周后的代表性图像。通过MAP-2免疫标记（MAP-2神经元标志物，小鼠单克隆抗体克隆AP-20，Gene Tex，Irvine，CA）突出显示完全分化细胞的神经元形态，标记步骤遵循此前所述的标准操作流程1。图像使用配备EXI aqua相机（Qimaging）、电动Z轴和SlideBook5采集/去卷积软件（Intelligent Imaging Innovations, Inc.，Denver，CO）的Nikon Eclipse E400正置荧光显微镜进行观察。每幅图像的三维图像序列经去卷积处理合并为一幅二维图像，并通过将信号截断值调节至接近最大强度以提高分辨率。
图3显示了神经元培养物的纯度。蛋白裂解物来源于DIV7大鼠神经元培养物（ctx）和一例人脑胶质母细胞瘤（GBM）样本。如预期所示，神经元裂解物对神经元蛋白MAP-2呈强阳性，对星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性；而GBM蛋白裂解物对MAP-2呈阴性，对GFAP呈阳性。
尽管在我们的实验方案中，我们已使用Hibernate E作为解离和冲洗介质多年，但最近我们探索了其另一种非常实用的用途，即用于保存脑组织以供后续使用。 图4 说明若干天 体外 5（DIV5）培养的皮层神经元，源自于皮层组织分离的大鼠皮层神经元 4 °C 在从胚胎中初次分离后，于 Hibernate E + B27 培养基中培养一周。神经元接种于经多聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）包被的双室玻璃载片上，具体方法如前所述。所获图像使用 SlideBook5 采集/去卷积软件进行去卷积处理，方法如上所述（图2).
图 1. 皮层神经元转染 pmaxGFP（Amaxa, Lonza, Walkersville, MD）并用红色标记的 MAP-2 抗体进行免疫染色的代表性图像。原始放大倍数为 100×。
图 2. 培养 3 周后海马神经元的 MAP-2 免疫标记代表性图像，红色显示。DAPI 染色（蓝色）显示细胞核。原始放大倍数为 40×。
图3. Western印迹显示神经元细胞培养物的纯度。将30 μg大鼠神经元和人胶质母细胞瘤（GBM）蛋白裂解液进行电泳分离，并按标准流程1进行Western印迹分析。抗MAP-2抗体为Cell Signaling（美国马萨诸塞州丹弗斯）提供的兔多克隆抗体，抗GFAP抗体为Chemicon（Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）提供的鼠单克隆抗体，抗GRB2鼠单克隆抗体购自BD Transduction Laboratories（美国马里兰州斯帕克斯）。GRB2用作上样对照。
图4. 代表性图片（各时间点） 体外 5（DIV5）日龄大鼠皮层神经元，来源于置于Hibernate E + B27中的皮层组织 4 °C 解剖后一周。A) 在玻璃双室载玻片上培养的神经元的相差显微图像，原始放大倍数20倍。B) 免疫荧光显示神经元突起中MAP-2的表达（绿色）；该培养物对星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性。DAPI染色（蓝色）显示细胞核。原始放大倍数40倍。
讨论
本文所述的大鼠海马和皮层神经元的分离与培养方法，可实现在化学成分明确的培养基中进行近乎纯化的神经元培养实验（图3）。尽管已有文献报道过在无血清培养基中培养近乎纯化神经元的方案2,3,4，但我们的方法进行了若干重要改进。与传统方案（如Banker等）5不同，我们使用TrypLE Express替代胰蛋白酶，这是一种更为温和的细胞解离酶。此外，我们省略了两个可能影响神经元完整性的步骤：在酶消化前对皮层或海马组织进行机械切碎，以及使用DNase。同时，在Hibernate E培养基中进行胚胎组织解剖（步骤4.2）有助于维持细胞的活性与健康状态。Hibernate E是一种可在常氧二氧化碳水平下维持神经组织或细胞活性的营养培养基（Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY）。该培养基最初用于运输分离的脑区组织（如海马、纹状体和皮层），也可在神经组织分离过程中维持脑组织活性，或在显微观察、电生理记录及流式细胞术期间保持神经元的健康状态。事实上，图4展示了大鼠皮层神经元在玻璃双室载玻片上培养5天后的代表性图像。在处理前，这些皮层组织自E17胚胎分离后，在4 °C避光条件下保存于Hibernate E + B27培养基中达一周时间。有趣的是，组织在4 °C保存数天后分离得到的神经元，在形态学上与胚胎解剖后即刻分离的神经元相当。这种允许在胚胎解剖后不同时间点分离神经元的灵活性，对于实验规划极为有利，因而可更充分地利用妊娠动物资源。
需要指出的是，我们的方案在 E13 至 E17 胚胎上效果良好，但尚未在新生或成年啮齿类动物上进行测试。该方案在人胎儿神经元的分离与培养中也表现出色（未发表数据）。
通过本文所述方法分离的细胞可接种于组织培养皿中，用于需要收获大量细胞以进行RNA/DNA或蛋白质提取的实验。例如，在我们关于HIV-Tat蛋白的研究中，对神经元进行某些化合物或肽类处理即属于此类应用1。此外，也可用于研究生长因子介导的信号通路，或纯化RNA以进行基因表达分析及miRNA表达谱芯片检测6。
此外，在铺板前对神经元进行核转染，可为研究影响神经元分化的分子或生长条件提供一种工具1。其他应用包括使用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（Invitrogen, Carlsbad, CA）转染已分化的神经元1。尽管其转染效率相较于核转染较低，但仍适用于对灵敏度要求较高的实验，如荧光素酶报告基因检测或电生理学研究。另外，培养在玻璃底共聚焦培养皿上的神经元可进行免疫细胞化学染色（图1和图4B）1。最后，我们已成功采用本方案从小鼠胚胎中分离神经前体细胞7，仅在最后一步进行了修改，即按照先前描述的方法7,8，将分离得到的神经前体细胞培养于特定培养基中。总体而言，这一简单方法具有多种应用，可便捷地获得适用于无需胶质细胞支持的神经元培养研究的神经元。然而，也可在这些神经元培养体系中加入胶质细胞共培养体系或胶质细胞来源的条件培养基，以研究胶质细胞诱导突触形成的机制9，例如Pfrieger和Barres所描述的研究10。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Jonna Ellis提供的编辑协助。本项目由美国国家心理健康研究所资助，资助编号为R01MH079751（项目负责人：F. Peruzzi）。本内容仅由作者负责，不代表美国国家心理健康研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0.5 mM | ||
| 表 I. Neurobasal/B27 完全培养基. | |||
| 葡萄糖 | 16 mM | ||
| 蔗糖 | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0.22 mM | ||
| 庆大霉素 | 50 μg/ml | ||
| 两性霉素B | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| 渗透压 | 320–330 mOsm | ||
| 表 II. 解剖用培养基. | |||
| Neurobasal/B27 完全培养基 | 240 | ||
| 0.4% 台盼蓝染液 | 250 | ||
| 总量 | 490 | ||
| 表 III. 50 倍计数溶液. | |||
| Hibernate E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| 两性霉素B | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| 硫酸庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| 200 mM Glutamax | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| 不含酚红的 TrypLE Express | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| 盐酸阿糖胞苷（Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride） | Sigma Aldrich | C6645 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma Aldrich | P6407 | |
| 层粘连蛋白 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 0.4% 台盼蓝染液 | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| 表 IV. 特定试剂. | |||
| 体视显微镜 | Olympus Corporation | SZ61 | |
| 大号镊子 | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| 尖头镊 | Moria | MC40B | |
| 微型尖头镊 | Moria | MC31 | |
| 锋利剪刀 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| 微型解剖剪 | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| 微型解剖弯头剪 | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| 双室玻璃培养皿 | Lab-Tek | 154461 | |
| 60 mm 培养皿 | BD Biosciences | 353002 | |
| 100 mm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 15 ml 离心管 | BD Biosciences | 352099 | |
| 1.5 ml 冻存管 | Nalge Nunc international | 375353 | |
| 表 V. 特定设备. |
参考文献
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- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
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