高通量使用自动染色体的物理图谱原位杂交

摘要

基于大规模并行 DNA 测序技术的基因组组装通常是高度片段化的。物理染色体图谱的开发可能会改善基因组组装。在这里，我们展示了染色体制备、荧光原位杂交和成像的创新方法，这些方法显着提高了物理图谱开发的通量。

摘要

预计在未来 5 年内将进行 10,000 种脊椎动物物种¹ 和 5,000 种昆虫和相关节肢动物物种² 的全基因组序列项目。例如，目前正在使用 Illumina 平台对 15 种疟疾蚊子的基因组进行测序^3,4。该按蚊物种集群包括疟疾的媒介和非媒介。当基因组组装可用时，研究人员将有独特的机会进行比较分析，以推断与载体能力相关的进化变化。然而，事实证明，使用下一代测序读长来生成高质量的从头基因组组装是困难的⁵。此外，冈比亚按蚊的现有基因组组装虽然使用 Sanger 方法获得，但存在间隙或碎片化^4,6。

如果研究人员处理的是大量的测序重叠群，而不是基于染色体的基因组组装，那么比较基因组分析的成功将受到限制。片段化、未映射的序列会给基因组分析带来问题，因为：（i） 未识别的差距会导致基因组序列的注释不正确或不完整;（ii） 未定位的序列导致旁系同源基因和来自不同单倍型的基因之间的混淆;（iii） 测序重叠群缺乏染色体分配和方向，不允许重建重排系统发育和研究染色体进化。为具有新测序基因组的物种开发高分辨率物理图谱是一项及时且具有成本效益的投资，将有助于基因组注释、进化分析和对自然种群个体基因组的重新测序^7,8。

在这里，我们介绍了染色体制备、荧光原位杂交 （FISH） 和成像的创新方法，这些方法有助于快速开发物理图谱。以冈比亚安人为例，我们证明了物理染色体图谱的开发可以潜在地改善基因组组装，从而提高基因组分析的质量。首先，我们使用高压方法制备多线染色体扩散。这种方法最初是为果蝇⁹ 开发的，与常规的挤压技术¹⁰ 相比，用户可以可视化染色体的更多细节。其次，使用 FISH 的全自动前端系统进行高通量物理基因组图谱。自动玻片染色系统可同时运行多个检测，并显著缩短手动作时间¹¹。第三，自动荧光成像系统，包括一个电动载玻片台，在 FISH¹² 之后自动扫描和拍摄标记的染色体。该系统对于识别和可视化同一载玻片上的多个染色体板特别有用。此外，扫描过程捕获的 FISH 结果更加统一。总体而言，自动化高通量物理映射协议比标准手动协议更高效。

方案

1. 卵巢护士细胞的高压多线染色体制备

在
1. 解剖显微镜下采血后 25 小时解剖半妊娠按蚊雌性，并在含有甲醇（100% 甲醇：冰醋酸，3：1）的新鲜改性 Carnoy 溶液中固定卵巢。在这个阶段，卵巢处于克里斯托弗 III 发育阶段，此时卵泡呈椭圆形，卵泡内带有护士细胞的透明区域呈圆形¹³。将大约 5 名女性的卵巢放入 1.5 ml Eppendorf 管中的 500 μl 改良 Carnoy 溶液中，并在室温下保持 24 小时。将卵巢转移至 -20 °C 进行长期储存。
2. 在制作载玻片之前，用乙醇（100% 乙醇：冰醋酸，3：1）和 50% 丙酸制备改良的 Carnoy 溶液。将一对卵巢放在无尘载玻片上，加入一滴改良的 Carnoy 溶液。用解剖针将卵巢分成大约 6 个部分，并在解剖 MZ6 Leica 立体显微镜下将它们放入 50% 丙酸滴在干净的载玻片上。为每个部分使用单独的幻灯片。
3. 用针头分离毛囊解剖，并在解剖显微镜下用滤纸或纸巾擦去剩余的组织。向毛囊中加入一滴新的 50% 丙酸，让它们在室温下静置 3-5 分钟。将盖玻片放在 50% 丙酸液滴的顶部。让载玻片静置约 1 分钟。
4. 用滤纸和塑料包裹载玻片。使用带有 Flex-Shaft 附件和软塑料尖端的 Dremel 200 旋转工具，设置为 3000-5000 RPM，通过将尖端旋转成圈并轻轻按压盖玻片以均匀分布细胞核来挤出卵泡。此步骤大约需要 1 分钟。使用奥林巴斯 CX41 相位显微镜和 20 倍物镜检查传播质量。
5. 通过在覆盖染色体的盖玻片旁边放置一个额外的盖玻片来准备一个三明治，然后用第二个显微镜载玻片覆盖它们。这减少了在虎钳中压碎滑块的机会。用载玻片容器中的塑料片和滤纸包裹载玻片，以固定三明治并防止载玻片因虎钳而划伤。
6. 通过机械虎钳对载玻片施加压力。85-120 英寸磅的压力就足够了，通过使用扭矩扳手来实现。此步骤对于尽可能使染色体变平是必要的。
7. 取出第二张显微镜载玻片和额外的盖玻片。在玻片变性/杂交系统上将载玻片加热至 55 °C，盖玻片覆盖染色体 10-15 分钟，以进一步使染色体变平。将玻片浸入液氮中至少 15 秒，当鼓泡停止时，继续用剃须刀片快速取下盖玻片。立即将玻片置于 50% 乙醇冷溶液中 5 分钟。将玻片在 70%、90%、100% 乙醇中脱水，每次 5 分钟。风干玻片。

2. 使用自动玻片染色系统的 FISH

程序与 Xmatrx 自动玻片染色系统一起设置，以运行以下步骤，探针标记除外。详细的切口平移标记方案在 Fermentas 的 DNA 聚合酶随附的文档中进行了描述。

1. 在 FISH 之前，通过使用缺口平移方案用荧光染料标记基因组 BAC DNA 来制备荧光探针。将 1 μg DNA、未标记的 dATP、dCTP 和 dGTP 各 0.05 mM 和 0.015 mM dTTP、1 μl Cy3 或 Cy5-dUTP、0.05 mg/ml BSA、5 μl 10x 缺口翻译缓冲液、20 单位的 DNA 聚合酶 I、0.0012 单位的 DNase I 和无核酸酶水混合至 25 μl。根据经验选择 DNA 聚合酶 I/DNase I 比率，以获得大小范围为 300 至 500 bp 的探针。将混合物在 15 °C 下孵育 1 小时。
2. 将载玻片和试剂放入 Xmatrx 自动载玻片染色系统中，然后启动程序以运行以下步骤。应用 800 μl 1x PBS 20 分钟。用空气吹滑片。通过在 1x PBS 中应用 450 μl 4% 福尔马林 1 分钟，然后用 100% 乙醇洗涤 1 秒，两次，一次 2 分钟，进行福尔马林固定。用空气吹滑片。
3. 在 45 °C 下加热载玻片 2 分钟，以避免在应用探针时起泡。应用 20 μl DNA 探针，加入矿物油滴以避免杂交溶液蒸发，并在顶部放置盖玻片。通过在 90 °C 下加热载玻片 10 分钟使染色体和 DNA 探针变性。
4. 对于杂交，戴上盖玻片，在 42 °C 下孵育玻片 14 小时。杂交溶液由 2x SSC、100 mM 磷酸钠、1x Denhardt 溶液、100 μg/ml 叠氮化钠和 10% 葡聚糖硫酸盐的甲酰胺组成。
5. 对于严格洗涤，在 42 °C 下加热载玻片 2 分钟，取下盖玻片，在 2x SSC 中洗涤载玻片 1 秒 4 次。用空气吹滑片。在 42 °C 下应用 800 μl 0.4x SSC，持续 10 分钟 2 次。在 25 °C 下用 2x SSC 洗涤载玻片 10 分钟。
6. 通过在 1x PBS 中应用 50 μl 1 μM YOYO-1 进行染色体染色。滴入矿物油以避免染色溶液蒸发，盖上盖玻片，并在 25 °C 下孵育 10 分钟。取下盖玻片，在 2x SSC 中洗涤玻片 1 秒 4 次。用空气吹滑片。应用 15 μl ProLong Gold 抗淬灭试剂。盖上盖玻片。

3. 使用自动荧光成像系统进行玻片读取

本节详细介绍了 Duet 软件的使用，该软件是 ACCORD PLUS 自动扫描系统的标准配置。按以下顺序打开后，说明开始：用于卤素灯泡的奥林巴斯 U-RFL-T 电源、计算机 Dell precision T3500、显微镜奥林巴斯 BX61 与连接的相机奥林巴斯 U-CMAD3。

1. 要设置 10 倍扫描前，请在 ACCORD PLUS 自动扫描系统中打开 Duet 软件。点击"在线"按钮。输入新的案例 ID 并分配一个幻灯片 ID。单击标有"BF"的点。这是 brightfield 选项。将扫描选项设置为 "10x Prescan"。使用 "2500x circle"、"10000x circle" 或 "rectangle"。单击"设置并运行"进行 10 倍预扫描。
2. 单击"确定"按钮运行 10 倍预扫描。按照提示正确调整扫描。单击"完成"开始扫描。按"Main"（主）选项卡返回主屏幕。点击"离线"按钮。找到分配的案例 ID 和幻灯片 ID，然后单击"离线扫描"。在左上角区域的黑框中，单击箭头并选择"10x Prescan"。使用箭头（< ||Δ >又名"后退"、"暂停"、"播放"、"前进"按钮），浏览扫描的图像。
3. 找到感兴趣的图像后，双击目标区域中间的屏幕，然后按 "Snap"。这将以图像为目标，以便稍后捕获。选择所有目标后，点击"分类"。选择"10x Prescan"。右键单击图像并有机会对图像进行分类。选择 "Polytene"。
4. 在 Duet 软件中设置 40 倍预扫描。点击 "Main" 返回主菜单。再次选择 "Online"（在线）。选择一张幻灯片。将 "BF" 改为 "FL"。将任务名称更改为 "Revisit-X40-RG"。将最后一个设置正下方的部分更改为 "Revisit-ALL"。点击 "Set&Run"。按"确定"。再次按照提示设置自动化。单击"开始匹配视图"按钮以匹配 10 倍和 40 倍图像。单击"完成"开始扫描。完成后，单击 "Classify" 并查看图像。

4. 代表性结果

图 1 以图形方式描述了高压染色体制备的方案。此步骤涉及使用 Dremel 工具和机械虎钳压扁和压平染色体的过程，以及使用相差显微镜进行染色体可视化的过程。图 2 说明了使用自动载玻片染色系统将荧光标记探针与染色体载玻片制备物上的靶 DNA 杂交，在 FISH 实验后使用自动扫描显微镜对探针进行可视化和映射，以及在染色体上放置和定位基因组支架。

使用高压技术制备冈比亚稔雌性卵巢护士细胞多线染色体。这种方法不会损坏或改变大部分染色体结构（图 3）。它使弯曲的染色体变平，从而露出在常规制备中看不到的隐藏细条带（图 4）。

该方案中使用的探针是从冈比亚安菌 PEST 菌株 DNA 生成的 ND-TAM BAC 文库获得的基因组 BAC DNA 克隆。该文库的基因组 DNA 是从新孵化的两性第一龄幼虫中提取的。图 5 显示了使用与冈比亚安多线染色体杂交的 BAC 克隆的 FISH 结果。该程序使用 Xmatrx 自动玻片染色系统进行。使用冈比亚安¹⁰ 的细胞遗传学光图，两个 BAC 克隆 102B24 （GenBank： BH372701， BH372694） 和 BAC 142O19 （GenBank： BH368703， BH368698） 分别定位在 2R 臂的 16C 和 16D 细分中。然而，针对冈比亚安 PEST 菌株 AgamP3 组装体 ¹⁴ 的 BLAST 搜索分别在 2R 臂的 16B 和 17A 细分中鉴定了与 102B24 和 142O19 同源的序列（表 1）。因此，现在可以根据我们的作图数据调整基因组坐标和细胞遗传学细分之间的对应关系。对冈比亚人工 M 型和 S 型基因组组装的 BLAST 搜索发现，两个 BAC 克隆位于不同的重叠群中，但位于每种形式内的相同支架中（表 1）。鉴定出的重叠群现在可以与特定的染色体位置相关联。此外，鉴定出的支架现在可以在细胞学细分 16CD 内正确定向。有趣的是，在 PEST 菌株、M 型和 S 型基因组组装中，支架中 102B24 和 142O19 序列之间的距离分别为 1,892,981 bp、1,658,391 bp 和 1,688,426 bp。因为 PEST 菌株是 M 和 S 形式的杂交体，所以这种差异可能是由于 PEST 基因组的错误组装造成的。

<表 border="1"> BAC
（加入） PEST-菌株
AgamP3

坐标 M 型
contigs

坐标 M 型
脚手架

坐标 S-form
contigs

坐标 S-form
脚手架

坐标 102B24
（BH372694） 2R：AAAB0100
8844_26 （16B）

43,681,342-
43,681,874 ABKP020247
53.1

32,513-
33,045 EQ090167.1

1,858,377-
1,858,909 元 ABKQ010123
32.1

4,299-
4,832 EQ099711.1

215,891-
216,424 元 102B24
（BH372701） 2R：AAAB0100
8844_28 （16B）

43,788,213-
43,788,969 ABKP020247
51.1

24,816-
25,575 元 EQ090167.1，

1,772,683-
1,773,442 元 ABKQ010123
35.1

27,782-
28,540 元 EQ099711.1，

305,514-
306,272 元 142O19
（BH368698） 2R：AAAB0100

8805_5 （17A）
45,428,580-
45,429,264 ABKP020247
01.1

2,499-
3,185 EQ090167.1

315,806-
316,492 ABKQ010123
76.1

49,242-
49,942 EQ099711.1

1,791,625-
1,792,325 元 142O19
（BH368703） 2R：AAAB0100
8805_8 （17A）

45,560,099-
45,574,323 ABKP020220
17.1

30,971-
32,469 EQ090167.1
200,518-
202,016 ABKQ010123
79.1

27,760-
28,508 元 EQ099711.1

1,903,569-
1,904,317 元

表 1. 针对冈比亚安基因组组装的 BAC 末端序列的 BLAST 结果。

图 1. 高压染色体制备的示意图。蚊子卵巢显示在正确的发育阶段。

图 2. 代表基因组支架的自动 FISH、玻片扫描和染色体图谱的方案。

图 3. 使用高压技术获得的冈比亚 An. 3 多线染色体的扩展。3L 和 3R 在端粒处标记左臂和右臂。PH 和 IH 分别表示着丝粒周围和闰间异染色质。

图 4. 使用传统（上）和高压（下）技术制备的冈比亚安多线染色体的比较。这些图像涵盖了机械臂 3R （A） 的 29A-30E 和机械臂 3L （B） 的 43D-46D 细分。

图 5. BAC 克隆的 FISH 到 An. gambiae 的多线染色体。A） 102B24（红色信号）与 2R 臂杂交。B） 102B24（红色信号）和 142O19（蓝色信号）的双色 FISH 分别到拉伸的 2R 臂的细分 16C 和 16D。箭头表示用 Cy3（红色）和 Cy5（蓝色）标记的 BAC 克隆的杂交信号。C-着丝粒区。a/+ 显示杂合子 2La 倒置。染色体用荧光团 YOYO-1 复染。

讨论

高压程序最关键的步骤是在卵巢发育的克里斯托弗斯 III 期分离的卵巢护士细胞^{13 进行}适当压碎。压扁不当会导致染色体扩散不足，这可能会在 FISH 后尝试确定探针位置时出现问题。如果染色体被过度压扁，它们可能会被折断或拉长，以至于条带图案丢失。当尝试使用 Dremel 工具压扁载玻片时，多张载玻片的生产应保持一致性，这将提高整体载玻片生产效率。高压技术最初是针对新鲜分离的 D. melanogaster⁹ 唾液腺开发的。然而，蚊子的卵巢在用于染色体制剂之前通常保存在改性卡诺伊固定溶液（3 甲醇：1 杯冰醋酸）中。因此，我们修改了现有的高压方案，使其适用于疟疾蚊子冈 比亚的固定卵巢护士细胞多线染色体。由于使用具有整个载玻片高度平行工作表面的精密虎钳施加高压，因此与使用传统的铅笔橡皮擦敲击技术相比，准备染色体南瓜所需的时间要少得多。

其他重要步骤包括将毛囊充分浸泡在 50% 丙酸中并加热载玻片。这两个步骤对于帮助扁平染色体至关重要。如果忽视它们，染色体在脱水后会显得有光泽，这可能会导致背景过多，可能被误认为是 FISH 中的信号。在制作有丝分裂染色体制剂时，使用相同的溶液，高压压扁技术也效果很好。额外的扩散和扁平有助于更好地表达其细胞核中的染色体。添加相等的压力应相应地使它们变平，以便进行测量，并可能提高染色可见条带的分辨率。关于从蚊子中分离有丝分裂染色体的详细信息在其他地方给出¹⁵.尽管常规南瓜制剂足以满足许多用途，包括 FISH ¹⁶ 和免疫染色¹⁷，但高压方法不仅降低了一张载玻片到另一张载玻片的潜在方差，而且还提高了染色体的整体质量，从而在绘制染色体图时获得更高的细节。该程序还可用于制备用于激光捕获显微切割的多线染色体膜载玻片。

高压方法的局限性包括载玻片断裂和染色体过度拉伸。通过虎钳对滑块施加过大的压力可能会导致滑块破损，但使用本文中指定的压力会受到限制。对于染色体过度拉伸，如果将 Dremel 工具长时间应用于载玻片，染色体可能会变得过于拉伸并失去分辨率。这可以通过短时间使用该工具，在显微镜下检查，如果染色体扩散不足，则使用 Dremel 工具使用更多时间来解决。

传统的FISH方案包括许多洗涤和孵育步骤，这些步骤通常长5-20分钟，需要研究人员在整个实验过程中几乎全神贯注。此外，在给定实验中，可以手动处理的载玻片数量通常仅限于几张载玻片。相比之下，自动载玻片染色系统自动执行所有步骤（包括洗涤、孵育、探针应用、变性、杂交、盖玻片应用和去除）。这为FISH实验中的研究人员节省了长达6-8个工作小时。此外，自动化 FISH 系统可以显着提高吞吐量。例如，Xmatrx 系统能够同时处理单张制备载玻片上的多达 40 个检测，在双制备载玻片上处理多达 80 个检测。该系统的局限性之一是它对于少量 FISH 实验效率不高，因为它需要制备大量溶液。此外，系统中编程的 FISH 协议可能需要针对新应用进行修改和调整。

载玻片扫描系统是荧光显微镜的自动化版本。自动载物台移动和简单的显微镜控制面板为研究人员节省了时间，使显微镜的作变得极其简单。例如，ACCORD PLUS扫描系统中的软件可以轻松捕获多个荧光通道，并易于管理图像采集。这方面的一个例子是包含 z 堆栈捕获，而不是拍摄单个图像;该软件捕获可配置的图像 Z 堆栈，以确保至少一个图像保持对焦。尽管该系统更多地用于多图像采集（单张载玻片上的大量细胞），但它仍然使在载玻片上查找染色体比手动浏览载玻片要容易得多。

自动载玻片染色系统和扫描系统都常规用于细胞遗传学诊所对人体细胞染色体异常的 FISH 诊断。在这项研究中，我们开发了一种协议，利用这些自动化系统进行基础研究应用。自动化高通量物理图谱协议可以促进任何感兴趣物种的物理染色体图谱的快速开发。虽然在本报告中，我们使用多线染色体进行物理定位，但有丝分裂染色体也可以与这些系统一起使用。将该方案调整为有丝分裂染色体将是有用的，因为大多数生物体不会发育出可读的多线染色体。然而，多边染色体（如果可用）可以提供有关功能基因组结构域与染色体结构以最高分辨率对应关系的有用信息。多线染色体的组织原理，例如带和带间的模式，最近被比作规则的非多线（间期）染色体¹⁸。因此，对高压染色体制备物进行的详细物理定位有可能将DNA序列与特定的染色体结构联系起来，例如条带、带间、粉扑、着丝粒、端粒和异染色质;因此，创建基于染色体的基因组组装。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
22x22 mm 显微镜盖玻片	Fisher	12-544-10
18x18 mm 显微镜盖玻片	Fisher	12-553-402
乙酸	Fisher	A491-212
甲醇	Fisher	A412-4
丙酸	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 带软轴的旋转工具附件	Rand		3" 多用途迷你台式研磨机（带限速器）
特别设计的 200 μl 用于 Dremel 工具的塑料尖端（串珠塑料边缘）	Pipetman	F171300	切割和加热吸管尖端的脂肪末端
锡涂层快速虎钳	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	精密研磨的方形和平行于 0.00025 以内
扭矩扳手	Craftsman	44593
ThermoBrite 载玻片变性/杂交系统	Abbott Molecular	30-144110
25 mm 阻隔玻片	Abbott Molecular	XT108-SL
25 mm 盖玻片	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx 自动玻片染色系统	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 徕卡体视显微镜	Leica	VA-OM-E194-354	可以使用不同的体视显微镜
奥林巴斯 CX41 相位显微镜	奥林巴斯	CX41RF-5	可以使用不同相位显微镜
ACCORD PLUS 自动扫描系统	BioView （美国）	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF（中性缓冲福尔马林）	Sigma-Aldrich	HT501128
99% 甲酰胺	Fisher Scientific	BP227500
葡聚糖硫酸钠盐	Sigma	D8906
20x SSC 缓冲液	Invitrogen	AM9765
磷酸钠	Sigma-Aldrich	S3264
50x Denhardt 溶液	Sigma-Aldrich	D2532
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 碘化物 （491/509） 溶液，溶于 DMSO	Invitrogen	Y3601	中
ProLong Gold 抗淬灭试剂	Invitrogen	P36930
dATP、dCTP、dGTP、dTTP	发酵	R0141、R0151、R0161、R0171
Cy3-dUTP、Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022、PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA 聚合酶 I	发酵	EP0041
DNase I	发酵	编号 EN0521