基于大规模并行DNA测序技术的基因组组装通常具有高度片段化的特点。物理染色体图谱的构建有望改善基因组组装的质量。本文中，我们展示了染色体制备、荧光原位杂交以及成像方面的创新方法，可显著提高物理图谱构建的通量。
本文内容
摘要
摘要
在未来5年内，预计将开展获取10,000种脊椎动物1以及5,000种昆虫及相关节肢动物2全基因组序列的项目。例如，目前正利用Illumina测序平台对15种疟蚊物种的基因组进行测序3,4。该按蚊属（Anopheles）物种群包含疟疾传播媒介和非传播媒介物种。当这些基因组组装完成后，研究人员将拥有独特的机会，能够通过比较分析推断与传播能力相关的进化变化。然而，实践证明，利用新一代测序读长生成高质量的从头（de novo）基因组组装仍然存在困难5。此外，现有的冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）基因组组装尽管采用Sanger法获得，但仍存在缺口或片段化问题4,6。
如果研究人员处理的是大量测序片段（contigs），而不是基于染色体的基因组组装结果，比较基因组分析的成功将受到限制。片段化且未定位的序列会给基因组分析带来以下问题：（i）未识别的缺口会导致基因组序列注释错误或不完整；（ii）未定位的序列容易引起旁系同源基因与不同单倍型基因之间的混淆；（iii）测序片段缺乏染色体归属和方向信息，无法重建重排系统发育关系，也无法研究染色体的演化过程。对于新测序基因组的物种而言，构建高分辨率的物理图谱是一项及时且具有成本效益的投资，将有助于基因组注释、进化分析，以及对自然群体中个体基因组的重测序7,8。
本文介绍了染色体制备、荧光原位杂交及高分辨率成像的创新方法 原位 杂交（FISH）和成像技术，可促进物理图谱的快速构建。利用 An. gambiae 以一个实例为例，我们演示了物理染色体图谱的构建有望改进基因组组装，从而提升基因组分析的质量。首先，我们采用一种高压法制备多线染色体展片。该方法最初是为 黑腹果蝇9，使用户能够比常规压片技术观察到染色体的更多细节10其次，采用一种全自动的FISH前端系统进行高通量物理基因组作图。该自动化玻片染色系统可同时运行多个检测，显著减少人工操作时间。11第三，使用包含电动载物台的自动荧光成像系统，对FISH标记的染色体进行自动扫描和拍照12该系统特别适用于在同一张载玻片上识别和可视化多个染色体板。此外，扫描过程能够获得更均匀的荧光原位杂交（FISH）结果。总体而言，自动化高通量物理作图方案比传统的手工操作方案更高效。
方案
1. 从卵巢滋养细胞制备高压多线染色体
- 在吸血后25小时，于解剖显微镜下解剖半饱血的雌性按蚊（Anopheles），并将卵巢固定于新鲜的改良卡诺氏液中（甲醇:冰醋酸 = 3:1，v/v）。此阶段卵巢处于Christophers III期，卵泡呈椭圆形，卵泡内滋养细胞区域呈圆形13。将约五只雌蚊的卵巢放入1.5 ml离心管中，加入500 μl改良卡诺氏液，室温下保存24小时。随后转移至-20 °C长期保存。
- 制片前即刻配制含乙醇的改良卡诺氏液（乙醇:冰醋酸 = 3:1，v/v）和50%丙酸。取一对卵巢置于无尘载玻片上的一滴改良卡诺氏液中，用解剖针将其分割为约6个部分，并分别转移至洁净载玻片上的50%丙酸液滴中，在Leica MZ6体视显微镜下操作。每个部分使用单独的载玻片。
- 在解剖显微镜下用解剖针分离卵泡，并用滤纸或纸巾擦去残留组织。向卵泡中加入一滴新的50%丙酸，室温下静置3–5分钟。将盖玻片覆盖在50%丙酸液滴上，静置约1分钟。
- 用滤纸和塑料膜包裹载玻片。使用Dremel 200旋转工具，配备柔性轴和软质塑料头，调节转速至3000–5000 RPM，通过旋转轻压盖玻片，使卵泡内容物均匀分散，持续约1分钟。使用Olympus CX41相差显微镜配合20倍物镜检查染色体铺展质量。
- 将另一张盖玻片放置在覆盖染色体的盖玻片旁，再覆盖第二张载玻片，形成“三明治”结构。此结构可降低在压片过程中载玻片被压碎的风险。使用玻璃载玻片盒中附带的塑料膜和滤纸包裹该“三明治”结构，以固定整体并防止压片时刮伤载玻片。
- 使用机械压片机对载玻片施加压力，85–120 英寸·磅（inch-lbs）的压力即可，可通过扭矩扳手精确控制。该步骤对于最大限度地压平染色体至关重要。
- 移除第二张载玻片和额外的盖玻片。将覆盖有盖玻片的载玻片置于载玻片变性/杂交系统中，在55 °C下加热10–15分钟，以进一步压平染色体。随后将载玻片浸入液氮中至少15秒，待气泡停止后，立即用刀片快速移除盖玻片。立即将载玻片放入冷的50%乙醇中固定5分钟，再依次在70%、90%、100%乙醇中各脱水5分钟，最后空气干燥。
2. 使用自动化玻片染色系统进行FISH
使用Xmatrx全自动切片染色系统设置程序，执行以下步骤（探针标记除外）。详细的缺口平移标记方案见Fermentas公司提供的DNA聚合酶产品说明书。
- 在进行FISH之前，通过缺口平移法将基因组BAC DNA用荧光染料标记以制备荧光探针。在25 μl体系中混合1 μg DNA、0.05 mM的未标记dATP、dCTP和dGTP、0.015 mM dTTP、1 μl Cy3-或Cy5-dUTP、0.05 mg/ml BSA、5 μl 10x缺口平移缓冲液、20单位DNA聚合酶I、0.0012单位DNase I以及无核酸酶水。DNA聚合酶I与DNase I的比例根据经验选择，以获得大小在300至500 bp范围内的探针。在15 °C下孵育混合物1小时。
- 将载玻片和试剂放入Xmatrx全自动染色仪中，并启动程序以执行以下步骤：加入800 μl 1x PBS，作用20分钟；用空气吹干载玻片；通过加入450 μl含4%甲醛的1x PBS固定1分钟，随后用100%乙醇洗涤两次（每次1秒）和一次2分钟；再用空气吹干载玻片。
- 将载玻片在45 °C加热2分钟，以防止加样时产生气泡。加入20 μl DNA探针，滴加矿物油以防止杂交溶液蒸发，然后盖上盖玻片。将载玻片在90 °C加热10分钟，以变性染色体和DNA探针。
- 进行杂交时，将载玻片在42 °C孵育14小时，期间保持盖玻片覆盖。杂交液组成为：2x SSC、100 mM磷酸钠、1x Denhardt溶液、100 μg/ml叠氮化钠以及含10%硫酸葡聚糖的甲酰胺溶液。
- 进行严谨性洗涤时，先将载玻片在42 °C加热2分钟，移除盖玻片，然后在2x SSC中洗涤4次，每次1秒；用空气吹干载玻片；在42 °C下用800 μl 0.4x SSC洗涤两次，每次10分钟；最后在25 °C下用2x SSC洗涤10分钟。
- 通过加入50 μl含1 μM YOYO-1的1x PBS对染色体进行染色。滴加矿物油防止染色液蒸发，盖上盖玻片，在25 °C孵育10分钟。移除盖玻片，在2x SSC中洗涤4次，每次1秒；用空气吹干载玻片；加入15 μl ProLong Gold抗荧光淬灭试剂，盖上盖玻片。
3. 使用自动荧光成像系统读取载玻片
本部分详细介绍了 ACCORD PLUS 全自动扫描系统标配的 Duet 软件的使用方法。操作步骤按以下顺序开机后开始：先打开用于卤素灯的 Olympus U-RFL-T 电源，接着开启 Dell Precision T3500 计算机，然后启动连接了 Olympus U-CMAD3 相机的 Olympus BX61 显微镜。
- 设置10倍预扫描时，在ACCORD PLUS自动扫描系统的Duet软件中点击“Online”按钮。输入新的病例编号（Case ID）并分配一个切片编号（Slide ID）。点击标有“BF”的圆点，此为明场选项。将扫描选项设置为“10x Prescan”，并选择“2500x circle”、“10000x circle”或“rectangle”。点击“Set&run”以启动10倍预扫描。
- 点击“OK”按钮开始执行10倍预扫描。根据提示正确调整扫描参数。点击“Finish”以开始扫描。按下“Main”标签返回主界面，然后点击“Offline”按钮。找到之前分配的病例编号和切片编号，点击“Offline Scan”。在左上角的黑色框区域中点击箭头，并选择“10x Prescan”。使用箭头按钮（< || Δ >，即“后退”、“暂停”、“播放”、“前进”）浏览已扫描的图像。
- 找到感兴趣的图像后，双击目标区域中心位置，然后按“Snap”按钮，以标记该图像供后续捕获。完成所有目标区域的选择后，点击“Classify”，选择“10x Prescan”。右键点击图像，对图像进行分类，并选择“Polytene”类别。
- 在Duet软件中设置40倍预扫描。点击“Main”返回主菜单，再次选择“Online”，并选择相应的切片。将“BF”更改为“FL”，将任务名称更改为“Revisit-X40-RG”，并将紧随其下的设置项更改为“Revisit-ALL”。点击“Set&Run”，然后按“OK”。根据提示再次设置自动化流程。点击“Start matching views”按钮，以匹配10倍与40倍的图像。点击“Finish”开始扫描。扫描完成后，点击“Classify”并查看图像。
4. 代表性结果
图1以图示方式展示了高压染色体制备的方案。该步骤包括使用Dremel工具和机械台钳对染色体进行压片和平展处理，以及利用相差显微镜观察染色体。图2展示了使用自动玻片染色系统将荧光标记的探针与染色体玻片上的靶DNA进行杂交，通过自动扫描显微镜在FISH实验后对探针进行可视化和定位，以及将基因组支架序列在染色体上进行定位和方向排列。
采用高压技术制备了雌性An. gambiae的卵巢滋养细胞多线染色体。该方法不会破坏或改变染色体结构的大部分区域（图3）。它能够展平弯曲的染色体，从而揭示常规制片中无法观察到的隐匿性细微带纹（图4）。
本方案中使用的探针为来源于ND-TAM BAC文库的基因组BAC DNA克隆，该文库由 An. gambiae PEST品系DNA。该文库的基因组DNA提取自新孵化的雌雄一龄幼虫。 图5 显示了使用BAC克隆与多线染色体杂交的FISH结果 An. gambiae 该操作使用 Xmatrx 自动化切片染色系统进行。利用细胞遗传学光图谱进行 An. gambiae10两个BAC克隆，102B24（GenBank: BH372701, BH372694）和BAC 142O19（GenBank: BH368703, BH368698），分别定位于2R臂的16C和16D区段。然而，针对该序列的BLAST比对结果显示 An. gambiae PEST品系AgamP3基因组组装 14 分别在2R臂的16B和17A区段中鉴定了与102B24和142O19同源的序列（表1）。因此，可根据我们的定位数据调整基因组坐标与细胞遗传学区段之间的对应关系。针对该序列的BLAST搜索 An. gambiae M型和S型基因组组装结果显示，这两个BAC克隆位于不同的重叠群中，但在每种类型内的同一支架上（表1）。现已可将鉴定出的重叠群与特定染色体位置相关联。此外，鉴定出的支架现在可在细胞学区段16CD内进行正确的定向。有趣的是，102B24与142O19序列在支架中的距离在PEST品系、M型和S型基因组组装中分别为1,892,981 bp、1,658,391 bp和1,688,426 bp。由于PEST品系是M型和S型的杂交体，这种差异可能是由PEST基因组组装错误所致。
| BAC (登录号) | PEST品系 AgamP3 坐标 | M型 重叠群 坐标 | M型 支架序列 坐标 | S型 重叠群 坐标 | S型 支架序列 坐标 |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874 | ABKP020247 53.1 32,513- 33,045 | EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909 | ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832 | EQ099711.1 215,891- 216,424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969 | ABKP020247 51.1 24,816- 25,575 | EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442 | ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540 | EQ099711.1, 305,514- 306,272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264 | ABKP020247 01.1 2,499- 3,185 | EQ090167.1 315,806- 316,492 | ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942 | EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323 | ABKP020220 17.1 30,971- 32,469 | EQ090167.1 200,518- 202,016 | ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508 | EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317 |
表1. BAC末端序列与An. gambiae基因组组装序列的BLAST比对结果。
图1. 高压染色体制备的示意图。图中显示了处于正确发育阶段的蚊子卵巢。
图 2. 自动化FISH、载玻片扫描及基因组支架染色体定位的示意图。
图 3. 采用高压技术获得的An. gambiae多线染色体3的展片。3L和3R在其端粒处标记左臂和右臂。PH和IH分别表示着丝粒周围异染色质和中间异染色质。
图4. 使用传统方法（上方）和高压法（下方）制备的An. gambiae多线染色体的比较。图像涵盖3R臂的29A-30E区段（A）和3L臂的43D-46D区段（B）。
图 5. BAC 克隆在冈比亚按蚊（An. gambiae）多线染色体上的荧光原位杂交（FISH）。A) 102B24（红色信号）与 2R 染色体臂的杂交。B) 102B24（红色信号）和 142O19（蓝色信号）的双色 FISH，分别与拉伸后的 2R 染色体臂的 16C 和 16D 区域杂交。箭头指示用 Cy3（红色）和 Cy5（蓝色）标记的 BAC 克隆杂交信号。C 表示着丝粒区域。a/+ 表示 2La 倒位的杂合子。染色体用荧光染料 YOYO-1 进行反染。
讨论
高压处理过程中最关键的步骤是对处于Christophers' III期卵巢发育阶段的卵泡滋养细胞进行适当的压片13。压片不当会导致染色体展开不充分，从而在FISH后难以确定探针的位置。若压片过度，染色体可能发生断裂或过度拉伸，导致带型模式丢失。通过制备多张玻片，可逐步提高使用Dremel工具进行压片操作的一致性，从而提升整体玻片制备效率。高压技术最初是为新分离的黑腹果蝇（D. melanogaster）唾液腺而开发的9。然而，蚊子的卵巢通常在使用前会保存于改良的卡诺固定液（甲醇:冰醋酸体积比为3:1）中。因此，我们对现有的高压方案进行了改进，使其适用于疟蚊冈比亚按蚊（An. gambiae）固定后的卵泡滋养细胞多线染色体。由于高压是通过一个具有高度平行工作面的精密台钳在整个玻片上施加的，因此与使用铅笔橡皮头进行传统轻敲法相比，制备染色体压片所需时间显著减少。
其他重要步骤包括将卵泡充分浸泡在50%丙酸中，并对载玻片进行加热。这两个步骤对于帮助染色体展平至关重要。如果忽略这些步骤，脱水后染色体可能呈现光泽，从而导致背景信号过强，可能被误认为是FISH中的真实信号。高压压片技术在制备有丝分裂染色体时，使用相同的溶液也具有良好效果。额外的扩散和展平有助于更充分地将染色体从细胞核中释放出来。施加均匀压力可相应地使染色体展平，便于进行测量，并可能提高染色后可见染色带的分辨率。有关从蚊子中分离有丝分裂染色体的详细方法已在其他文献中描述15。尽管常规压片制备法已能满足许多应用需求，如FISH16和免疫染色17，但高压法不仅能降低不同载玻片之间的潜在差异，还能整体提升染色体质量，从而在染色体定位分析中获得更高细节。该方法也可用于制备多线染色体膜片，以进行激光捕获显微切割。
高压法的局限性包括载玻片破裂和染色体过度拉伸。通过虎钳对载玻片施加过大的压力可能导致载玻片破裂，但采用本文所述的压力值可将此风险降至最低。对于染色体过度拉伸的情况，若使用Dremel工具处理载玻片的时间过长，可能导致染色体过度伸展而降低分辨率。可通过短暂使用Dremel工具处理、在显微镜下检查染色体铺展情况，并在染色体铺展不足时追加处理时间来加以纠正。
传统的FISH实验方案包含多个洗涤和孵育步骤，每个步骤通常持续5-20分钟，在整个实验过程中几乎需要研究人员全程专注操作。此外，手动处理的载玻片数量通常受限，单次实验一般只能处理几张载玻片。相比之下，自动化载玻片染色系统可自动完成所有步骤（包括洗涤、孵育、探针添加、变性、杂交、盖玻片的加样与移除）。这可为研究人员在一次FISH实验中节省多达6-8小时的工作时间。此外，自动化FISH系统可显著提高检测通量。例如，Xmatrx系统可同时处理单张制备载玻片上的多达40个检测，或双制备载玻片上的多达80个检测。该系统的一个局限性在于，对于少量FISH实验而言效率不高，因其需要配制大量试剂溶液。此外，系统中预设的FISH实验程序在应用于新项目时，可能需要进行修改和优化。
载玻片扫描系统是一种自动化的荧光显微镜。通过自动移动载物台和简化的显微镜控制面板，研究人员可以节省大量时间，使显微镜的操作变得极为简便。例如，ACCORD PLUS 扫描系统的软件支持轻松捕获多个荧光通道，并实现便捷的图像采集管理。其中一个实例是具备 z 轴层扫（z-stack）成像功能：系统并非仅采集单张图像，而是可配置地采集一组 z 轴方向的图像序列，以确保至少有一张图像处于焦点范围内。尽管该系统主要针对多图像采集设计（即单张载玻片上含有大量细胞），但它仍然显著简化了在载玻片上寻找染色体的过程，相比手动浏览载玻片具有明显优势。
自动载玻片染色系统和扫描系统在细胞遗传学临床中常规用于人类细胞染色体异常的FISH诊断。在本研究中，我们开发了一种利用这些自动化系统进行基础科学研究的实验方案。这种自动化的高通量物理定位方案可促进针对任何目标物种的染色体物理图谱的快速构建。尽管本报告中使用了多线染色体进行物理定位，但这些系统同样适用于有丝分裂染色体。将该方案调整以适用于有丝分裂染色体将具有重要意义，因为大多数生物无法形成可读的多线染色体。然而，当多线染色体可获得时，其能够提供关于功能基因组区域与染色体结构之间对应关系的高分辨率信息。近年来，多线染色体的组织原则（如带和间带的模式）被认为与常规的非多线染色体（间期）染色体相似18。因此，在高压制备的染色体样本上进行的精细物理定位有望将DNA序列与特定的染色体结构（如带、间带、胀泡、着丝粒、端粒和异染色质）关联起来，从而构建基于染色体的基因组组装。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）基金项目1R21AI094289对Igor V. Sharakhov的资助。Xmatrx全自动载片染色系统和ACCORD PLUS全自动扫描系统得益于弗吉尼亚理工大学设备信托基金项目、弗拉林生命科学研究所、昆虫学系和生物化学系的资助购得。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 22x22 mm 显微镜盖玻片 | Fisher | 12-544-10 | |
| 18x18 mm 显微镜盖玻片 | Fisher | 12-553-402 | |
| 乙酸 | Fisher | A491-212 | |
| 甲醇 | Fisher | A412-4 | |
| 丙酸 | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Dremel 200 旋转工具，带柔性轴附件 | Rand | 3" 多功能迷你台式磨床（带限速器） | |
| 专为 Dremel 工具设计的 200 μl 塑料吸头（带珠状塑料边缘） | Pipetman | F171300 | 切割并加热移液吸头的粗端 |
| 镀锡快速台钳 | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | 精密研磨，方正且平行度在 0.00025 以内 |
| 扭矩扳手 | Craftsman | 44593 | |
| ThermoBrite 载玻片变性/杂交系统 | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| 25 mm 隔离式载玻片 | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| 25 mm 盖玻片 | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| Xmatrx 自动载玻片染色系统 | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| Leica MZ6 体视显微镜 | Leica | VA-OM-E194-354 | 可使用其他体视显微镜 |
| Olympus CX41 相差显微镜 | Olympus | CX41RF-5 | 可使用其他相差显微镜 |
| ACCORD PLUS 自动扫描系统 | BioView (USA) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 10% NBF（中性缓冲福尔马林） | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 99% 甲酰胺 | Fisher Scientific | BP227500 | |
| 硫酸葡聚糖钠盐 | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC 缓冲液 | Invitrogen | AM9765 | |
| 磷酸钠 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 50x Denhardt 溶液 | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 1 mM YOYO-1 碘化物（491/509）DMSO 溶液 | Invitrogen | Y3601 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | Invitrogen | P36930 | |
| dATP、dCTP、dGTP、dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP、Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| DNA 聚合酶 I | Fermentas | EP0041 | |
| DNase I | Fermentas | EN0521 |
参考文献
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重印与许可
