一种定量适合度分析工作流程

摘要

定量适合度分析（QFA）是一系列互补的实验与计算方法，用于估计微生物培养物的适合度。QFA 可用于评估基因突变、药物或其他施加处理对微生物生长的影响。实验设计可从对单个培养物的集中分析扩展到数千个平行培养物的高通量分析。

摘要

定量适合度分析（QFA）是一种用于比较平行培养的微生物群体适合度的实验与计算流程^1,2,3,4。QFA可用于对单个培养物进行有针对性的观察，但其最有价值的应用在于全基因组范围的遗传相互作用研究或药物筛选，可同时分析多达数千个独立的培养物。该方法的核心实验步骤是将独立且稀释的液态微生物培养物接种至固体琼脂平板上，随后对平板进行培养并定期拍照。对每个时间点的照片进行分析，获得定量的细胞密度估计值，进而构建生长曲线，从而推导出定量的适合度指标。通过比较不同培养物的适合度，可对遗传相互作用强度或药物敏感性进行量化和排序。QFA还可用于量化添加到琼脂培养基中的处理因素（例如小分子化合物、抗生素或营养物质）或外部施加于平板的处理因素（例如紫外线照射、温度变化）对微生物培养适合度的影响。

QFA 工作流程产生的生长速率估计值类似于通过 96 孔或 200 孔板读数仪对平行液体培养物进行分光光度测量所获得的结果。重要的是，与这些方法相比，QFA 具有显著更高的通量。QFA 培养物在固体琼脂表面生长，因此在生长过程中具有良好的通气性，无需搅拌或振荡。

QFA 的通量不如某些合成遗传阵列（Synthetic Genetic Array, SGA）筛选方法高^5,6。然而，由于 QFA 培养物在接种到琼脂前经过了高度稀释，因此能够捕获更完整的生长曲线，包括指数生长期和饱和期³。例如，通过生长曲线的观测，可直接高精度地估算培养物的倍增时间，如前所述¹。

本文介绍了一种特定的定量菌落分析（QFA）方案，应用于数千个酿酒酵母（S. cerevisiae）培养物，这些培养物在接种、培养和成像过程中由机器人自动处理。这些自动化步骤中的任何一步均可替换为相应的手动操作，但通量会相应降低；我们同时提供了一种通量较低的手动操作方案。相同的QFA软件工具可用于分析上述任一工作流程中获取的图像。

我们在对芽殖酵母 S. cerevisiae 的培养物应用定量_fitness_分析（QFA）方面具有丰富经验，但我们预计QFA在研究裂殖酵母 S. pombe 和细菌培养物时也将同样有效。

方案

手动QFA实验方案（适用于 S. cerevisiae 菌株）

1. 酵母菌株的培养

1. 将最多96个独立的酵母菌株在96孔培养板中，每孔加入200 μl富集液体培养基进行培养。菌株在温度可控的培养箱中培养至饱和状态。
2. 使用直径为1/8英寸的96针手动复制接种器（SIGMA R-2508），通过将其浸入100%乙醇中，随后进行火焰灭菌，然后静置冷却，以完成灭菌。
3. 在96孔培养板中每孔加入200 μl无菌水。将饱和培养物涡旋振荡（Eppendorf MixMate，30秒，750 rpm），然后将灭菌后的针具在饱和菌液中浸入三次，再浸入含无菌水的培养板中一次，以实现稀释。
4. 按照步骤1.2的方法对针具重新进行灭菌。
5. 将灭菌后的针具用于点样稀释后的菌液至固体琼脂平板：将针具在含稀释菌液的培养板中浸入三次，然后转移至矩形固体琼脂平板上进行接种。
6. 将矩形固体琼脂平板在适宜温度下培养，随后使用S&P Robotics spImager手动成像。也可采用其他图像采集方法，例如FujiFilm LAS4000或成本较低的数码单反相机，但需确保光照均匀且每次拍摄时平板相对于成像相机的位置保持一致。
7. 该方法可适用于较少数量的平行培养，例如48个，若能确保每次拍照时相对于成像相机的角度一致，则可将菌落接种于圆形培养皿中。

全自动QFA方案（适用于S. cerevisiae菌株）

2. 酵母菌株的培养

1. 从固体琼脂平板上独立生长的矩形排列的酵母菌株开始。本示例中的起始菌株是通过合成遗传阵列（SGA）技术将温度敏感型查询突变体与酵母基因敲除文库（YDC）进行杂交所得。最终的SGA平板采用1536格式，即16行×24列的菌落/培养物，代表4个重复的384种独立酵母菌株。平板布局参见图1。
2. 使用S&P Robotics Inc BM3-SC机器人配备96针、针直径1 mm的无菌接种针工具，将1536个菌株中的384个菌株自动转移至4块含有200 μl选择性培养基的96孔培养板中（图1）。接种针的清洁与无菌通过以下步骤实现：依次用无菌水清洗两次（其中一次使用旋转刷去除残留物）、70%乙醇（超声处理）和最后用100%乙醇清洗。
3. 将培养物在20 °C下培养至饱和状态（本示例中为三天，参见图1）。

3. 点样酵母培养物

1. 使用 Beckman Biomek FX，将饱和培养物在 Variomag Teleshake 上涡旋重悬（逆时针 1000 rpm，20 秒），并通过无菌 96 针机器人点样工具（V&P Scientific 磁性固定点样针，针直径 2 mm）点样至 200 μl 无菌水中，稀释约 1:70。点样针的清洁与灭菌通过以下步骤完成：在无菌水中清洗，在 70% 乙醇中清洗（使用刷子去除残留物），最后浸入 70% 乙醇并干燥。
2. 点样针经清洁和灭菌后，使用同一机器人点样工具将稀释后的培养物以 384 孔格式点样于固体琼脂平板上（见图 1）。
3. 点样后，将平板转移至配备自动转盘和进出舱门的 Cytomat 温控恒湿培养箱中。

4. 图像采集

1. 一台S&P Robotics自动化成像仪会反复将培养板从Cytomat培养箱中取出，移除板盖，将培养板精确定位于佳能EOS Rebel Ti 35mm数码单反相机下方的封闭且均匀照明的空间内，以5184 x 3456像素分辨率拍摄图像，然后重新盖上板盖，并将培养板放回培养箱转盘中。在培养板初次转移至培养箱后立即拍摄一张图像，以获得零时间点的生长测量值（背景值）。每块培养板的机器人操作和摄影过程耗时2分钟。
2. 当转盘完全装满时，培养板图像采集的最大频率为每6小时拍摄一次。培养板最长孵育六天（直至菌落生长达到饱和）。图1展示了在20 °C条件下时间序列中的三个典型图像。
3. 为便于追踪，培养板根据培养箱名称、温度、唯一的顺序批次编号以及在培养箱中的位置进行命名。图像名称由培养板名称与时间戳组合而成，并在图像采集时自动生成（例如 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg，文件类型FT1，表1）。

5. 实验元数据的采集

本节所述的元数据文件为制表符分隔的文本文件，需手动生成（例如，使用电子表格软件）。每个实验均有唯一的实验描述文件（FT2，表 1），而构建完成后，文库描述文件（FT3，表 1）可被广泛重复使用。

1. 该实验在实验描述文件（FT2）中进行了说明， 表1) 包含条形码（或自动生成的培养板名称）、实验开始时间戳、培养板处理方式、固体琼脂培养基成分、筛选名称、文库、培养板编号（适用于包含多块培养板的文库）以及重复象限编号的列（参见 图1用于从1536孔板缩小至384孔板。
2. 酵母菌株文库通过文库描述文件（FT3， 表1）注明文库中每个培养位置所培养的基因型。其包含以下各列：文库名称、ORF、板号、板行、板列以及一个可选的备注列。
3. 可选的标准基因名称文件（FT4， 表1）描述标准基因名称（例如 RAD9) 与每个系统性 ORF y 编号相关联（例如 YDR217C）用于识别待筛选菌株的信息可提供。该文件包含两列：ORF & 基因名称

6. 数据分析

QFA 计算工作流程需要使用一台性能较强的多核计算机工作站例如 一台戴尔 Precision T3500，配备 Xeon 四核 2.67 GHz 处理器和 12Gb 内存，其上安装有 Colonyzer 图像分析软件工具 ^3,4 以及 QFA R 软件包⁷两者均在线提供文档，可免费获取，并支持多种操作系统。

1. 以每张采集的平板图像作为输入，运行 Colonyzer，为每张采集的图像生成一个 Colonyzer 输出文件（FT5 表 1）。Colonyzer 输出文件针对成像平板上的 384 个位置，分别提供菌落密度估计值、菌落面积、形状和颜色信息。输出文件名自动从源图像文件名复制（例如，平板照片 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg（FT1，表 1）对应 Colonyzer 输出文件 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat（FT5，表 1））。
2. 使用 QFA R 软件包加载实验元数据（FT2，表 1）和 Colonyzer 输出文件（FT5 表 1）。这些数据被合并为 R 数据框（可导出为 QFA 原始数据文本文件（FT6，表 1）），以供进一步分析。
3. QFA R 软件包包含用于获取每个菌落的细胞密度时间序列、将广义逻辑生长模型拟合至观测数据并绘制相应图形的函数（示例见图 2 和图 3）。拟合得到的参数值被写入 QFA 逻辑参数文件（FT7 表 1）。更多细节请参阅 QFA R 软件包文档。
4. QFA R 软件包还包含质量控制功能：由于平板边缘营养更丰富且靠近平板壁处图像分析存在困难，边缘菌落将被剔除；在分析中还会剔除 SGA 实验失败的菌株以及与筛选特异性标记基因存在连锁的基因型。
5. 从每个菌落的逻辑种群模型参数中推导出多个定量的适合度指标。这些指标包括最大种群倍增速率（MDR）和从接种到饱和期间的分裂次数（MDP）。对于每组重复菌落（例如具有唯一基因型的菌落）以及每种适合度定义，计算多个适合度估计值的汇总统计量：适合度均值和中位数、适合度标准差以及观测到的重复数。汇总统计量输出至 QFA 适合度汇总文件（FT8，表 1）以供进一步分析，例如 计算基因互作得分（FT9 表 1）。

7. 代表性结果

图2展示了在固体琼脂培养基上于20 °C条件下培养的384个QFA培养物中的一个典型生长曲线，该曲线由Colonyzer定量获得，细胞密度的增加大约在接种后2天首次可被检测到。这种延迟可能是接种至固体培养基后存在的培养滞后期与细胞密度检测下限共同作用的结果。图3显示了从单个培养板上获取的308条类似的生长曲线。图4展示了通过两次全基因组范围QFA筛选结果的比较来推断遗传相互作用强度的方法（改编自¹）。QFA R软件包⁷还包含用于生成图3的函数，以及输出被检测基因型的排序列表、遗传相互作用强度（GIS）估计值的函数，同时提供q值（即经错误发现率（FDR）校正后的p值），以评估所观察到的GIS的显著性。

图1. 酵母菌株以384点格式进行机器人接种的示意图。 该实验流程从每块平板上的1536个独立培养物开始（左图）。在此典型示例中，位于1,1；1,2；2,1和2,2位置的菌落（以红色标出）为同一基因型的四个重复。 his3::KANMX 培养物呈黄色，在平板边缘生长，由于缺乏竞争而具有生长优势，因此不被用于QFA分析。其中一个重复样本（例如 1,1）使用96针工具将菌落接种至96孔板中的液体培养基内，每次接种可转移1536个菌落中的96个。为了对384个基因敲除株的每一样本完成一次重复接种，需将四个不同的“象限”（分别标记为红色、蓝色、绿色和紫色）分别接种至四块含有培养基的96孔板中。培养至饱和生长后（例如 3 天 20 °C），将培养物用清水稀释后，取其中一个重复的四个象限，以与原始SGA平板相同的模式（如颜色所示）点样至384格式的固体琼脂平板上（右侧）。该过程可重复用于检测其他重复：1,2；2,1 和 2,2。右侧示例时间推移图像分别是在接种后0.5、2和3.5天拍摄的。改编自补充材料 图1 ². 单击此处查看大图.

图 2. 由机器人采集的一条QFA生长曲线。A) 一种酵母菌株在含半乳糖的琼脂培养基上于20 °C条件下生长的QFA生长曲线。图像由机器人每约2小时自动采集一次。在此温度下，指数生长期持续约1.5天，接种后约2天开始可检测到培养物密度的增加。对观测数据拟合了广义逻辑模型（灰色曲线）。QFA R软件包自动拟合的模型参数如下：K（环境容纳量（AU））、r（生长速率（d^-1））、g（接种密度（AU））、v（生长对称性）。B) 同A图，但细胞密度以对数刻度绘制。点击此处查看高清大图。

图 3. 从单个 384 孔板平行捕获的自动生成的生长曲线。每个子图展示了通过 QFA 实验流程培养的独立菌株（以基因名称或 ORF y 编号标记）的细胞密度估计值（红色叉号）和模型拟合结果（黑色曲线）。本示例板由机器人成像，并在 20 °C 的自动培养箱中培养。实验元数据已自动包含在图标题中：板名称、板处理方式、琼脂培养基和文库板编号。拟合模型的参数值也自动打印在每个子图上（见图 2）。边缘菌株已被排除在 QFA 分析之外，因此本图中包含 308 个菌株（参见 QFA 方案第 5.4 节）。由于 QFA 不分析边缘菌株，这些位置通常填充中性对照菌株（本例中为 pGAL-HIS3）。该图的原始版本由 QFA R 软件包生成，为 .pdf 格式，因此可无限放大并支持文本搜索。点击此处查看高清大图。

图 4. 比较两次QFA筛选的适合度以推断遗传相互作用。 本图展示了酿酒酵母基因缺失（yfgΔ）分别与中性突变 ura3Δ 或温度敏感突变 cdc13-1 组合后，在 cdc13-1 的半许可温度（27 °C）下生长时的适合度比较结果。适合度定义为最大倍增速率与最大倍增潜能的乘积¹。大多数缺失菌株与中性 ura3Δ 突变组合时生长良好，适合度较高，符合预期；而与 cdc13-1 组合的缺失菌株则表现出广泛的适合度差异。浅蓝色直线交叉点位于中性突变 his3Δ 的位置，实线表示遗传独立性的线性回归模型（基于 ura3Δ yfgΔ 突变体的适合度预测 cdc13-1 yfgΔ 突变体的预期适合度），虚线表示适合度相等的参考线。绿色标记的缺失显著增强了 cdc13-1 菌株的适合度缺陷，红色标记的缺失则显著抑制了该缺陷。任意 cdc13-1 yfgΔ 突变体与实线之间的垂直距离反映了在该培养条件下 cdc13-1 与 yfgΔ 之间遗传相互作用的强度。请注意，一些对 cdc13-1 抑制作用最强的基因是先前已知的检查点基因，如位于右上角的 RAD17、DDC1、RAD24 以及核酸酶 EXO1。缺失后导致适合度下降的基因包括编码DNA修复和端粒保护蛋白Yku80的 YKU80，位于右下角。此外，一些功能相关的基因群在图中倾向于聚集在一起。图中用蓝色高亮显示了三组示例基因簇：SPE1、SPE2 和 SPE3：亚精胺合成相关基因；RAD17、DDC1 和 RAD24：编码检查点滑动夹及检查点夹加载复合物的组分；MRE11、RAD50 和 XRS2：参与DNA损伤应答（DDR）的MRX复合物；以及 EST1 与 EST3：参与端粒长度调控的基因。改编自补充材料图 1B¹，生成本图的原始数据可从此处下载：http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/。点击此处查看高清大图。

文件编号	文件类型	手动构建	更新频率	前置条件
FT1	平板照片	否	每个平板及时间点	是
FT2	实验描述	是	每次实验	是
FT3	文库描述	是	每个文库	是
FT4	标准基因名称	是	每个文库	否
FT5	Colonyzer 输出结果	否	每个时间点每个平板	是
FT6	QFA 原始数据	否	每次实验	-
FT7	QFA 逻辑拟合参数	否	每次实验	-
FT8	QFA 适应度汇总	否	每次实验	-
FT9	QFA 遗传互作候选列表	否	每项GIS研究（2次实验）	-

表1. 电子QFA文件。所列文件（FT1除外）均为制表符分隔的文本文件，可使用任意文本编辑器或电子表格软件创建或读取。有关构建QFA元数据文件以及QFA输出结果的准确解读的更多细节，请参见QFA R软件包文档⁷和Colonyzer软件文档³。

表 2. 评估培养适应性的方法。 多种用于评估微生物培养适应性的方法的特征与要求汇总。Blomberg⁸的综述中包含了对其中部分方法更详细的比较。点击此处查看大图。

讨论

在许多方面，QFA 是三种成熟的台式微生物学技术的直接发展：培养物稀释系列点种试验⁹、振荡液体培养物中的生长曲线测定⁹以及复制平板法¹³。这三种方法与 QFA 及其他高通量技术的总结与比较见表2。稀释系列点种试验通过在一系列不同接种稀释度下培养物形成菌落的能力来定义菌株的适合度，而 QFA 则通过对单一培养物进行重复观察以构建生长曲线来测量菌株适合度。通过对单个培养物量化适合度，可在相同条件下同时检测大量菌株。通过复制培养物阵列，可对菌株集合进行重复测试，尤其适用于检测不同环境或遗传背景下培养物适合度的差异。本文所介绍的 QFA 方案使用昂贵的机器人设备完成琼脂平板的复制、接种、培养和成像，适用于观察数千个独立培养物的生长情况（机器人 QFA，表2）。然而，由于 QFA 基于已建立的传统实验技术，因此也可通过以人工操作替代机器人辅助，以更低的成本实施（人工 QFA，表2）。人工 QFA 采用手动打孔工具将培养物复制并接种到琼脂平板上，并人工将平板移入和移出培养箱进行拍照。相同的计算分析流程可用于两种实验设计所获得数据的生长曲线生成。

QFA 对适合度的估计似乎具有较高的精确性。图4 中标示了四个功能相关基因敲除样本簇的平均适合度。每个功能相关基因类别在两个独立的遗传背景（ura3Δ 和 cdc13-1）中成员的紧密聚集，表明 QFA 适合度估计具有良好的可重复性。例如，在总共可能的 4,300 个基因敲除中，仅 3 个基因敲除的差异就可将保守的 MRX 复合物的三个成员区分开来。

用于检测微生物菌株生长特性的高通量QFA替代方法包括SGA^5,6、条形码文库中的竞争性筛选^11,12，以及利用分光光度酶标仪捕获光密度动力学的筛选方法¹⁰，这些方法总结于表2，并在其他文献中有更详细的描述⁸。QFA和SGA平板中，微生物在固体琼脂表面生长（基于琼脂的方法，表2），可由机器人快速简便地处理。固体琼脂表面培养在整个生长过程中通气良好，细胞可在固定培养物中生长，有利于社会性微生物以群落形式生长¹⁴。若保持完整，微生物群落会自我影响其微环境，分泌乙醇等毒素，并可能在细胞间进行信号交流。然而，液体培养物需要持续振荡以实现充分通气，这一过程会人为破坏微生物群落及其微环境，可能影响其生长模式。由于固体琼脂方法中液体飞溅导致细胞交叉污染的机会较少，因此交叉污染问题较小。若在固体琼脂检测中发生外来气源性微生物污染，通常可通过肉眼观察固体琼脂平板发现，并予以校正或剔除。

QFA 的通量在两个方面显著高于平行液体培养方法。首先，在 QFA（以及 SGA）平板上，接种的培养物排列更为密集，使得每个平板可容纳更多的独立培养物。在 QFA 中，通常每个平板包含 308 个培养物（不包括非实验性的边缘培养物）（图 1），而平行液体培养每个平板仅包含 96 或 100 个培养物。其次，QFA 实验可扩展至更多数量的平板。QFA 实验中可分析的平板数量仅受限于培养箱或温控室内的可用空间、最低允许的图像采集频率以及设备可达到的最高采集频率；而液体生长实验中的平板数量则受到酶标仪容量（通常为 1 至 2 块平板）或连接在酶标仪上的自动进板堆叠器容量（通常为 25 至 50 块平板）的严格限制。我们最近完成了一项完全自动化的 QFA 实验，共使用 123 块平板，每块平板包含 308 个实验性培养物，总计同时培养了 37,884 个独立培养物。我们估计，液体培养中可实现的最大独立培养物数量为 96（培养物/平板）× 50（平板/堆叠器）= 4800，约为我们 QFA 通量的十分之一。另一种用于液体培养筛选的替代方案是并行使用多个自动化生长检测设备（参见 Blomberg ⁸ 综述中的 表 1），每个设备可容纳 1 至 2 块平板。由于每个设备的温度控制相互独立，实验条件并不完全一致；但即便假设其条件一致，要达到与 QFA 相当的通量，该工作流程至少需要 190 台此类设备（假设每台设备可运行 200 个液体培养物）。

总之，定量菌落分析（QFA）是一种高质量的工作流程，可有效地应用于小规模聚焦实验和高通量筛选中，以获取定量的生长表型数据。该方法具有足够的灵活性，能够根据不同的机器人设备配置需求进行有效应用。QFA工作流程的计算部分基于免费提供的开源代码。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
复制平板仪	Sigma	R-2508	96针手动点样针，1/8英寸 " 直径销
混合伴侣	Eppendorf	5353 000.014
Biomek FX	贝克曼	A31842
Teleshake	赛默飞世尔科技	50095890	安装在 Biomek FX 上
BM3-SC	S&P Robotics Inc	BM3-SC	192层旋转货架转盘
spImager	S&P Robotics Inc	spImager	高分辨率手动成像
spImager 与 Cytomat	S&P Robotics Inc	自定义	温度控制的自动化高分辨率成像
带热交换器的Cytomat 6001	赛默飞世尔科技	51022222	连接至 spImager
Ecoline RE207	Lauda	RE207	连接至 Cytomat
spImager 配置转盘	S&P Robotics Inc	自定义	自动化高分辨率成像
FP12针机器人销钉工具夹具	V&P Scientific	AFIX96FP12	N/A
96 x FP12 针脚	V&P Scientific	FP12	50.4 毫米长，17 毫米暴露针长
针具对接站	V&P Scientific	VP425	移除对接站底座以使针脚可被风扇干燥
针头清洁刷	V&P Scientific	VP425	N/A
复制平板仪	Sigma	R-2508	手动打孔工具
Nunc OmniTray 及盖子	Nunc	734-0490	N/A
96孔无菌聚苯乙烯板	Greiner BioOne	655161	N/A
96孔无菌聚苯乙烯板盖	Greiner BioOne	656171	N/A
<强>表3. 特定试剂与设备。