在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.
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摘要
摘要
在中枢神经系统（CNS）中实现高效的基因递送，对于研究基因功能、建立神经疾病模型以及开发治疗策略具有重要意义。慢病毒载体因其能够转导分裂和非分裂细胞、支持外源基因的长期表达、具有相对较大的包装容量以及较低的毒性，成为转导CNS中神经元及其他细胞类型的理想工具1-3。慢病毒载体已成功应用于多种神经细胞类型体外in vitro4-6以及动物体内的转导7-10。
为提高慢病毒载体在基因递送中的生物安全性和效率，已进行了大量研究。目前第三代复制缺陷型且自失活（SIN）的慢病毒载体如图1所示。载体包装所需元件被分配至四个质粒中。在慢病毒转移质粒中，5'长末端重复序列（LTR）的U3区被来自其他病毒的强启动子取代。这一修饰使得载体序列的转录不再依赖于HIV-1 Tat蛋白——该蛋白通常为HIV基因表达所必需11。包装信号（Ψ）对基因组RNA的包裹至关重要，而Rev反应元件（RRE）则对产生高滴度载体必不可少。中心多聚嘌呤片段（cPPT）有助于载体DNA的核输入，这是转导非分裂细胞所需的重要特性12。在3' LTR中，U3区的顺式调控序列被完全删除。该缺失在逆转录后会复制到5' LTR，导致两个LTR均发生转录失活。质粒pMDLg/pRRE包含HIV-1的gag/pol基因，可表达结构蛋白和逆转录酶。pRSV-Rev编码Rev蛋白，该蛋白可结合RRE以促进RNA从细胞核高效输出。pCMV-G编码水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），用于替代HIV-1的Env蛋白。VSV-G可拓宽载体的宿主趋向性，并允许通过超速离心进行浓缩13。所有编码辅助蛋白（包括Vif、Vpr、Vpu和Nef）的基因均未包含在包装系统中。慢病毒载体的制备与操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于重组DNA研究的指南（http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf）。在使用慢病毒载体前，可能需要获得各机构生物与化学安全委员会的批准。慢病毒载体通常通过将慢病毒转移质粒与编码包装所需蛋白的辅助质粒共同转染293T细胞来生产。许多慢病毒转移质粒和辅助质粒可从Addgene（一家非营利性质粒库）获取（http://www.addgene.org/）。尽管已开发出一些稳定的包装细胞系，但这些系统灵活性较低，且其包装效率通常随时间推移而下降14,15。市售转染试剂盒可能实现高转染效率16，但大规模制备载体时成本较高。磷酸钙沉淀法可实现293T细胞的高效转染，因此为慢病毒载体的生产提供了一种可靠且经济有效的方法。
在本实验方案中，我们采用基于磷酸钙沉淀原理的四质粒共转染293T细胞的方法制备慢病毒载体，随后通过20%蔗糖垫超速离心进行纯化和浓缩。病毒滴度通过荧光激活细胞分选（FACS）分析或实时定量qPCR测定。本方案可在9天内完成慢病毒载体的制备与滴定。我们以将这些载体转导至包含神经元和星形胶质细胞的小鼠新皮层原代培养物为例进行说明。结果表明，慢病毒载体可在中枢神经系统来源的原代培养细胞中实现高效的转导及细胞类型特异性的基因表达。
方案
1. 慢病毒载体的包装
慢病毒载体通过磷酸钙转染法将慢病毒转移载体和其他包装所需的质粒共同转染至293T细胞中进行制备。本实验方案使用10个100毫米的组织培养皿，可根据实际应用需求进行扩增或缩小规模。293T细胞系在含高糖（4500 mg/L）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，并置于37 °C、含5% CO2的培养箱中维持培养。
- 将293T细胞以30-40%的汇合度接种至10个100-mm组织培养皿中（每皿3 × 106个细胞），加入培养基后放回培养箱中培养。
- 培养20-24小时后，检查细胞密度。转染时细胞汇合度应约为80%。
- 准备一个50-ml离心管。加入4.4 ml TE79/10缓冲液（1 mM TrisHCl，0.1 mM EDTA，pH 7.9），减去以下质粒DNA的总体积。然后加入100 μg慢病毒转移质粒（图1）、58 μg pMDLg/pRRE、31 μg pCMV-G、25 μg pRSV-Rev和600 μl 2M CaCl2，轻轻混匀。
- 另取一个50-ml离心管，加入5 ml 2x HBS缓冲液（0.05 M HEPES，0.28 M NaCl，1.5 mM Na2HPO4，pH 7.12）。
- 用10-ml移液器吸取DNA-CaCl2混合液，边涡旋边逐滴加入盛有2x HBS的离心管中。
- 室温（RT）静置反应30分钟，使沉淀形成。
- 从培养箱中取出培养皿，涡旋充分混匀沉淀反应液，将1 ml混悬液缓慢逐滴加入每个含细胞的100-mm培养皿中，同时轻轻旋转培养皿使培养基混匀。加样完毕后将培养皿放回培养箱继续培养5小时。
- 吸除原有培养基，每皿加入6 ml含6 mM丁酸钠的新鲜培养基，放回培养箱继续培养。过夜培养后，若载体中含有荧光报告基因，可在荧光显微镜下观察报告基因的表达情况。通常情况下，若报告基因由广泛性启动子（如CMV启动子）驱动，超过80%的细胞会表达该基因。
- 转染后两天（40-44小时），将10个培养皿中的上清液收集至2个50-ml离心管中（每管约30 ml）。可将上清液冻存于-80 °C冰箱，或直接进行下一步操作。
2. 载体的浓缩与纯化
- 将 freshly 收集或解冻的上清液在 900 g（约 2000 rpm）条件下离心 10 分钟，以去除上清液中的细胞碎片。
- 将一个 60-ml 注射器连接至 0.2-μm SFCA 注射器滤器。将上清液从 50 ml 管转移至注射器中。用聚丙烯离心管收集滤液。
- 用5 ml移液管吸取5 ml 20%蔗糖溶液（用PBS配制）。将移液管插入含有上清液的离心管底部，缓慢将蔗糖溶液加至上清液下方。对另一管中的上清液重复上述步骤。
- 将上清液在11000 rpm条件下离心 4 °C 使用Beckman SW28水平转子离心4小时。
- 移除上清液。加入 150 μl 向每个离心管中加入4%乳糖（用PBS配制），重悬沉淀。
- 将所有离心管中的浓缩病毒载体转移至一个1.5 ml离心管中，冰上放置15分钟。
- 用移液器混匀载体悬液。使用微量离心机以最大速度（约16000 g）离心1分钟。
- 将上清液转移至新的1.5 ml离心管中。将最终样品分装至 20 μl 分装并储存在 -80 °C 冷冻机
3. 载体的滴定
- 在12孔板中，每孔加入1 ml含10% FBS的DMEM培养基，接种5 × 104个HT1080细胞。
- 过夜培养后，计数其中一个孔的细胞，并记录细胞数量。
- 用培养基对浓缩病毒载体进行5倍梯度稀释（1:5、1:25、1:125和1:625），向各孔分别加入1 μl不同稀释度的病毒液。可设置重复孔以提高实验准确性。
- 在每个含病毒液的孔以及一个不含病毒液的对照孔中，加入1 μl 4 mg/ml的Polybrene（Hexadimethrine Bromide）。轻轻摇动培养板混匀，然后放回培养箱继续培养48小时。
- 移除细胞培养孔中的培养基，用PBS洗涤每个孔。每孔加入250 μl 1×胰蛋白酶-EDTA溶液。待细胞脱落（3–5分钟）后，加入1 ml培养基，用移液器吹打重悬细胞，将细胞悬液转移至1.5 ml离心管中。
- 以900 g离心6分钟。若病毒载体携带荧光报告基因（如GFP），则进入步骤3.7进行FACS分析；若无报告基因，则进入步骤3.8进行实时定量qPCR检测。
- 对于携带荧光报告基因的载体，吸除上清液，用300 μl含3.7%甲醛的PBS溶液重悬细胞沉淀。通过FACS分析确定报告基因阳性细胞的比例。病毒滴度以每毫升浓缩病毒液中的转导单位（TU/ml）表示。
例如，如果将 1 x 105 个细胞用 1/25 μl（0.04 μl）病毒载体进行转导，且 30% 的细胞为报告基因阳性，则滴度为：
仅使用稀释度在阳性细胞百分比与所加载体数量之间呈线性关系的范围内计算滴度。最终滴度应为至少使用两种不同量的载体进行转导后所得滴度的平均值。
- 对于不含荧光报告基因的载体，使用 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) 按照制造商提供的方案从 HT1080 细胞中提取基因组 DNA。使用 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)，在基因组 DNA 中扩增载体序列，引物（位于 HIV-1 PBS/psi 区域17）为 5'-CCGTTGTCAGGCAACGTG-3' 和 5'-AGCTGACAGGTGGTGGCAAT-3'，TaqMan 探针为 5'-FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3'。同时扩增基因组中的单拷贝基因白蛋白基因（2 拷贝/细胞），作为内参对照，所用引物为 5'-TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT-3' 和 5'-CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT-3'，探针为 5'-FAM-TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGA-TAMRA-3'。按照制造商说明，在 96 孔板中进行 PCR 反应，程序如下：50 °C 2 分钟，95 °C 10 分钟，随后进行 35 个循环（95 °C 15 秒，60 °C 2 分钟），以确定载体和白蛋白基因的拷贝数。还应对已知浓度（以拷贝数表示）并含有模板序列的质粒进行 10 倍系列稀释后扩增，以建立标准曲线，用于未知样品的定量分析。滴度将以每毫升浓缩载体中的整合单位（IU/ml）表示。
4. 新皮层培养物的转导
使用先前描述的两步贴壁法18，从小鼠大脑皮层制备包含神经元和胶质细胞的新生皮层培养物。取妊娠14至16天小鼠胚胎的新皮层，接种至已建立的胶质细胞单层上，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）、20 mM葡萄糖和2 mM谷氨酰胺的MEM，使用24孔组织培养板进行培养。
- 5 天后 体外，添加 10 μM 在新生皮层培养物中加入阿糖胞苷（Ara-C）以抑制非神经元细胞的分裂。继续培养细胞2天。
- 将培养基预热 37 °C 水浴 5-10 分钟。将含 Ara-C 的培养基更换为新鲜培养基（500 μl/well).
- 按所需的感染复数（MOI；即病毒载体颗粒数与靶细胞数的比值）将载体加入培养物中，继续培养24小时。在原代皮层培养中，我们使用的MOI为1–10（通常为5）。
- 更换为新鲜培养基，继续培养。如果载体构建中含有报告基因，在转导后2天于荧光显微镜下观察细胞。报告基因的表达在转导后2至7天可在神经元中观察到，具体时间取决于载体设计和使用的剂量。
5. 典型结果
该方案产生的慢病毒载体滴度范围为108-1010 IU/ml，适用于转导中枢神经系统多种细胞类型 体外 和 体内. 表1 和 图2 展示使用本方案所构建载体进行转导的代表性结果。我们进行了转导 使用慢病毒载体转导表达绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠新皮层培养物，该载体由突触素（SYN）启动子或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子调控。转导后七天，我们分别使用抗NeuN和抗GFAP抗体进行免疫染色，以标记神经元和星形胶质细胞。如图所示 表1 和 图 2A，经携带突触素启动子的载体转导后，超过90%的神经元（NeuN+ 细胞）表达 GFP，且无星形胶质细胞（GFAP+ 细胞）表达该报告基因。当在载体构建中使用GFAP启动子时（图 2B），约80%的星形胶质细胞（GFAP+ 细胞）表达GFP；所有GFP+ 细胞为星形胶质细胞，经与GFAP共定位及NeuN标记细胞中无GFP表达证实。这些结果表明，慢病毒载体可高效将转基因递送至中枢神经系统细胞，且当使用适当启动子时可实现细胞特异性基因表达。
图 1. 基于 HIV 的慢病毒载体及其包装质粒的示意图。 顶部显示的是 HIV-1 前病毒。用于载体生产的元件被分到四个不同的质粒中。慢病毒转移质粒包含一个杂合的 5' LTR，其中 U3 区被巨细胞病毒（CMV）启动子取代，还包含包装信号（ψ）、RRE 序列、中心多聚嘌呤 tract（cPPT）、一个目的基因（例如荧光报告基因）以及一个选定的启动子，以及 3' LTR，其中 U3 区的 cis 调控序列被完全删除。pMDLg/pRRE 包含在 CMV 启动子控制下的 HIV-1 的 gag 和 pol 基因以及 RRE 序列。pRSV-Rev 包含由 RSV 启动子驱动的 Rev 编码序列。pCMV-G 包含在 CMV 启动子控制下的 VSV-G 蛋白基因。PA 表示来自人 β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。
图 2. 携带细胞类型特异性启动子的慢病毒载体转导小鼠新皮层混合培养物后报告基因的表达。培养物以 MOI 为 5 的条件转导 LV-SYN-GFP（A）或 LV-GFAP-GFP 载体。转导后 7 天，使用抗 NeuN 或抗 GFAP 抗体对细胞进行免疫染色。上排图显示 GFP 荧光信号，中排图为免疫染色结果，下排图为合并图像（GFP：绿色；NeuN 或 GFAP：红色）。
| 载体 | 神经元中的GFP+细胞 | 星形胶质细胞中的GFP+ |
| LV-SYN-GFP | 92.2±7.3 | 0 |
| LV-GFAP-GFP | 0 | 78.3±11.5 |
表1. 携带不同启动子的慢病毒载体转导小鼠新皮质培养物后GFP表达的比较a。
a将小鼠新皮质培养物（每孔5 × 105个细胞，接种于24孔板）以MOI为5的条件转导LV-SYN-GFP或LV-GFAP-GFP。转导7天后，固定培养物并进行NeuN或GFAP免疫染色。每种实验条件下，从10个视野的图像中计数表达GFP以及NeuN/GFAP的细胞数量。数值表示同时表达GFP报告基因的神经元（NeuN+细胞）或星形胶质细胞（GFAP+细胞）所占的百分比。所示数值为三次独立实验的均值 ± 标准差。
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讨论
在本实验方案中，我们展示了慢病毒载体的制备及其在新皮层培养物中的应用。我们证实了通过这些方法制备的载体可实现高效且细胞类型特异性的转导。当使用突触素（synapsin）启动子时，GFP 的表达严格局限于神经元。当使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子时，GFP 的表达则仅存在于星形胶质细胞中。如果无需细胞类型特异性表达，可使用泛表达启动子。我们发现，泛素（ubiquitin）和磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子均能在新皮层培养物中驱动高水平的基因表达6。通过选择不同的启动子（如泛表达型或细胞类型特异性启动子），或使用不同的包膜蛋白或载体假型以靶向特定组织或应用，可对慢病毒载体驱动的基因表达进行定制化调控。例如，采用狂犬病病毒G蛋白（rabies G protein）或VSV-G与狂犬病病毒蛋白的融合蛋白进行假型化，可支持轴突的逆向运输19,20。该瞬时转染方案允许使用不同包膜蛋白进行载体包装。
慢病毒载体通常通过超速离心进行浓缩，而不经过纯化步骤。这类未经纯化的病毒载体适用于多种细胞类型。然而，原代神经元培养物对生产细胞来源的污染物较为敏感，...
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致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）神经科学蓝图核心资助（P30 NS057105，BJS）资助华盛顿大学，项目项目资助NS032636（BJS）以及希望神经疾病中心提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SV3001403 | |
| PBS | 美迪特科技公司 | 21-040-CM | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| 丁酸钠 | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 六亚甲基溴化物（Polybrene） | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 293T细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| HT1080 细胞 | ATCC | CCL-121 | |
| Falcon 100 x 20 mm 组织培养皿 | BD 生物科学 | 353003 | |
| 1 × 3 ½ 在多向异体中–r 离心管 | 贝克曼库尔特公司 | 326823 | |
| 0.2 微米注射器滤器 | 康宁 | 431219 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 |
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