用于转导中枢神经系统细胞的慢病毒载体的制备

摘要

在此方案中，我们描述了慢病毒载体的制备、纯化及滴定方法。我们以原代培养的神经元和星形胶质细胞中慢病毒载体介导的基因递送为例进行了说明。本方法也可适用于其他细胞类型 体外 和 体内.

摘要

在中枢神经系统（CNS）中实现高效的基因递送，对于研究基因功能、建立神经疾病模型以及开发治疗策略具有重要意义。慢病毒载体因其能够转导分裂和非分裂细胞、支持外源基因的长期表达、具有相对较大的包装容量以及较低的毒性，成为转导CNS中神经元及其他细胞类型的理想工具^1-3。慢病毒载体已成功应用于多种神经细胞类型体外in vitro^4-6以及动物体内的转导^7-10。

为提高慢病毒载体在基因递送中的生物安全性和效率，已进行了大量研究。目前第三代复制缺陷型且自失活（SIN）的慢病毒载体如图1所示。载体包装所需元件被分配至四个质粒中。在慢病毒转移质粒中，5'长末端重复序列（LTR）的U3区被来自其他病毒的强启动子取代。这一修饰使得载体序列的转录不再依赖于HIV-1 Tat蛋白——该蛋白通常为HIV基因表达所必需¹¹。包装信号（Ψ）对基因组RNA的包裹至关重要，而Rev反应元件（RRE）则对产生高滴度载体必不可少。中心多聚嘌呤片段（cPPT）有助于载体DNA的核输入，这是转导非分裂细胞所需的重要特性¹²。在3' LTR中，U3区的顺式调控序列被完全删除。该缺失在逆转录后会复制到5' LTR，导致两个LTR均发生转录失活。质粒pMDLg/pRRE包含HIV-1的gag/pol基因，可表达结构蛋白和逆转录酶。pRSV-Rev编码Rev蛋白，该蛋白可结合RRE以促进RNA从细胞核高效输出。pCMV-G编码水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），用于替代HIV-1的Env蛋白。VSV-G可拓宽载体的宿主趋向性，并允许通过超速离心进行浓缩¹³。所有编码辅助蛋白（包括Vif、Vpr、Vpu和Nef）的基因均未包含在包装系统中。慢病毒载体的制备与操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于重组DNA研究的指南（http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf）。在使用慢病毒载体前，可能需要获得各机构生物与化学安全委员会的批准。慢病毒载体通常通过将慢病毒转移质粒与编码包装所需蛋白的辅助质粒共同转染293T细胞来生产。许多慢病毒转移质粒和辅助质粒可从Addgene（一家非营利性质粒库）获取（http://www.addgene.org/）。尽管已开发出一些稳定的包装细胞系，但这些系统灵活性较低，且其包装效率通常随时间推移而下降^14,15。市售转染试剂盒可能实现高转染效率¹⁶，但大规模制备载体时成本较高。磷酸钙沉淀法可实现293T细胞的高效转染，因此为慢病毒载体的生产提供了一种可靠且经济有效的方法。

在本实验方案中，我们采用基于磷酸钙沉淀原理的四质粒共转染293T细胞的方法制备慢病毒载体，随后通过20%蔗糖垫超速离心进行纯化和浓缩。病毒滴度通过荧光激活细胞分选（FACS）分析或实时定量qPCR测定。本方案可在9天内完成慢病毒载体的制备与滴定。我们以将这些载体转导至包含神经元和星形胶质细胞的小鼠新皮层原代培养物为例进行说明。结果表明，慢病毒载体可在中枢神经系统来源的原代培养细胞中实现高效的转导及细胞类型特异性的基因表达。

方案

1. 慢病毒载体的包装

慢病毒载体通过磷酸钙转染法将慢病毒转移载体和其他包装所需的质粒共同转染至293T细胞中进行制备。本实验方案使用10个100毫米的组织培养皿，可根据实际应用需求进行扩增或缩小规模。293T细胞系在含高糖（4500 mg/L）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，并置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中维持培养。

1. 将293T细胞以30-40%的汇合度接种至10个100-mm组织培养皿中（每皿3 × 10⁶个细胞），加入培养基后放回培养箱中培养。
2. 培养20-24小时后，检查细胞密度。转染时细胞汇合度应约为80%。
3. 准备一个50-ml离心管。加入4.4 ml TE79/10缓冲液（1 mM TrisHCl，0.1 mM EDTA，pH 7.9），减去以下质粒DNA的总体积。然后加入100 μg慢病毒转移质粒（图1）、58 μg pMDLg/pRRE、31 μg pCMV-G、25 μg pRSV-Rev和600 μl 2M CaCl₂，轻轻混匀。
4. 另取一个50-ml离心管，加入5 ml 2x HBS缓冲液（0.05 M HEPES，0.28 M NaCl，1.5 mM Na_2<....

讨论

在本实验方案中，我们展示了慢病毒载体的制备及其在新皮层培养物中的应用。我们证实了通过这些方法制备的载体可实现高效且细胞类型特异性的转导。当使用突触素（synapsin）启动子时，GFP 的表达严格局限于神经元。当使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子时，GFP 的表达则仅存在于星形胶质细胞中。如果无需细胞类型特异性表达，可使用泛表达启动子。我们发现，泛素（ubiquitin）和磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子均能在新皮层培养物中驱动高水平的基因表达⁶。通过选择不同的启动子（如泛表达型或细胞类型特异性启动子），或使用不同的包膜蛋白或载体假型以靶向特定组织或应用，可对慢病毒载体驱动的基因表达进行定制化调控。例如，采用狂犬病病毒G蛋白（rabies G protein）或VSV-G与狂犬病病毒蛋白的融合蛋白进行假型化，可支持轴突的逆向运输^19,20。该瞬时转染方案允许使用不同包膜蛋白进行载体包装。

慢病毒载体通常通过超速离心进行浓缩，而不经过纯化步骤。这类未经纯化的病毒载体适用于多种细胞类型。然而，原代神经元培养物对生产细胞来源的污染物较为敏感，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
MEM	Invitrogen	11090-081
胎牛血清	Hyclone	SV3001403
PBS	美迪特科技公司	21-040-CM
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924
丁酸钠	Sigma-Aldrich	B5887
六亚甲基溴化物（Polybrene）	Sigma-Aldrich	H9268
293T细胞	ATCC	CRL-11268
HT1080 细胞	ATCC	CCL-121
Falcon 100 x 20 mm 组织培养皿	BD 生物科学	353003
1 × 3 ½ 在多向异体中–r 离心管	贝克曼库尔特公司	326823
0.2 微米注射器滤器	康宁	431219
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304