利用皱褶菌落形成评估生物膜产生的半定量方法

摘要

我们提供一种简单、半定量的方法，用于在体外研究生物膜的形成。in vitro 利用蔡司Stemi 2000-C体视显微镜（配备相机）通过观察皱褶菌落的发育情况，监测生物膜形成的时间进程和形态模式。

摘要

生物膜是包裹在细胞外基质中的细胞所形成的表面附着群落，代表了多种细菌的常见生存方式。在生物膜内，细菌细胞通常表现出改变的生理特性，包括对抗生素及其他环境胁迫的抗性增强¹。此外，生物膜在宿主-微生物相互作用中也可发挥重要作用。当细菌从独立的浮游细胞转变为形成复杂的多细胞群落时，即开始发育为生物膜²。在实验室中，通常通过评估特定生物膜表型的发育情况来研究生物膜。一种常见的生物膜表型是在固体琼脂培养基上形成皱褶状或粗糙状的细菌菌落³。皱褶菌落的形成提供了一种特别简单且有效的方法，用于识别和表征具有改变的生物膜表型的细菌菌株，并可用于探究影响生物膜形成的环境条件。皱褶菌落的形成可作为多种细菌生物膜形成的指示指标，包括革兰氏阳性菌如Bacillus subtilis⁴，以及革兰氏阴性菌如Vibrio cholerae⁵、Vibrio parahaemolyticus⁶、Pseudomonas aeruginosa⁷和Vibrio fischeri⁸。

海洋细菌 V. fischeri 由于生物膜在宿主定植过程中的关键作用，已成为生物膜形成的模型：由...产生的生物膜 V. fischeri 促进其在夏威夷短尾乌贼中的定植 Euprymna scolopes ^8-10重要的是，所观察到的生物膜表型 体外 与……的能力相关 V. fischeri 细胞有效定植宿主动物的能力：生物膜形成缺陷菌株 体外 存在定植缺陷 ^9,11而表现出生物膜表型增强的菌株在定植能力方面也得到增强 ^8,12. V. fischeri 因此提供了一个简单的模型系统，用于评估细菌调控生物膜形成的机制以及生物膜对宿主定植的影响。

在本报告中，我们描述了一种利用V. fischeri作为模式系统来评估生物膜形成的半定量方法。该方法包括将细菌培养物在精确浓度和体积下小心地点种到固体琼脂培养基上；一个点种的培养物等同于一个单一的细菌菌落。这种“点种培养”技术可用于比较在特定单一时点（终点检测）的总体生物膜表型，或通过生物膜发育的时间序列检测以及菌落直径的测量，来识别和表征细微的生物膜表型，而菌落直径受生物膜形成的影响。因此，该技术提供了对生物膜形成的半定量分析，能够评估皱褶菌落发育的时间进程和模式，以及发育结构的相对大小，这些特征超出了对整体形态的简单描述。

方案

1. 初始表征与注意事项

1. 生物膜的形成通常受细胞密度和生长速率的影响。因此，有必要通过简单的生长曲线和细胞涂布实验，测定目标菌株的生长速率（随时间变化的光密度（OD）增加）和产量（最终细胞数量）。在解释点种实验结果时，必须考虑生长缺陷或OD与细胞数量之间缺乏相关性的情况。
2. 在评估皱褶菌落形成时，应在同一块平板上设置适当的阳性对照和阴性对照，因为不同平板之间的微小差异可能影响生物膜的发育。
3. 确定最佳的点种条件，即能够最清晰地显示对照菌株与目标突变株之间差异的条件。在点种前，将菌株在不同条件下（如不同培养基或温度）以及不同生长阶段（对数期或稳定期）进行液体培养。将10 μl不同细胞密度的培养物点种到适当的培养基上，并在目标温度下培养，直至菌落形态清晰可见。
4. 终点实验是指在点种后预设的时间点（例如48小时）评估皱褶菌落的形成情况。该方法适用于表现出（或推测表现出）生物膜形成严重缺陷的菌株。
5. 时间进程实验是指在点种后的一段时间内（例如每小时）连续观察皱褶菌落的形成情况。该实验可通过确定皱褶菌落形成及模式发育的起始时间，实现对生物膜形成的半定量评估。实验持续时间和特定时间进程中的取样点数量应在预实验中确定。
6. 为便于准确记录点种后的时间，可设置计时器进行正向计时。

2. 菌落皱褶形态的显微评估 V. fischeri

1. 接种 V. fischeri 将细胞转入5 ml LB-Salt（LBS）培养基中 ¹³ （1% [w/v] 胰蛋白胨，0.5% [w/v] 酵母提取物，2% [w/v] 氯化钠，50 mM Tris-HCl [pH 7.5]），加入所需抗生素，于37°C摇床中过夜培养 28 °C. 早晨，将细胞以1:100的比例转接至5 ml新鲜LBS培养基中，于相同条件下培养，直至细胞达到所需的OD值₆₀₀ （例如，OD₆₀₀=0.2 或 0.5。
2. 将1 ml培养物移入微量离心管中，在微量离心机中以最大速度离心1分钟。用抽吸法去除上清液。用1 ml无菌70%人工海水（ASW）（35 mM MgSO₄）重悬菌体沉淀，以洗涤细胞，去除残留培养基及胞外组分。₄-7H₂O₂，7 mM CaCl₂₂-2H₂O、210 mM NaCl、7 mM KCl）并重复离心。将洗涤后的沉淀重悬于1 ml 70%人工海水（ASW）中。
3. 确保每个样品含有相同数量的细胞，通过600 nm处的OD值进行估算。若样品浓度过高，可用额外的70% ASW稀释以进行必要调整。在初步实验中，将不同初始OD值的培养物点样，以确定特定菌株组合或实验条件下最适的起始OD值。最佳结果通常在以下情况获得： V. fischeri 当菌液浓度（OD值）约为0.2时，会产生菌斑。
4. 斑点 10 μl 将洗涤后的细胞点样到含有必要抗生素的LBS平板上。点样时，用手指固定移液枪，使其枪头位于琼脂表面正上方。垂直点样，避免倾斜，并缓慢推出液体，以确保样点分布均匀。通常每个菌株每块平板点样一次（每板最多6个点），每次实验设置2–3块平板。
5. 为确保点种的菌液均匀分布，需待菌点干燥后再将平板转移至培养箱。将平板倒置后于 28 °C.
6. 从接种后12至15小时开始，每小时观察一次菌落形态的生长情况。我们使用配备相机（ProgRES C10）的解剖显微镜（Zeiss stemi 2000-C）进行观察。^PLUS使用 ProgRes CapturePro 和 ImageJ 软件观察并记录菌落形态，评估皱褶菌落形成的起始及进展过程。
7. 对于步骤2.5中列出的特定装置，样品斑点通过透明玻璃载物台从下方由CL 1500 EC冷光源照射，而图像则从上方采集。该装置适用于成像皱褶状菌落发育过程，因为 V. fischeri 菌落（斑点）呈半透明状。
8. 若无法获得步骤2.5中列出的特定设备，可使用任何能够完整观察菌落、具备可调节光源并最好配有摄像头的体视显微镜来监测皱褶状菌落形态。若无内置摄像头，必要时也可使用数码相机，但效果不理想。
9. 为了最佳地观察皱褶菌落的发育情况，需要调节细菌菌落下方的光照强度和反射角度，以便 discern 出发育中生物膜的三维形态。确定能够提供菌落与周围琼脂背景之间最强对比度的最佳光照条件，使菌落的结构（皱褶）清晰可辨。
10. 在某些情况下，还需考虑菌落斑点的颜色，因为菌落颜色在生物膜形成过程中可能发生改变。应调整光源的强度和角度，以显现这些细微的颜色变化。一旦达到合适的设置，应在整个实验过程中保持不变。
11. 记录从接种时间到每种菌株或条件下皱褶菌落形成开始所经历的时间。将皱褶菌落形成的起始时间定义为菌落出现可观察到的模式化结构和三维结构（即边缘出现条纹或中心出现“波纹”）的最早时间点。突变细胞可能表现出皱褶菌落形成起始时间的缩短或延长（例如， 图 2).
12. 记录皱褶菌落形成的起始与发育过程，需拍摄适当的数字图像。实验过程中采集图像时，必须使用相同的放大倍数。通过相机背面的拨杆切换显微镜目镜与计算机屏幕的观察视野。在目镜与屏幕观察之间切换时，应相应调整视野和焦距。
13. 在对点种培养物进行成像之前，通常需要取下培养皿的盖子，以获得最清晰的图像。然而，此步骤为可选操作，因为使用步骤2.5和2.6中所述的设置，可以通过培养皿盖对点种培养物进行成像。
14. 在皱褶菌落形成开始后的每个时间点，记录皱褶菌落发育的模式。菌落结构可能由内向外发展，或由外向内发展。该评估可为区分不同菌株或不同条件下形成的生物膜提供依据。
15. 在每个时间点测量菌落的直径。该操作可手动完成，也可使用配套软件进行数字化测量。若采用数字化方法，使用 ProgRes CapturePro 软件，首先根据实验中使用的特定放大倍数校准标尺。在每张采集的图像中均需包含标尺。
16. 使用 ImageJ 软件计算菌落直径时，打开每张图像文件。标准化比例尺的方法如下：从工具栏中选择“直线工具”，用一条与嵌入的比例尺长度和宽度相同的直线覆盖该比例尺。点击“分析”标签下的“设置比例尺”选项，在“已知距离”框中输入相应长度（根据原始比例尺确定，例如 2 mm），然后点击“确定”。
17. 使用“直线”工具在斑点处绘制一条水平线。在“分析”选项卡下，选择“测量”。在新出现的“结果”窗口中，将显示计算出的长度。通过在斑点处绘制一条垂直线，获取第二次测量值。重新计算直径。记录两次测量的平均值。使用Excel等软件程序，绘制每个时间点各斑点的平均直径图。
18. 实验结束于指定时间点，或生物膜不再进一步发育时。达到终点后，使用Powerpoint等软件将图像整合成图，以展示生物膜随时间推移的模式发育过程。

3. 代表性结果

在这些实验中，我们使用V. fischeri作为模式生物，通过评估其在固体琼脂表面形成皱褶菌落的过程来研究生物膜的形成。产生物膜的V. fischeri菌株在接种后40小时内即可形成具有复杂三维结构的菌落（图1）^8,9,14。通过时间进程观察可以发现，对照菌株的皱褶菌落形成最早在接种后约12小时开始（具体时间取决于实验条件）（图2）⁹。相比之下，代表性突变菌株的生物膜形成延迟约4小时，直到接种后约16小时才开始⁹。这些实验的重复结果表明，该时间进程相对稳定，使该评估具有半定量性质⁹。另一种用于评估生物膜形成的半定量方法是测量菌落随时间推移的直径变化。如图3A所示，代表性生物膜形成能力正常的菌株所形成的菌落，其复杂性和直径均大于代表性非生物膜形成菌株。对这两种菌株形成的菌落直径进行随时间的精确测量后发现，生物膜形成能力正常菌株的菌落增长速率明显快于不能形成生物膜的菌落，至实验终点时两者直径相差近2倍（图3B）。因此，尽管文献中通常仅展示代表性晚期或“终点”时间点的菌落形态图像，但还可收集额外的半定量数据，以更深入地理解生物膜形成的缺陷。

图1. 终点分析实验。该图展示了利用代表性非生物膜形成（左侧）和生物膜形成（右侧）的V. fischeri菌株进行终点分析实验的示例。这些图像采集于点样后40小时。图像来源于野生型V. fischeri，分别携带空载体对照（非生物膜形成）或rscS过表达质粒（生物膜形成），属于Morris et al., 2011年研究中收集的数据集的一部分。

图2. 时间进程实验。上图显示了具有成膜能力的V. fischeri对照菌株在选定时间范围内形成生物膜的代表性图像。生物膜形成的起始在12小时时已明显可见。下图显示了一株V. fischeri突变菌株的代表性图像，该菌株在皱褶菌落形成的时间上存在延迟（延迟4小时），生物膜形成始于接种后16小时。需要注意的是，在40小时时，两株菌在生物膜形成的强度和模式上看起来相似，而菌株间的细微差异仅在较早的时间点可被观察到。这些图像由过表达rscS的野生型和sypE突变型V. fischeri细胞生成，是Morris et al., 2011年所收集数据集的一部分。

图3. 菌落直径作为生物膜形成的半定量分析。（A）代表性生物膜形成型（上图）和非生物膜形成型（下图）V. fischeri菌株的生物膜形成时间进程。注意，与非生物膜形成菌株相比，生物膜形成菌株随时间推移菌落直径增长更显著。这些图像来自Morris et al., 2011年研究中所用的野生型V. fischeri菌株，分别携带rscS过表达质粒（生物膜形成型）或空载体对照（非生物膜形成型），并属于该研究数据集的一部分。（B）A图中两种菌株随时间推移菌落直径增长的图形化表示。这些数据按照本实验方案所述，使用ImageJ和Excel软件生成。

讨论

在本研究中，我们描述了一种利用V. fischeri作为模式生物评估生物膜形成的半定量方法。具体而言，我们使用配备相机的体视显微镜，在固体琼脂表面通过观察随时间推移形成的皱褶菌落来监测生物膜的形成与发育过程。在本实验方案中，我们概述了两种常用于评估皱褶菌落形成的方法。第一种是终点检测法，该方法可使我们观察在选定的“最终”时间点上点种培养物的最终三维结构、形态模式及菌落直径。该方法最适用于评估导致生物膜形成出现显著缺陷的突变株或实验条件。然而，该方法无法区分在所选终点之前各时间点发生的较细微差异。为了更密切地监测皱褶菌落的形成过程，我们采用时间进程检测法，该方法可帮助我们确定皱褶菌落形成的起始时间，并持续观察其随时间的发育情况。通过该方法，可识别出皱褶菌落形成在时间进程、三维结构及形态模式上的更细微差异。我们利用该时间进程检测法建立了两种生物膜形成的半定量分析方法。第一种方法是将某一菌株开始形成三维结构的时间与对照菌株进行比较。我们发现，在相同条件下，特定突变株在生物膜形成上的延迟具有较好的一致性⁹。例如，在图2所示的数据中，该突变株在启动生物膜形成时始终存在约4小时的延迟。第二种生物膜形成的半定量指标是皱褶菌落（点种菌落）直径的动态变化。我们发现，皱褶菌落的直径随时间逐渐与非生物膜菌落产生差异，在实验终点时达到约2倍的差异（图3）（Morris 和 Visick，未发表数据）。迄今为止，我们尚未观察到仅出现其中一种表型而另一种缺失的情况（即形成生物膜但菌落直径未增加）（未发表数据），尽管仍有可能某些突变株表现出不同的行为。事实上，已有文献报道在V. cholerae中，某些皱褶菌落会导致菌落直径显著增加，而另一些则不会¹⁵。尽管如此，评估菌落直径随时间的变化仍有助于鉴定潜在的生物膜突变株，或为发育延迟的突变株提供额外的定量评估指标。在上述两种生物膜形成的评估指标（时间与直径）中，确定皱褶菌落形成的起始时间比测定菌落直径更为敏感，但也更具主观性。即便如此，这两种方法均可对一种对生物膜研究者极为重要但难以直接定量的表型提供半定量评估。

在进行点种培养实验时，需要考虑点种菌株培养所处的环境条件。菌落皱褶的形成通常受到多种环境因素的影响，包括营养物质的可利用性、温度和湿度。为了减少实验间的差异，尽可能标准化这些条件非常有帮助（例如，将琼脂平板的体积固定，并在受控温度下培养点种菌株）。为进一步控制点种实验之间的变异性，每次实验都应包含适当的对照菌株。最后，在解读此类实验数据时，必须对任一实验重复多次（至少3次），尤其是在评估皱褶菌落形成的细微差异时（例如，生物膜形成延迟或模式差异）。本实验方案存在一些局限性：1）判断细胞是否存在生长缺陷可能较为困难：液体培养中的细胞生长情况可能无法准确反映其在固体培养基上的生长速率，而对于可能聚集在一起的生物膜形成细胞，其生长情况的准确测定可能无法实现；2）具有生长缺陷的菌株在分析上会带来困难；3）可能难以区分具有细微生物膜表型差异的菌株之间的直径差别；4）对于不能形成同心环状生长的菌株，可能无法准确测量其直径变化；5）尽管在生物膜形成过程中可以观察到模式特征，但目前尚无方法对最终生物膜的模式进行量化；6）在此实验设置下，无法测量生物膜的Z轴维度。尽管存在这些局限性，该方案仍提供了一种获取数值数据的方法，有助于评估皱褶菌落的形成情况。

在本实验方案中，我们使用特定的成像系统（即蔡司体视显微镜和 ProgRes CapturePro 成像软件）来观察和评估皱褶菌落的形成。此处描述的成像系统功能强大：通过使用体视显微镜，能够更灵敏地检测皱褶菌落形成的起始阶段，从而以时间进程的方式评估其发育过程。然而，若该设备不可用，本方案也可根据其他设备进行调整，例如使用带有变焦功能的普通数码相机。尽管本方案重点在于评估皱褶菌落的发育，但也可修改用于评估菌膜（pellicle）的形成，即细胞在静止液体培养中生长时形成的一种生物膜。本方案还可用于评估生物膜形成的其他指标，例如在点样菌落发育过程中掺入特定染料的情况。这些染料包括但不限于刚果红和荧光增白剂（calcofluor），它们可结合纤维素——这是细菌生物膜的常见组分¹⁶。此外，本方案虽最初为 V. fischeri 设计，但并不局限于该生物体，也可推广应用于研究多种不同生物体的生物膜形成，例如 Bacillus subtilis ⁴、Vibrio cholerae ⁵、Vibrio parahaemolyticus ⁶ 和 Pseudomonas aeruginosa ⁷，这些生物均表现出皱褶菌落的形成。最后，该方案还可进一步调整用于研究具有发育模式的其他菌落形态，例如 Myxococcus xanthus 生长过程中可能出现的模式形成¹⁷，以及 Pseudomonas aeruginosa 中气生结构的发育¹⁸。因此，本方案对微生物学和生物膜研究领域的科研人员具有广泛的适用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蔡司Stemi 2000-C体视显微镜	Carl Zeiss, Inc.	45505300000000000	（通过Lukas显微镜获得）
ProgRes C10PLUS	JENOPTIK光学系统有限公司	017953-602-26	相机附件（通过Lukas显微镜获得）
CL 1500 EC冷光源	Carl Zeiss, Inc.	4355400000000000	（通过Lukas显微镜获得）
ProgRes CapturePro	JENOPTIK光学系统有限公司	随注册相机提供的免费软件	用于图像采集的计算机程序
Image J	美国国立卫生研究院	免费软件，下载地址： http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html	用于直径测量的计算机程序