将胰岛移植到糖尿病小鼠的肾包膜下

摘要

本方案旨在小鼠肾包膜下清晰、简便地移植胰岛或细胞。细胞在最终用于移植的导管中被浓缩成团。该技术操作简便，可减少对细胞和小鼠造成的应激损伤。

摘要

本方案旨在干净、简便地将胰岛或细胞移植到糖尿病或正常小鼠的肾包膜下。我们发现，在用于将细胞移植至肾包膜下的最终输送导管（PE50）中，将胰岛或细胞浓缩成团粒更为方便。该技术既提高了操作速度，又简化了步骤，同时减少了对细胞或小鼠造成的不必要应激。

加载：使用P200移液器和直型薄壁移液器吸头，小心地从1.5 mL微量离心管底部吸取已沉降、经手工挑选的胰岛或细胞沉淀。用一小段硅胶连接管将一段PE50管连接至移液器吸头。细胞在吸头内沉降后，通过缓慢调节移液器旋钮将细胞转移至PE50管中。当细胞接近PE50管末端时，将其弯折形成一个结，并将硅胶连接管套在结上固定。将PE50管转移至含有截断的5 mL移液管的15 mL锥形管中，并用胶带将PE50管固定在5 mL移液管侧壁，以防止离心过程中管子卷曲。使细胞达到1,000 rpm后停止离心。

移植：将受体小鼠麻醉后剃毛并清洁。在小鼠左侧 flank 部位做一小切口，暴露肾脏。用生理盐水浸湿的棉签保持肾脏、脂肪和组织湿润。将 PE50 管的远端通过硅胶连接管与装有移液枪头的 Hamilton 螺旋驱动注射器相连。在肾脏右侧 flank 部位做一个小切口，切口不宜过大或过深。将 PE50 导管的斜面端（靠近细胞的一端）小心地插入肾包膜下方，同时轻柔移动导管以开辟空间，并持续用生理盐水湿润；干燥的包膜容易撕裂。通过缓慢旋转注射器螺旋驱动装置，将一小段空气气泡注入包膜下。随后，胰岛细胞缓慢随气泡之后注入。胰岛注射完成后，保持肾脏稳定，并用低温电灼封闭切口。将肾脏复位至腹腔内，缝合腹膜并用钉合器关闭皮肤。小鼠立即皮下注射氟尼辛和丁丙诺啡，并置于带有加热垫的笼中恢复。

方案

移植（Tx）用胰岛的制备

1. 在倒置显微镜下，使用P200移液器和直头吸头从100 mm培养皿中培养的胰岛中手工挑选胰岛。
2. 每100个胰岛计数一次，并转移至各微量离心管中（约500个胰岛/管/小鼠）。
3. 让胰岛自然沉降到微量离心管底部。
4. 使用细壁直头吸头，将一个胰岛沉淀吸入P200移液器（设定体积为130 µL）。
5. 在注射器尖端套上硅胶管接头，将一段PE50导管插入硅胶接头中。
6. 将移液器悬挂在生物安全柜侧边，并用胶带将PE50导管固定在柜壁上，使其高于移液器尖端内的胰岛，从而使胰岛仅沉降在移液头尖端部分。
7. 通过缓慢调节移液器旋钮，将胰岛缓慢转移至PE50导管中， 注意 不要将胰岛从导管末端推出。
8. 将PE50导管的斜面端弯折形成折角。在保持折角状态下，将硅胶接头导管从移液器上取下，并用硅胶接头固定该折角。
9. 将含有胰岛的PE50导管（折角端朝下）放入装有剪去头部的5 mL移液管的15 mL锥形离心管中，并用胶带将PE50导管固定在5 mL移液管侧壁，以防止离心过程中PE50导管卷曲。
10. 将装有PE50导管的15 mL锥形管以1000 rpm离心后关闭离心机。（每次处理的胰岛样本不得超过10份）。
11. 将离心管置于冰上。

小鼠移植前准备

1. 使用异氟烷或氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠（参见制备方案）。
2. 麻醉生效后，剃除小鼠左侧 flank 部位的毛发。
3. 用聚维酮碘棉签由中心向外擦拭小鼠皮肤，然后用乙醇棉签擦去残留碘液。
4. 定位左肾（位于脾脏稍右侧），在皮肤上做一个小切口，暴露腹膜。
5. 在腹膜上做一小切口以暴露肾脏。保持切口较小有助于使肾脏隆起并充分暴露。
6. 轻轻按压切口两侧，将肾脏抬起或挤出体外。
7. 用棉签蘸取生理盐水定期润湿肾脏，保持其湿润。
8. 使用23或25号针头的注射器，在肾脏右侧 flank 部位轻轻划一下，造成肾包膜轻微破损；注意划痕不宜过深或过大。

胰岛移植

注意：在准备小鼠进行 Tx 的同时，第二位操作人员应准备 Hamilton 螺旋驱动胰岛移植注射器。

1. 在保持 PE50 管道弯曲状态的同时，缓慢将硅胶连接管从 PE50 管道上取下。
2. 将 PE50 管道的另一端插入硅胶连接管中，并将硅胶连接管套在连接于“螺旋驱动”玻璃 Hamilton 注射器的移液枪头末端。缓慢松开 PE50 管道的弯曲部分，确保胰岛不会泄漏。
3. 使用“螺旋”装置缓慢推动胰岛向 PE50 管道末端移动，但在胰岛前方的 PE50 管道中保留一个小的气泡。
4. 将 PE50 管道小心地通过肾脏上的切口插入肾包膜下方，形成一个小囊袋。操作时务必小心，避免刮伤肾脏或刺穿包膜。
5. 使用浸有生理盐水-庆大霉素的棉签保持手术区域和包膜湿润；干燥的包膜容易撕裂。
6. 轻柔地向各个方向移动管道，为移植的胰岛创建一个“囊袋”。注意需反复补充生理盐水以保持区域湿润。
7. 在打开小鼠并已将 PE50 管道插入肾包膜下的操作者指导下，另一位准备小鼠和 Hamilton 移植注射器的操作者应缓慢推动胰岛，使其在 PE50 管道输送的小气泡推动下进入包膜下的“囊袋”内，直至所有胰岛完成移植。
8. 缓慢撤出 PE50 管道，用干燥棉签擦干区域，并用低温电灼仔细封闭切口。
9. 使用干燥的棉签确认出血已完全停止。一旦止血完成，用无菌生理盐水重新润湿肾脏，并 在缝合线和皮肤钉合关闭小鼠前，轻柔地将肾脏复位至腹腔内。

小鼠的安乐死/复苏

1. 使用带C-6 19mm针头的5-0丝线连续缝合关闭腹膜。
2. 用镊子将皮肤切口两侧对合。
3. 用 2 到 3 个皮钉将皮肤缝合。
4. 用棉签蘸取生理盐水，清除小鼠皮肤上的血液。
5. 立即对小鼠进行氟尼辛和丁丙诺啡的皮下注射治疗。
6. 将小鼠放入笼中，该笼 将小鼠置于加热垫上或加热灯下，直至其完全恢复活动。
7. 2 周后拆除皮肤缝合钉。

讨论

本方案为在糖尿病或正常小鼠的肾包膜下干净、简便地输送胰岛或细胞提供了一种实用且高效的选择。该技术将胰岛或细胞浓缩并离心至最终用于移植的递送导管（PE50）中，从而在减少对细胞或小鼠造成不必要应激的同时，实现简便而有效的细胞移植。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
外科手套	Fisher Scientific	11-394-95(sz)
手术刷洗海绵	Moore Medical	42940AK
镊子	Miltex Inc.	6-114 和 6-26	2 把带齿，2 把直型
解剖剪刀 n=2	Miltex Inc.	5-290
Oster 剃毛刀（40 号刀头）	Fisher Scientific	01-305-10B
4×4 无菌纱布垫	Moore Medical	08252AK
聚维酮碘消毒垫	Moore Medical	08486AK
酒精棉片	Fisher Scientific	14-819-2
加热垫	Moore Medical	42508AK
23G 或 25G 针头			1" 长
Cidex 溶液	Moore Medical	07535AK	用于器械清洁/消毒
PE50 聚乙烯导管	BD Biosciences	427411	PE50，外径 0.965 mm × 内径 0.58 mm
Cidex + 28 天溶液	Moore Medical	35625AK
硅胶导管	Spectrum Chromat.	123732	5/32” 外径 × 1/32” 内径
器械灭菌容器	Moore Medical	39074AK
直头移液器吸头	USA Scientific, Inc.	1111-0810	无菌
带螺杆驱动的玻璃注射器	Hamilton Co	1001
电灼器	Roboz Surgical Instruments Co.	RS230
持针器	Moore Medical	41-067
5-0 丝线	LOOK Surgical	754B	用于缝合（6-C）
棉签	Moore Medical
9 mm 自动缝合器	BD Biosciences	7630
9 mm 缝合钉	BD Biosciences	7631
9 mm 缝合钉拆除器	BD Biosciences	7637