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揭示复杂脑部拓扑结构的全脑免疫组织化学染色法

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DOI：

10.3791/4042

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2012年4月5日

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1Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University , 2Department of Cell Biology and Anatomy and the Hotchkiss Brain Institute, Faculty of Medicine, University of Calgary

本文内容

摘要

神经回路在功能区室中具有拓扑性组织，并具有特定的分子特征。本文提供了利用一种通用的全脑免疫组织化学染色方法揭示全脑拓扑结构的实用与技术步骤。我们以小脑经典的细胞构筑和神经环路为例，展示了该方法的应用价值。

摘要

小脑具有重复且结构清晰的细胞架构，是研究脑拓扑结构的理想模型系统。在其相对均一的细胞结构之下，存在着一系列复杂的矢状旁域，表现出基因与蛋白质表达的多样性。小脑的分子分区特征在传入纤维的解剖与功能组织中得到对应体现。为了全面理解小脑组织的复杂性，我们此前优化了一种适用于高通量分析小鼠小脑发育模式缺陷的全脑染色方法。本实验方案详细描述了在成年小鼠小脑中成功实现全脑免疫染色以揭示蛋白质表达模式所需的试剂、工具及具体操作步骤。文中重点展示的步骤以zebrinII/aldolaseC的表达为例，说明该方法如何在保持脑组织天然三维构象的前提下揭示精细的脑拓扑结构。此外，还介绍了对原方案的若干改进，使其可用于观察传入投射中的蛋白质表达以及适用于较大体积的小脑样本，从而支持分子拓扑结构的比较研究。为说明这些应用，文中包含了对大鼠小脑传入纤维染色的实验数据。

方案

1. 动物灌注与小脑解剖

  1. 根据蛋白质的不同，灌注对于成功染色可能至关重要1,2经心脏灌注是一种侵入性、非存活性操作，需要正确使用麻醉剂。在进行该操作前，必须接受适当培训，并获得机构批准和实验动物管理与使用委员会（IACUC）的批准。建议始终咨询机构的兽医，以协助明确实验要求并获取正确的培训。操作前应确保动物已处于深度麻醉状态，对足部或尾部夹捏等刺激无反应。使用剪刀切开腹部皮肤和肌层，随后沿两侧胸骨旁剪开以暴露肋骨腔。此外，实验人员可通过剪开膈肌周围的筋膜来扩大内部操作空间。将腹壁和胸壁向上提起，即可暴露心脏。在右心房做一小切口以使血液流出，随后立即将灌注针插入左心室。推荐使用基本的重力静水压泵来输送灌注液（参见 表1 详情见）。首先用 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（PBS，见 表3）直至液体变澄清。然后关闭水压泵，迅速将溶液输送管切换至含有4%多聚甲醛（PFA，见 表3）用 PBS 稀释后，重新启动泵以输送固定液。使用泵并非必需：经过练习后，可使用两支分别装有 PBS 和 4% PFA 的注射器缓慢注入溶液。
  2. 仔细将脑组织从颅骨中解剖出来而不对组织造成任何损伤至关重要。即使在解剖过程中对脑组织造成微小的撕裂，也会逐渐扩展为明显的裂隙，这些裂隙会滞留抗体，从而在组织处理过程中导致人为假象的染色（例如，图中红色星号所示）。 图 2）。对于小脑解剖，通常从头部正中切开皮肤，然后轻轻分开皮瓣以暴露颅骨。沿颅骨背侧中线从前向后剪开，同时在颅骨两侧进行横向剪切。注意不要超过前囟点，以免损伤小脑。使用镊子轻轻将颅骨前部从脑组织上掀起，注意避免撕扯附着于脑膜的脑组织。在脑腹侧切断颅神经。
  3. 将小脑与脑的其余部分分离具有两个重要意义。首先，该操作能够暴露前部小叶，以便观察其表达模式，而这些区域在未分离时被四叠体遮挡而无法直接观察 原位第二，将组织分离成更小的独立区域有助于更彻底地固定，从而促进某些蛋白质的染色。在整个最终解剖步骤中，应避免用镊子尖端接触小脑。将一对镊子的尖端插入上丘与下丘的中部位置，用另一对镊子缓慢地将下丘从小脑上剥离。随后，将小脑放置，使其前侧朝下，脑干朝上。将镊子插入脑干与小脑第IX/X小叶之间的第四脑室区域，用镊子从两侧夹断小脑脚，然后轻轻将小脑从小脑干上分离。小脑分离后，将其浸入4% PFA中进行后固定 4 °C 至少放置 24–48 小时。小脑可在 4% PFA 中长期保存。为更清晰地观察表达模式，应在染色前或染色后去除软脑膜。若实验者选择在染色前去除软脑膜，则在操作过程中极易损伤小脑。而在染色程序结束后再剥离软脑膜则更为简便，因为经过染色和后续处理，软脑膜会呈现微弱的背景染色且变得脆弱，更易于识别和去除。

2. 组织样本的全组织染色处理

由于整体染色法所需时间长于组织切片的免疫组织化学染色，因此建议参考所提供的示例日历（表2）为每个实验规划时间表。在开始之前，需牢记以下几点关键事项：1）除冻融过程外，含有组织的微量管应始终在旋转摇床（nutator）上持续旋转。2）多种溶液需在每次实验前新鲜配制（溶液配方见表3）。3）在整个实验流程中，更换溶液时应轻柔倾倒废液，避免使用镊子夹取小脑组织，以防触碰损伤；随后，在另一容器中混匀新溶液，再用移液器将其轻柔加入微量管中。

2.1 第1天：

  1. 在室温下，将小脑置于 Dent's 固定液3中，在振荡器上轻轻摇动固定 6–8 小时。如果甲醇对您的抗原具有破坏性，可考虑用抗原修复方法替代步骤 2.1a 至 2.3a。抗原修复所用的加热和缓冲液有助于组织充分暴露，便于抗体渗透。
  2. 在 4 °C 条件下，将小脑置于 Dent's 漂白液3中过夜漂白。

2.2 第2天：

  1. 在室温下用两轮100%甲醇（MeOH）对小脑组织进行脱水，每轮30分钟。
  2. 随后，为增强溶液的渗透性，对组织进行一系列冻融循环。将离心管小心放入装有干冰的容器中，冷冻30分钟；然后取出离心管，置于室温下解冻15分钟。此冻融步骤应至少重复四次。
  3. 组织最后一次解冻后，将离心管放入-80 °C超低温冰箱中过夜。
  4. 组织可在-80 °C条件下长期保存，保存时间点可选择在冻融步骤之前或之后立即进行；否则，应继续后续实验步骤。

2.3 第3天：

  1. 将小脑在50% MeOH/50% PBS、15% MeOH/85% PBS 和 100% PBS 中依次洗涤，每步60-90分钟，室温下进行以实现再水化。
  2. 接下来，对于成年小鼠的小脑组织，使用含10 μg/mL蛋白酶K的PBS溶液进行酶消化处理2-3分钟。对于幼龄动物（小鼠P5或更小）的小脑，则无需进行消化步骤。对于较大的脑组织，建议延长消化时间。例如，灵长类动物脑组织的消化时间可延长至5-6分钟4。
  3. 消化后，立即用PBS洗涤小脑组织三次，每次10分钟，室温下进行，以彻底去除残留的蛋白酶K。
  4. 在4 °C条件下，用PMT封闭液（见表3）封闭组织过夜。在蛋白质相关实验中，脱脂奶粉通常是首选封闭剂，因其成本低廉、能有效降低背景染色，且通常不会干扰抗体与抗原的结合或接近。也可使用动物血清作为封闭剂，但实验者需注意其额外成本，并应预先检测血清中是否存在交叉反应性免疫球蛋白，以及其是否能够产生理想的信噪比。

2.4 第4-5天：

  1. 将组织在含有5% DMSO的PMT中与一抗稀释液于4 °C孵育48小时（较大的小脑组织需要更长的孵育时间）。

2.5 第6天：

  1. 用 PMT 在 4 °C 下洗涤小脑 2-3 次，每次 2-3 小时，以去除未结合的一抗。
  2. 然后，在含有 5% DMSO 的 PMT 溶液中加入二抗，于 4 °C 过夜孵育（较大的小脑可能需要延长孵育时间）。

2.6 第7天：

  1. 在 4 °C 条件下，用 PMT 溶液洗涤小脑组织 2-3 次，每次 2-3 小时。
  2. 用 PBT 溶液（见表 3）对组织进行最后一次洗涤，持续 1-2 小时。此步骤可去除多余的脱脂奶粉，提高染色清晰度。
  3. 最后，将组织置于 DAB（3,3'-二氨基联苯胺）溶液中孵育，直至达到最佳染色强度。棕色反应产物通常在约 10 分钟内清晰可见。最好在避光条件下使用 DAB，因为光照会导致显色剂沉淀，从而增加背景染色。

2.7

当达到最佳染色强度时，将小脑置于含有0.04%叠氮化钠的PBS中以终止反应。组织样本可在该溶液中长期保存。叠氮化钠是强效的细菌生长抑制剂，但因其同样会抑制辣根过氧化物酶活性，故应仅在此步骤后使用。

2.8 可选扩增步骤：

遵循正常方案，但需用以下步骤替代上述步骤 2.5b-2.7。

  1. 将组织在含有5% DMSO的PBST中，于4 °C下与生物素标记的二抗共同孵育过夜（参见表3）。
  2. 在室温下，用PBST更换3-4次，每次冲洗组织2-3小时。
  3. 将小脑在含有ABC复合物的PBST溶液中，于4 °C下孵育过夜。
  4. 在室温下，用PBS更换3-4次，每次冲洗组织2-3小时。
  5. 将组织置于上述方法中所述的新鲜配制的DAB溶液中孵育。
  6. 当染色达到最佳状态时，用含0.04%叠氮化钠的PBS洗涤小脑以终止反应。

3. 染色组织成像

  1. 可以使用例如安装在 Leica MZ16 FA 体视显微镜上的 Leica DFC3000 FX 相机，并配合运行 Leica Application Suite FX 软件来获取整体样本图像。如需要，可采用去卷积显微技术，在不同焦平面上连续采集多幅图像，每幅图像仅使单个小叶清晰对焦。随后，可将这些图像压缩为单一图层堆栈，并通过软件渲染去除畸变。最终的合成图像将清晰展示小脑表面的表达模式，所有可见的结构模式均处于清晰对焦状态。
  2. 整体染色组织应在浸没于 PBS（或具有最佳折射率的其他介质）中时进行成像。为便于将整体样本定位以进行成像，可在塑料培养皿中制备1%琼脂糖凝胶，并在凝胶中切割出小孔。这些小孔可使小脑被嵌入并固定在所需的方向。
  3. 原始数据导入 Adobe Photoshop CS4，并调整对比度和亮度水平。

动物

所有动物实验均根据阿尔伯特·爱因斯坦医学院的机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案，依照机构指南进行。实验所用的雄性和雌性远交系瑞士韦伯斯特小鼠（Swiss Webster，Taconic，Albany，NY）均维持于本实验室种群中，并用于所有研究。安乐死处理的成年大鼠由阿尔伯特·爱因斯坦医学院的Bryen Jordan博士慷慨提供。所有实验动物年龄均不少于一个月。

4. 代表性结果

小脑根据分子表达模式被划分为四个横向区域：前区（AZ：约小叶 I-V）、中央区（CZ：约小叶 VI-VII）、后区（PZ：约小叶 VIII-背侧 IX）和结节区（NZ：约小叶 IX 腹侧和 X）5。每个区域均包含一组独特的旁矢状条带1,2,5,6 (图 1). 普肯耶细胞中 ZebrinII 的表达揭示了前区（AZ）和后区（PZ）中的条带结构图 2）以及在CZ和NZ中表达的均一性（图 2）。浦肯野细胞的旁矢状面排列方式在传入纤维的终末区拓扑结构中得到映射。可卡因和安非他明调节转录（CART）肽在部分攀爬纤维中表达图 3a投射至小脑皮层分子层中浦肯野细胞树突条带的结构7 (图 3b）。通过适当的修改，例如扩增7，该全组织染色方案能够可视化橄榄-小脑通路的投射模式，无需通过繁琐且耗时的组织切片染色重建过程。图 3b).

组织学切片，小脑皮层，细胞层分布，显微结构分析。
图 1. A. ZebrinII/aldolaseC 的表达在小脑横切面上显示出矢状带状结构。比例尺 = 500 μm。B. ZebrinII/aldolaseC 仅在浦肯野细胞的胞体和树突中表达。比例尺 = 150 μm（gl = 颗粒层；pcl = 浦肯野细胞层；ml = 分子层）。

小脑切片示意图，标注了小脑分区及解剖区域，用于神经解剖学研究。
图 2. 经ZebrinII/醛缩酶C染色的小脑全脑标本，显示小脑前区（AZ）、中央区（CZ）和后区（PZ）的浦肯野细胞条带。图中还展示了损伤小脑所导致的负面影响示例：损伤引起的染色假象以红色星号标示。比例尺 = 1 mm（LS = 单一小叶；PML = 旁正中小叶；COP = 锥体结合部）。

组织学切片与解剖图像；显微镜检查、细胞结构、生物体解剖结构。


图3. A. CART 在分子层的攀爬纤维末梢中表达。比例尺 = 100 μm（ml = 分子层；pcl = 普肯耶细胞层；gl = 颗粒层）。B. NZ中CART表达的全脑免疫组织化学染色。比例尺 = 2 mm（COP = 锥体联合；PML = 旁正中小叶；PFL = 副绒球；FL = 绒球）。

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讨论

我们已阐述了利用一种通用的免疫组织化学方法对发育中和成年脑组织进行整体染色以成功显示蛋白质表达所需的技术细节。通过该方法，无需繁琐且耗时的组织切片步骤，即可分析复杂的分子表达模式并理解脑部拓扑结构。

该方案已被用于揭示成年1,2,8,9和出生后早期小鼠小脑10,11,12中多种浦肯野细胞蛋白的条带状表达模式。我们最初的研究还证明了整体染色法在检测颗粒细胞抗原表达1以及顺行示踪位于颗粒层、距软脑膜表面约250 μm深处的苔藓纤维2方面的实用性。此外，已有若干研究对原始方案进行了改进，以成功实现浦肯野细胞1,13（抗原修复）和传入纤维7,14（信号放大；图2）中蛋白的染色。整体免疫组织化学染色技术还已被应用于多种哺乳动物4,15和鸟类16,17的小脑，用于绘制神经退行性疾病小鼠模型中浦肯野细胞丢失的图谱18,19，并被修改后用于心脏20...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

RVS 由叶史瓦大学阿尔伯特·爱因斯坦医学院的青年研究者启动资金支持。

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参考文献

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Zeb rinII C K DAB

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