单卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析

摘要

亚硫酸氢盐突变是分析DNA甲基化的金标准。我们改进的方案可实现单细胞水平的DNA甲基化分析，专为单个卵母细胞设计，也可用于卵裂期胚胎。

摘要

表观遗传学涵盖所有可遗传且可逆的染色质修饰，这些修饰会改变基因的可及性，因此是调控基因转录的主要机制¹。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，主要发挥抑制性标记的作用。通过在CpG二核苷酸中的胞嘧啶上共价添加一个甲基基团，DNA甲基化能够招募其他抑制性蛋白和组蛋白修饰，从而启动染色质压缩和基因沉默相关的过程²。DNA甲基化对正常发育至关重要，因为它在发育编程、细胞分化、逆转录病毒元件的抑制、X染色体失活以及基因组印记中发挥关键作用。

DNA甲基化分析最强大的方法之一是亚硫酸氢盐诱变法。亚硫酸钠是一种DNA诱变剂，可将胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。经过PCR扩增和测序后，这些转化事件被检测为胸腺嘧啶。甲基化的胞嘧啶则受到保护而不发生脱氨反应，因此仍保留为胞嘧啶，从而能够在单个核苷酸水平上识别DNA甲基化状态³。亚硫酸氢盐诱变检测技术自最初报道以来^4-6，已逐步发展为更敏感、更可重复的方法⁷。其中一项关键改进是将少量DNA包埋于琼脂糖微珠中，从而保护DNA免受剧烈的亚硫酸氢盐处理⁸。该改进使得对卵母细胞群和囊胚期胚胎进行甲基化分析成为可能⁹。迄今为止最先进的亚硫酸氢盐诱变方案适用于单个囊胚期胚胎¹⁰。然而，由于囊胚平均含有64个细胞（包含120–720 pg基因组DNA），该方法在单个卵母细胞或卵裂期胚胎的甲基化研究中效果不佳。

借鉴琼脂糖包埋微量DNA（包括卵母细胞）的方法¹¹，本文介绍一种在卵母细胞取出并去除透明带后，立即将其直接包埋于含有裂解液的琼脂糖凝胶微珠中的技术。该方法使我们能够克服单个卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析中的两个主要难题：防止微量DNA降解，以及在多步实验流程中发生样本丢失。尤为重要的是，由于数据来源于单个卵母细胞，因此避免了混合样本中可能存在的PCR扩增偏好性问题。此外，该方法还可检测到意外的卵丘细胞污染，因为任何含有多种甲基化模式的样本均可被排除在分析之外¹²。本实验方案提供了一种更优的技术，可实现对DNA甲基化状态在单细胞水平上的成功且可重复的分析，特别适用于单个卵母细胞以及卵裂期胚胎的研究。

方案

第1天

在取卵当天，使用无菌蒸馏水（如GIBCO水）新鲜配制以下溶液。为降低DNA污染的风险，应频繁更换手套，并使用带滤芯的吸头。打开管盖时，保持离心管倾斜放置，不使用时应及时盖紧管盖。建议将溶液按n+1的量配制。

3% LMP 琼脂糖

30 mg 低熔点琼脂糖（LMP Agarose）
最多 1 ml GIBCO H₂O
在 70 °C 下溶解

裂解液

8 μl 裂解缓冲液
1 μl 蛋白酶K
1 μl 10% IGEPAL
置于冰上，待用时取出

2:1 琼脂糖裂解液 (10 μl 每个卵母细胞（以3个卵母细胞为一份）

20 μl 3% LMP 琼脂糖
10 μl 裂解液
在 70 °C 下混匀

SDS 裂解缓冲液（每个卵母细胞 501 μl）

....

1x TE pH 7.5

讨论

该单个卵母细胞检测包含多个步骤，其中一些步骤尤为关键，需特别小心。首先是卵母细胞的洗涤。在透明质酸酶处理后，用新鲜培养液液滴多次充分洗涤每个卵母细胞，以尽可能去除所有卵丘细胞，这一步尤为关键。此外，在将卵母细胞转移至酸性泰罗德溶液以去除透明带时，务必确保周围液滴中无残留卵丘细胞。去除透明带后卵母细胞具有很强的黏性，任何残留的卵丘细胞都可能轻易黏附于卵母细胞表面。一旦卵丘细胞黏附到无透明带的卵母细胞上，将极难去除。尽管本实验方案可在后续时间点检测到卵丘细胞污染，但对最终可能被弃用的卵母细胞完成全部实验流程既无必要，也不经济。

第二个关键步骤是卵母细胞包埋。在将卵母细胞包埋于琼脂糖和裂解液中时，需要注意低熔点（LMP）琼脂糖在温度比70 °C仅低5 °C时便会凝固。因此，我们建议在70 °C下混合琼脂糖和裂解液，然后将单个卵母细胞置于载玻片上的最小量培养基中。准备就绪后，用移液器吸取琼脂糖/裂解液，迅速而谨慎地将卵母细胞包埋至预先准备好的离心管中，并置于矿物油下。

蛋白酶K的热失活必须在90 °C下进行2.5分钟，这一点至关重要。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
卵母细胞采集
透明质酸酶	Sigma	H4272
酸性泰罗德液	Sigma	T1788
蛋白酶K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
裂解液
Tris pH 7.5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650
EDTA pH 8.0	Sigma	E5134
LiDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS裂解缓冲液
TE pH 7.5	Bioshop(Tris)Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
亚硫酸氢盐转化
氢氧化钠	Sigma	S8045
亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）	Sigma	243973
对苯二酚	Sigma	H9003
低熔点（LMP）琼脂糖	Sigma	A9414
矿物油	Sigma	M8410
M2培养基	Sigma	M7167
GIBCO蒸馏水	Invitrogen	15230-196
高压灭菌的双蒸水（dd水）
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng/ml 酵母tRNA	Invitrogen	15401-011
内外嵌套引物	Sigma
连接
Promega pGEM-T Easy载体	Fisher Scientific	A1360
TA克隆
感受态E.coli细胞	Zymo Research Corp.	T3009
设备
解剖显微镜
70 °C 和 90 °C 恒温金属浴
37 °C 和 50 °C 水浴锅（转化用42 °C）
摇床
PCR仪