亚硫酸氢盐突变是分析DNA甲基化的金标准。我们改进的方案可实现单细胞水平的DNA甲基化分析，专为单个卵母细胞设计，也可用于卵裂期胚胎。
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摘要
摘要
表观遗传学涵盖所有可遗传且可逆的染色质修饰，这些修饰会改变基因的可及性，因此是调控基因转录的主要机制1。DNA甲基化是一种表观遗传修饰，主要发挥抑制性标记的作用。通过在CpG二核苷酸中的胞嘧啶上共价添加一个甲基基团，DNA甲基化能够招募其他抑制性蛋白和组蛋白修饰，从而启动染色质压缩和基因沉默相关的过程2。DNA甲基化对正常发育至关重要，因为它在发育编程、细胞分化、逆转录病毒元件的抑制、X染色体失活以及基因组印记中发挥关键作用。
DNA甲基化分析最强大的方法之一是亚硫酸氢盐诱变法。亚硫酸钠是一种DNA诱变剂，可将胞嘧啶脱氨为尿嘧啶。经过PCR扩增和测序后，这些转化事件被检测为胸腺嘧啶。甲基化的胞嘧啶则受到保护而不发生脱氨反应，因此仍保留为胞嘧啶，从而能够在单个核苷酸水平上识别DNA甲基化状态3。亚硫酸氢盐诱变检测技术自最初报道以来4-6，已逐步发展为更敏感、更可重复的方法7。其中一项关键改进是将少量DNA包埋于琼脂糖微珠中，从而保护DNA免受剧烈的亚硫酸氢盐处理8。该改进使得对卵母细胞群和囊胚期胚胎进行甲基化分析成为可能9。迄今为止最先进的亚硫酸氢盐诱变方案适用于单个囊胚期胚胎10。然而，由于囊胚平均含有64个细胞（包含120–720 pg基因组DNA），该方法在单个卵母细胞或卵裂期胚胎的甲基化研究中效果不佳。
借鉴琼脂糖包埋微量DNA（包括卵母细胞）的方法11，本文介绍一种在卵母细胞取出并去除透明带后，立即将其直接包埋于含有裂解液的琼脂糖凝胶微珠中的技术。该方法使我们能够克服单个卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析中的两个主要难题：防止微量DNA降解，以及在多步实验流程中发生样本丢失。尤为重要的是，由于数据来源于单个卵母细胞，因此避免了混合样本中可能存在的PCR扩增偏好性问题。此外，该方法还可检测到意外的卵丘细胞污染，因为任何含有多种甲基化模式的样本均可被排除在分析之外12。本实验方案提供了一种更优的技术，可实现对DNA甲基化状态在单细胞水平上的成功且可重复的分析，特别适用于单个卵母细胞以及卵裂期胚胎的研究。
方案
第1天
在取卵当天，使用无菌蒸馏水（如GIBCO水）新鲜配制以下溶液。为降低DNA污染的风险，应频繁更换手套，并使用带滤芯的吸头。打开管盖时，保持离心管倾斜放置，不使用时应及时盖紧管盖。建议将溶液按n+1的量配制。
3% LMP 琼脂糖
30 mg 低熔点琼脂糖（LMP Agarose）
最多 1 ml GIBCO H2O
在 70 °C 下溶解
裂解液
8 μl 裂解缓冲液
1 μl 蛋白酶K
1 μl 10% IGEPAL
置于冰上，待用时取出
2:1 琼脂糖裂解液 (10 μl 每个卵母细胞（以3个卵母细胞为一份）
20 μl 3% LMP 琼脂糖
10 μl 裂解液
在 70 °C 下混匀
SDS 裂解缓冲液（每个卵母细胞 501 μl）
| 1x TE pH 7.5 | 450 μl |
| 10% SDS | 50 μl |
| 蛋白酶K | 1 μl |
| 501 μl |
1. 卵母细胞采集
- 将解剖得到的小鼠输卵管置于 M2 培养基中，撕开壶腹部以提取卵丘细胞复合体。
- 使用含有 0.3 mg/ml 透明质酸酶的 M2 培养基液滴（30 μl）分离卵母细胞与卵丘细胞复合体。仅在去除卵丘细胞所需的时间内将卵母细胞保留在溶液中，长时间暴露可能对其造成损伤。在 30 μl M2 培养基液滴中洗涤卵母细胞 3 次，期间定期去除残留的卵丘细胞。
- 使用酸性泰罗德溶液去除透明带。先将卵母细胞放入一个 30 μl 的溶液液滴中，再转移至另一个新的 30 μl 液滴，因为携带的培养基会稀释酸液，降低其效率。仅在去除透明带所需的时间内将卵母细胞保留在溶液中，长时间暴露可能对其造成损伤。注意：对于人源样本，可使用更高浓度的酸性泰罗德溶液或蛋白酶，因为人类透明带对酸性泰罗德溶液的耐受性高于小鼠。
- 在 30 μl M2 培养基液滴中再洗涤卵母细胞一次。
2. 琼脂糖包埋与裂解
- 进行琼脂糖包埋时，将裂解液置于70 °C的加热块上。向裂解液中加入预热的低熔点琼脂糖，配制成2:1的琼脂糖-裂解液混合物。
- 将单个卵母细胞置于含少量M2培养基的洁净载玻片上。用移液器吸头吸取10 μl琼脂糖-裂解液混合物，在显微镜下轻轻挤出少量（约1 μl或更少）至载玻片上，使其与少量M2培养基混合。轻柔地将卵母细胞吸入移液器吸头中，并将全部10 μl液体转移至含有300 μl矿物油的Eppendorf管中，使液滴形成球形。
注意：此操作需迅速完成，因为若温度比70 °C降低仅5 °C，琼脂糖便会凝固。 - 将离心管置于冰上孵育10分钟。进行裂解时，移除300 μl矿物油，加入500 μl SDS裂解缓冲液，在50 °C水浴中过夜孵育。
注意：裂解液（表1）也可用于此步骤。
第2天
在进行亚硫酸氢盐诱变实验当天新鲜配制以下溶液。为降低DNA污染的风险，应经常更换手套并使用带滤芯的吸头。打开管盖时保持离心管倾斜，不使用时及时盖紧管盖。建议将溶液按n+1的量进行配制。
| 3 M NaOH | 2.4 g NaOH 溶于 20 ml 经高压灭菌的 ddH2O |
| 0.1 M NaOH | 将 3 M NaOH 取 0.5 ml 加入 14.5 ml 经高压灭菌的 ddH2O |
| 0.3 M NaOH | 将 3 M NaOH 取 1.5 ml 加入 13.5 ml 经高压灭菌的 ddH2O |
2.5 M 亚硫酸氢盐溶液
- 3.8 g 亚硫酸氢钠
5.5 ml GIBCO 去离子 H2O
1 ml 3 M NaOH
室温下溶解 - 110 mg 对苯二酚
1 ml GIBCO 去离子 H2O
90 °C 下溶解（仅需加热至完全溶解，期间定期混匀）
完全溶解后，混合溶液 (a) 和 (b)
*避光保存*
3. 亚硫酸氢盐突变
- 完全移除 500 μl SDS 裂解缓冲液，并加入 300 μl 矿物油（约 20 小时）。任何残留的裂解缓冲液在加热时都会稀释琼脂糖，导致珠粒在后续步骤中更容易溶解。应立即进行亚硫酸氢盐突变处理，或在 -20 °C 下保存最多 5 天。
- 如适用，从冷冻箱中取出卵母细胞并让其解冻（仅解冻至琼脂糖珠呈半透明状即可）。在 90 °C 金属浴中孵育 2.5 分钟，随后在冰上孵育 10 分钟。
注意：请勿混合或搅拌，孵育时间不得超过 2.5 分钟，避免温度波动。 - 为进行变性处理，移除矿物油，并向每根试管中加入 1 ml 0.1 M NaOH，轻弹并倒置混匀 5–6 次。
- 在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟，每隔 3–4 分钟倒置一次。琼脂糖珠应在 NaOH 溶液中漂浮。
- 为进行亚硫酸氢盐处理，轻轻离心试管，然后移除 NaOH，加入 300 μl 矿物油和 500 μl 亚硫酸氢盐溶液。在 50 °C 水浴中孵育 3.5 小时。*避免光照*
注意：针对目标基因，孵育时间可能需要通过实验确定。 - 为进行脱磺酸化处理，在冰上孵育 3 分钟，然后移除矿物油和亚硫酸氢盐溶液，轻轻离心，加入 1 ml 0.3 M NaOH。轻弹并倒置混匀 5–6 次。
- 在 37 °C 水浴中孵育 15 分钟，每隔 3–4 分钟倒置一次。琼脂糖珠应在 NaOH 溶液中漂浮。
- 清洗样品：先轻轻离心，然后移除 NaOH，加入 1 ml 1× TE 缓冲液（pH 7.5）。在室温下振荡 5–10 分钟（使用振荡器）。再次轻轻离心，然后移除 1× TE。重复此洗涤步骤两次。
- 加入 1 ml 经高压灭菌的 ddH2O。在室温下振荡 5–10 分钟（使用振荡器）。轻轻离心后，移除 H2O。重复 ddH2O 洗涤两次。
- 检测上清液的 pH 值，应为 pH 5.0。若仍偏碱性，则需再次用 H2O 洗涤。彻底移除所有上清液，仅保留琼脂糖珠。
4. 1st 和 2nd PCR扩增循环
- 制备 1st 在洗涤的同时加入PCR混合液
| 10 μM 正向外侧引物 | 0.5 μl |
| 10 μM 反向外侧引物 | 0.5 μl |
| 240 ng/ml tRNA | 1 μl |
| H2O | 13 μl |
加入 Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR 微珠
小心地将固态琼脂糖微珠滑入 PCR 管中（约 10 μl）
加热至 70 °C 并混匀
加入 25 μl 矿物油
总体积：50 μl
- 扩增
注：小鼠循环条件的一个示例 Snrpn 在 2 分钟的变性步骤中 94 °C，随后进行40个循环，每个循环包括30秒的94°C变性步骤 94 °C1 分钟 50 °C，以及1分钟 68 °C；最后在72°C延伸10分钟 68 °C1 的退火温度st 小鼠的巢式PCR H19 和 Peg3 是 50 °C. - 制备 2nd PCR反应液（圆形）
| 10 μM 正向内引物 | 0.5 μl |
| 10 μM 反向内引物 | 0.5 μl |
| H2O | 19 μl |
加入 Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR beads
添加 5 μl 1st 以圆形产物作为模板。加热 1st 圆形产物至 70 °C 1 分钟以软化琼脂糖。务必在矿物油层下方进行移液操作。
添加 25 μl 矿物油
总计： 50 μl
注意：Snrpn、H19 和 Peg3 的巢式引物序列见 Market-Velker 等人10,12。
- 扩增
注意：小鼠的循环条件 Snrpn 变性条件为 2 分钟，95°C 94 °C，随后进行40个循环，每个循环包括30秒的94°C变性 94 °C1 分钟 50 °C，以及1分钟 68 °C；最后在72°C延伸10分钟 68 °C10小鼠 H19 和 Peg3 需要一个 50 °C 2 的退火温度nd 圆环PCR - 作为诊断检测，第二轮样本可用甲基化特异性或菌株特异性的限制性内切酶进行酶切。
| 2nd 圆形产物 | 4 μl |
| 限制性内切酶 | 1 μl |
| 缓冲液 | 1 μl |
| H2O | 4 μl |
- 将消化产物在8%丙烯酰胺凝胶上进行电泳。任何不均一的条带均代表不止一种序列。
5. TA 克隆与菌落 PCR
- 为了克隆 2nd 圆形产物，先加热至 70 °C 1 分钟以软化琼脂糖，然后使用 Promega pGEM-T 载体系统（Fisher Scientific 货号 A1360）连接至载体中。
| 2nd 圆底PCR | 1 μl |
| pGEMT-EASY 载体 | 1 μl |
| 连接酶 | 1 μl |
| H2O | 2 μl |
| 2x 连接缓冲液 | 5 μl |
在 PCR 仪中于 4 °C 过夜孵育。
- 将感受态 E.coli 细胞（Zymo Research Corp 货号：T3009）置于冰上解冻 15 分钟。向 8 μl E.coli 中加入 3 μl 连接反应产物，冰上孵育 15 分钟。
- 在 42 °C 水浴中热激 40 秒，再于冰上孵育 2 分钟。加入 60 μl S.O.C. 培养基，37 °C 摇床孵育 1 小时。
- 将全部反应混合物转移至 LB/琼脂/IPTG/X-gal/Amp 平板，37 °C 过夜培养。
- 配制菌落 PCR 混合液
| 20 μM M13 正向引物 | 0.7 μl |
| 20 μM M13 反向引物 | 0.7 μl |
| 5X Green Go Taq 缓冲液 | 7.0 μl |
| 10 mM dNTP | 0.7 μl |
| Taq DNA 聚合酶 | 0.28 μl |
| H2O | 25.62 μl |
| 总体积 35 μl |
向PCR管中加入35 μl菌落PCR预混液。用移液枪枪头从平板上挑取一个白色细菌菌落，并在PCR反应体系中轻轻搅动混匀。
- 在94 °C下变性10分钟，随后进行30个循环：94 °C 45秒、57 °C 30秒、72 °C 1分钟；最后在72 °C延伸10分钟。取4 μl PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。将约30 μl PCR产物送测序。
注意：对于卵母细胞，需测序5个菌落PCR产物。 - 获得测序结果后，可读取甲基化模式。任何仍为CG的原始CG位点表示已被甲基化，而任何由CG变为TG的原始CG位点表示未被甲基化。
6. 代表性结果
在我们的研究中，我们对单个卵母细胞和胚胎中的印记甲基化进行检测（图1）。使用经亚硫酸氢盐转化的引物进行巢式PCR扩增后，可通过琼脂糖凝胶电泳观察到正确大小的片段，从而确认转化成功（图2）。单个卵母细胞代表一个亲本等位基因，理论上仅具有一种印记甲基化模式。因此，可对第二轮PCR产物进行检测，以排除意外污染。可使用对DNA甲基化敏感的限制性内切酶（如HinfI或DpnII）消化第二轮PCR产物，以判断其是否含有甲基化或非甲基化等位基因（图3）。酶识别序列中的甲基化C会被切割，而经转化变为T的非甲基化C则不再被酶识别，因而保持未切割状态。任何包含甲基化和非甲基化等位基因的MII期卵母细胞样本均应弃用，因其提示存在卵丘细胞污染（图3）。在连接与转化完成后，可通过琼脂糖凝胶电泳观察菌落PCR扩增结果，确保将具有正确产物大小的样本送入测序环节（图4）。最后，来自一个MII期卵母细胞的五个单克隆序列应呈现出五组完全相同的甲基化模式以及一致的非CpG位点转化率（图5a）。任何包含多种不同模式的样本均应弃用（图5b）。由于排卵后的MII期卵母细胞含有两份染色体拷贝或附着的极体，因此有可能获得两种相似的序列模式（图5c）。我们建议弃用甲基化模式差异显著的卵母细胞数据，因为无法排除卵丘细胞污染的可能性。
图1. 单个卵母细胞亚硫酸氢盐突变分析示意图。
图2. 2 的代表性结果nd 扩增循环次数 Snrpn 从单个MII期卵母细胞在1.5%琼脂糖凝胶上的扩增结果。泳道1-4为四个单个MII期卵母细胞，泳道5为阴性对照（无卵母细胞）。预期扩增片段大小为 Snrpn 为420 bp。L，ladder。
图3. 2 的代表性结果nd 甲基化特异性限制性消化的循环扩增 Snrpn 从单个MII期卵母细胞在8%丙烯酰胺凝胶上 HinfI 诊断性限制性酶切显示未甲基化的DNA含有一个T碱基，破坏了酶切位点（420 bp，泳道1），或甲基化的DNA在识别位点内含有C碱基，可被切割（262、103和54 bp，泳道2）。酶切结果同时显示甲基化与未甲基化的限制性酶切位点（被切割） & 未切割的条带（第3泳道）表明存在卵丘细胞污染。L，分子量标记。
图4. 单个MII期卵母细胞中Snrpn基因的菌落PCR扩增结果，电泳于1.5%琼脂糖凝胶。将Snrpn片段连接至pGEM-T Easy载体后，使用M13正向和反向引物扩增，预期产物大小为656 bp。第1-8泳道：克隆1-8的扩增产物。克隆5的扩增产物大小不正确，不应送测序。
图 5. 来自单个MII期卵母细胞的Snrpn基因代表性测序结果。Snrpn在卵母细胞中处于甲基化状态。黑色圆圈表示甲基化的CpG位点，白色圆圈表示未甲基化的CpG位点。CpG位点的数量和位置代表B6品系雌性小鼠的情况。a) 来自单个MII期卵母细胞的Snrpn基因预期测序结果。在全部五个克隆中，应仅有一条DNA链被扩增。在分析中应纳入具有单一甲基化模式且非CpG位点转化模式一致的卵母细胞（右侧所示的非CpG位点转化百分比，计算方式为转化为胸腺嘧啶的非CpG胞嘧啶数量占总非CpG胞嘧啶数量的百分比）。b) 来自单个MII期卵母细胞但存在卵丘细胞污染的Snrpn基因测序结果。注意甲基化状态和转化模式之间的差异，提示发生了多条DNA链的扩增。c) 来自单个MII期卵母细胞但包含两条染色体拷贝或极体的Snrpn基因测序结果。
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讨论
该单个卵母细胞检测包含多个步骤，其中一些步骤尤为关键，需特别小心。首先是卵母细胞的洗涤。在透明质酸酶处理后，用新鲜培养液液滴多次充分洗涤每个卵母细胞，以尽可能去除所有卵丘细胞，这一步尤为关键。此外，在将卵母细胞转移至酸性泰罗德溶液以去除透明带时，务必确保周围液滴中无残留卵丘细胞。去除透明带后卵母细胞具有很强的黏性，任何残留的卵丘细胞都可能轻易黏附于卵母细胞表面。一旦卵丘细胞黏附到无透明带的卵母细胞上，将极难去除。尽管本实验方案可在后续时间点检测到卵丘细胞污染，但对最终可能被弃用的卵母细胞完成全部实验流程既无必要，也不经济。
第二个关键步骤是卵母细胞包埋。在将卵母细胞包埋于琼脂糖和裂解液中时，需要注意低熔点（LMP）琼脂糖在温度比70 °C仅低5 °C时便会凝固。因此，我们建议在70 °C下混合琼脂糖和裂解液，然后将单个卵母细胞置于载玻片上的最小量培养基中。准备就绪后，用移液器吸取琼脂糖/裂解液，迅速而谨慎地将卵母细胞包埋至预先准备好的离心管中，并置于矿物油下。
蛋白酶K的热失活必须在90 °C下进行2.5分钟，这一点至关重要。...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由西安大略大学妇产科系以及安大略省研究与创新部早期研究者奖（Early Researcher Award）项目 ER06-02-188 资助。MMD 获加拿大健康研究院（CIHR）生殖、早期发育与健康影响研究生奖学金（REDIH）培训项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 卵母细胞采集 | |||
| 透明质酸酶 | Sigma | H4272 | |
| 酸性泰罗德液 | Sigma | T1788 | |
| 蛋白酶K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| 裂解液 | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS裂解缓冲液 | |||
| TE pH 7.5 | Bioshop(Tris)Sigma (EDTA) | TRS001.5 E5134 | |
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| 亚硫酸氢盐转化 | |||
| 氢氧化钠 | Sigma | S8045 | |
| 亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠） | Sigma | 243973 | |
| 对苯二酚 | Sigma | H9003 | |
| 低熔点（LMP）琼脂糖 | Sigma | A9414 | |
| 矿物油 | Sigma | M8410 | |
| M2培养基 | Sigma | M7167 | |
| GIBCO蒸馏水 | Invitrogen | 15230-196 | |
| 高压灭菌的双蒸水（dd水） | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml 酵母tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 内外嵌套引物 | Sigma | ||
| 连接 | |||
| Promega pGEM-T Easy载体 | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA克隆 | |||
| 感受态E.coli细胞 | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| 设备 | |||
| 解剖显微镜 | |||
| 70 °C 和 90 °C 恒温金属浴 | |||
| 37 °C 和 50 °C 水浴锅（转化用42 °C） | |||
| 摇床 | |||
| PCR仪 |
参考文献
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170(2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
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