本文描述了一种对小鼠棕色脂肪组织（BAT）进行功能成像的方法，该方法采用标准化的微型PET/CT方案，无创地评估寒冷刺激下BAT对18F-氟代脱氧葡萄糖（FDG）的摄取。该方法具有良好的稳健性和灵敏度，可检测小鼠模型中BAT活性的差异。
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摘要
摘要
棕色脂肪组织（BAT）与白色脂肪组织（WAT）在解剖位置和颜色上存在差异，BAT呈棕红色，这是由于其血管丰富且线粒体密度较高所致。BAT在新生儿及成年哺乳动物的能量消耗和非颤抖性产热过程中发挥重要作用1。BAT介导的产热过程主要通过交感神经系统进行高度调控，尤其是经由β肾上腺素能受体实现2, 3。近期研究表明，成年人体内BAT的活性与体重指数（BMI）及其他糖尿病相关参数呈负相关4-6。因此，BAT被认为是一种潜在的抗肥胖/抗糖尿病治疗靶点，其机制聚焦于调节能量平衡6-8。尽管已有多种基于冷刺激的正电子发射断层扫描（PET）方法用于检测人体内的BAT9-13，但在小动物模型（如小鼠）中，目前尚无标准化的BAT成像与定量分析方案。本文描述了一种可靠的PET/CT成像方法，用于评估小鼠BAT的功能活性。简言之，成年C57BL/6J小鼠在禁食条件下接受4小时的低温处理，随后注射一剂18F-氟代脱氧葡萄糖（FDG）。注射FDG后，小鼠继续在低温环境中停留1小时，然后使用专用于小动物的微型PET/CT系统进行扫描。所获得的PET图像与CT图像进行配准，以提供解剖学参考，并分析肩胛间BAT区域的FDG摄取情况，从而反映BAT活性。该标准化的低温处理与成像方案已通过药理学干预实验得到验证，例如，使用β-肾上腺素受体拮抗剂普萘洛尔可抑制BAT的激活14, 15，而使用β3激动剂BRL37344则可增强BAT的激活16。本文所述方法可用于筛选调节BAT活性的药物或化合物，或用于识别在BAT发育与调控中起作用的基因及信号通路，适用于多种临床前及基础研究。
方案
1. 动物准备与冷处理
- 找到并检查一个已获准用于饲养实验小鼠的 4 °C 冷房。
- 前一晚将动物笼具放入冷房中预冷。笼具组装时不含饲料和垫料，但需配装一瓶水。
- 实验当天早晨，每隔 30 分钟将小鼠逐只放入预冷的笼具中。每只单独饲养的小鼠在转移至成像实验室前，需在冷房中停留约 4 小时。确保小鼠处于禁食状态，但可自由饮水。
- 冷处理 4 小时后，每隔 30 分钟将一只小鼠转移至成像实验室。可通过在泡沫箱内装满冰，并将预冷的饲养笼置于箱内冰上实现运输。将泡沫箱盖轻轻盖上，不要密封。
2. 建立微型PET/CT成像工作流程
本方案中，采用西门子Inveon专用PET（dPET）系统和Inveon多模态（MM）系统（CT/SPECT），在对接模式下实现微型PET/CT成像。将动物从MM入口处放入，首先进行CT扫描以获取解剖学参考图像，然后将其滑动至dPET中心，进行静态F18 PET图像采集。为了使主机计算机能够自动执行这些顺序操作，在实际成像之前，需使用Inveon采集工作台（IAW）软件预先编程以下“工作流程”。
- CT 采集：进行全身 CT 扫描时，将电流设为 500 uA，电压设为 80 kV，曝光时间为 200 毫秒，旋转角度为 240°，分 240 步采集。对于 X 射线探测器，选择“低系统放大倍数”下的分辨率，轴向成像视野为 78 mm，并采用单床位模式。选择“实时重建”方式，使用“通用锥束重建”方法，使主机 PC 与专用的实时重建计算机（Cobra）通信以启动任务。
- PET 发射数据采集：在“按时间采集”选项中，将“固定扫描时间”设为 600 秒（10 分钟）。选择 F-18 作为“研究同位素”，能量范围设为 350–650 keV。
- PET 发射数据直方图：将“动态帧”设为“黑色”，将整个时间段的数据作为一个帧处理，以实现静态扫描。选择“3D”作为直方图类型，并选择“不进行散射校正”。
- PET 重建：使用二维有序子集期望最大化算法（OSEM2D）作为重建算法。
3. 注射 FDG
- 从地区供应商处订购一份临床用18F-FDG（10 mCi），确保其在首次注射前约30分钟送达影像实验室。按照机构的安全规程接收并检测含有放射性物质（RAM）的包裹。
- 在L型屏蔽块台面的防护下，将FDG分装并用无菌生理盐水稀释。每次注射所用FDG的稀释后活度浓度应为200–300 μCi/100 μl。使用26G 1/2英寸针头的1 ml注射器抽取FDG溶液，并用活度计测量整支注射器的放射性活度。
- 通过腹腔（i.p.）途径，向刚从冷房转移出来的动物（见步骤1.4）注射100 μl FDG溶液。记录注射时间。再次使用活度计测量注射器中残留的放射性活度。
- 将动物放回置于泡沫保温箱内的冷藏笼中，箱内用冰块维持低温环境。在低温（约4 °C）条件下孵育动物1小时，以促进FDG摄取。
- 通过以下公式计算每只小鼠注射的FDG活度：
注射活度（μCi）= 注射前注射器内活度 - 注射后注射器内活度
4. 微型 PET/CT 成像
- 在注射FDG后1小时或冷处理后5小时开始微型PET/CT成像。将动物放入麻醉诱导室，使用含3%异氟烷的氧气进行麻醉诱导。
- 一旦动物进入麻醉状态，将其转移至微型CT载物台（动物床）上，头部置于锥形面罩内，持续以2 L/min的流速输送2%异氟烷。在动物身下放置电热垫（BioVet，m2m Imaging Corp.），以帮助维持体温。
- 将动物滑入MM扫描仪入口，从工具栏激活“laser”图标，并使用触控板控制移动载物台，使动物胸部位于水平与垂直激光线的交叉点处。在“Laser Align”窗口中，选择“first scan type”为CT扫描，并勾选“PET acquisition included in workflow”选项。
- 打开“Scout View”窗口，获取定位X射线影像。使用IAW调整动物床位置，使CT的中心视野位于小鼠身体中央（肝脏区域）。如有必要，重复此步骤。
- 启动第2步中建立的“workflow”。当弹出选项时，选择适当的3D PET-CT变换矩阵文件用于CT重建，并选择最近创建的归一化文件用于无衰减校正的PET重建。随后，IAW将按程序依次开始CT和PET扫描。
- 整个流程完成后（可能需要20–25分钟），使用ASIPro VM（与IAW共安装的微型PET分析软件）初步评估所获取的CT和PET图像质量。将成像数据存档至数据存储设备，或通过网络传输至后续图像分析工作站（见第5步）以进行进一步分析。
- 将动物从成像系统中取出，放入清洁的饲养笼中，在室温下提供正常食物和饮水以供恢复。系统现已准备就绪，可对队列中的下一只动物进行操作。请注意，对成像后动物的护理和操作应遵循机构关于“注射了放射性活度物质（RAM）的实验动物操作”的相关规定。同时请注意，使用过的针头/注射器、吸水垫、手套以及所有垫料和粪便物质均应视为放射性废物，并依照机构相关的RAM废物处理规定进行处置。
5. 成像后分析
- 打开 Inveon Research Workplace (IRW) 软件（Siemens），手动导入 CT 和 PET 数据集。在“Registration”窗口中，使用“General analysis”功能下的工具对 CT 和 PET 图像进行配准，并在“Review”窗口中确认 CT 与 PET 图像在所有三个维度上均实现完美对齐。
- 在“Region of Interest (ROI) Quantification”窗口中，参考已配准的 CT 图像，识别位于颈部肩胛间区的棕色脂肪组织（BAT）——这是成年小鼠中最主要的冷诱导型棕色脂肪组织区域，并在 PET 数据集上绘制该区域的感兴趣体积（VOI）。选择“Voxel Intensity”作为“Quantification Type”，记录 VOI 内的平均放射性活度，单位为 Bq/ml。将计数/秒转换为 Bq/ml 的校准因子已通过扫描已知放射性活度的模体预先确定。
- BAT 中 FDG 摄取量以每克组织注射剂量百分比（%ID/g）表示，并进行衰变校正。注射剂量来自第 3.5 步的结果，但需转换为贝可勒尔（Bq）单位（1 μCi = 37,000 Bq）；我们假设 1 ml 组织等于 1 g。
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结果
小鼠棕色脂肪组织（BAT）的微正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（micro-PET/CT）成像示例见图1。CT成像提供解剖学信息，而PET成像则反映全身18F-FDG摄取的分布与数量。这些成像数据可单独显示（图1A和1B）、融合显示（图1C），或以三维方式呈现，例如最大强度投影（MIP，图1D）。借助三维成像工具，可在PET图像上勾画感兴趣体积（VOI），此处为肩胛间BAT区域（图1中箭头所示），并可将VOI内的总信号转换为%ID/g，即每克组织的注射剂量百分比（%ID/g）。在本示例小鼠中，BAT的FDG摄取值为19 %ID/g。为了验证该冷刺激及成像方案是否足够敏感，能够检测BAT活性的改变（无论是上调还是下调），我们分别使用β肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔（propranolol）抑制BAT激活15，以及β3激动剂BRL37344增强BAT诱导16。这些药理干预在冷处理期间进行，具体时间为FDG注射前30分钟。PET/CT成像（
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讨论
本研究建立了一种基于微型PET/CT的成像方法，用于检测成年小鼠的棕色脂肪组织（BAT）活性，该方法仅需冷刺激处理以及一次注射 commercially available 的18F-FDG。整个实验流程可在同一天内完成，按照每30分钟开始一次处理与成像的顺序依次进行，直至所有动物完成处理和扫描。在所述实验条件下，单台成像系统可在同一天内检测共计10只小鼠（或分为两组，每组5只）。若采用特殊设计的动物床，使两只或更多动物能够同时扫描，则此类通量的限制可被克服，这一点已有文献报道17。为完成本研究，我们依赖于结合微型PET/CT的成像系统，该系统可利用CT提供的精细解剖学信息。然而，当在F18发射数据采集前加入57Co透射扫描时，单独的微型PET系统亦可完成该任务。57Co透射数据可用于PET图像重建过程中的衰减校正，也可被重建以实现解剖定位。
该方案的关键步骤是优化冷处理的持续时间（例如，本研究中为5小时）。较短的冷暴露时间或完全不进行冷暴露可能导致活性接近本底水平，从而使该方...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Laura Diaz、Kevin Phillips、Willa A. Hsueh 和 King C. Li 在本方法开发过程中提供的有益建议和技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微型PET/CT成像系统 | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | Inveon Dedicated PET System 和 Inveon Multimodality CT/SPECT System（对接式） | |
| 普萘洛尔 | Sigma | P0884 | |
| BRL 37344 | Sigma | B169 | |
| 18F-FDG | Cyclotope Inc. | ||
| C57BL/6J雄性小鼠 | Jackson Laboratory | 000664 | 3-4月龄 |
参考文献
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重印与许可
