本文详细介绍了基于微针的多重传感器的构建方法。该装置正在被开发用于对多种分析物进行原位采样和电化学分析，具有快速且选择性高的特点。我们预期这类基于微针的传感器将在临床医学和生物医学研究中得到应用。
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摘要
摘要
开发一种用于快速分析生物学相关分子的微创多重监测系统，可为患有慢性疾病的人群提供便捷的即时生理状态评估。此外，该系统还可作为研究复杂、多因素医学状况的工具。要实现这种多分析物传感器，必须满足以下条件：具备微创性，能够无痛且安全地采集组织间液，并实现快速且高选择性的分析。
微针最初被开发用于无痛药物递送，现已用于通过皮肤递送疫苗和药理学制剂（例如胰岛素）1-2。由于这些装置可进入皮下组织间隙，集成微电极的微针可作为经皮电化学传感器使用。已有研究证实，利用集成微针-电极装置，结合碳纤维、修饰碳糊以及镀铂聚合物微针作为换能元件，可实现对葡萄糖、谷氨酸、乳酸、过氧化氢和抗坏血酸的选择性检测3-7,8。
这种微针传感器技术为原位同时检测多种分析物提供了一种新颖且复杂的分析方法。多重检测使得监测复杂的微环境成为可能，而这些微环境通常难以通过快速且微创的方式进行表征。例如，该技术可用于同时监测细胞外葡萄糖、乳酸和pH水平9，这些是疾病状态7,10-14（如癌症增殖）和运动诱发性酸中毒15的重要代谢指标。
方案
1. 微针制备
- 使用三维建模软件 Solidworks（Dassault Systemes SA，Velizy，法国）设计一个金字塔形状的中空微针阵列（图1）。3-5
- 使用 Magics RP 13 软件（Materialise NV，Leuven，比利时）为微针阵列设计支撑结构。该支撑结构可在制造过程中使树脂从装置中排出，并为微针的构建提供基底。示例支撑结构如图1所示。
- 将关联的支撑结构与微针阵列文件上传至 Perfactory RP 软件（EnvisionTEC GmbH，Gladbeck，德国），该软件用于控制制造过程。在该软件中选择需制造的微针阵列数量，并确定装置在制造板上的位置。
- 对 Perfactory 快速成型制造系统在紫外模式下以 180 mW 进行校准，并确认能量偏差在 ±2 mW 范围内。
- 制造完成后，将微针阵列从基板上取下，并在异丙醇中清洗 15 分钟。用压缩空气吹干阵列，并在 Otoflash Postcuring System（EnvisionTEC GmbH，Gladbeck，德国）中于室温下固化 50 秒，以确保完全聚合。
- 通过显微镜验证微针的制造质量，确认每根微针的孔道均为中空且无堵塞。完全制造完成的微针如图2所示。
2. 碳糊电极阵列的制备
- 使用60 W的Model 6.75 CO2光栅/矢量激光系统（Universal Laser Systems, Inc., Scottsdale, AZ），在从商业来源（Molex Connector Corp., Lisle, IL）获得的扁平柔性电缆（21039-0249）上切割出孔洞，以暴露其下方可独立寻址的连接铜线（图3 (A和B)）。将扁平柔性电缆放置于夹具中，以在激光烧蚀板上实现准确定位。采用光栅扫描方式在柔性电缆的绝缘部分加工出直径为500 μm的腔体。烧蚀图案在CorelDraw（Corel, Ottawa, Ontario）中设计，并传输至激光系统。
- 使用在40 psi压力下喷射丙酮的喷枪清洁经改造的扁平柔性电缆。随后用异丙醇和去离子水冲洗，完成最终清洗。在显微镜下确认暴露的铜条表面无残留绝缘膜。
- 下一步是创建用于填充碳糊的容纳腔。将单面涂有压敏丙烯酸胶粘剂、厚度为0.002英寸的Melinex胶带，按照电极条带的相同图案进行烧蚀，覆盖在已烧蚀的电极条带上，并在3000 psi压力下压合2分钟，以确保良好连接。此步骤中腔体直径为750 μm。
- 随后，使用双面涂有压敏丙烯酸胶粘剂、厚度为0.004英寸的另一层Melinex胶带，以与单面胶带相同的图案进行烧蚀，经对准后用于将微针阵列与碳糊电极阵列键合。
3. 功能性碳糊的合成与电极腔体的填充
- 葡萄糖敏感型碳糊基于先前的配方，通过将10 mg葡萄糖氧化酶与2.2 mg聚乙烯亚胺混合，直至形成均匀混合物而制得。16 向该混合物中加入60 mg负载量为5%的碳载铑粉末，再加入40 mg矿物油并充分混匀。将所得糊状物置于 4 °C 直至使用；制备后的糊剂可在一周内使用完毕。
- pH 敏感型碳糊通过混合 30%（w/w）矿物油和 70%（w/w）石墨粉制得。按照第 3.4 节所述方法将糊状物填入电极腔。配制 10 mM 快速蓝 RR 重氮盐（4-苯甲酰氨基-2,5-二甲氧基苯重氮氯化物半（氯化锌）盐）的 0.5 M 磷酸溶液。17，放置一个 20 μl 将该溶液一滴加至压实的糊状电极上，静置30分钟，使Fast Blue PR重氮盐自发发生化学吸附。用去离子水冲洗，不使用时存于缓冲液或去离子水中。
- 乳酸敏感型碳糊基于先前的配方制备，通过将2.5 mg载铑碳粉与2.5 mg乳酸氧化酶混合，交替进行超声处理5分钟和涡旋振荡5分钟，重复五个循环获得。18
- 将改性浆料填充至制备好的平面柔性电缆时，需将相应的浆料涂覆于电极腔内。使用一小片塑料（例如塑料称量皿的边缘）作为抹刀，将浆料压实直至表面光滑。再用第二个洁净的称量皿重复操作，以去除多余的浆料。随后用去离子水清洗。图示展示了激光烧蚀形成腔体、碳浆料填充以及微针集成（见第2和第3节）的示意图。 图3.
4. 检测与传感器校准
- 通过在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH=7.5）中，于-0.15 V电位下测量传感器的计时安培响应，并在15秒后记录电流，实现乳酸的检测。图4(a)展示了乳酸检测的电催化反应示意图。
- 葡萄糖检测以类似方式进行，即在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，于-0.05 V电位下测量传感器的计时安培响应，并在15秒后记录电流。图4(b)展示了葡萄糖检测的电催化反应示意图。
- pH值通过在-0.7 V至0.8 V范围内以100 mV/s的扫描速率进行循环伏安扫描，并记录氧化峰电位的位置来进行监测。pH检测所涉及的氧化还原反应示意图见图5。
- 葡萄糖和乳酸传感器的校准曲线可通过依次加入相应分析物来建立；每次加入分析物后，按照5.1和5.2节所述进行计时安培测量。或者，可在搅拌条件下进行固定电位的计时安培测量，每次加入分析物之间留出足够时间（约10–100秒），以确保电流稳定。
- pH校准曲线可通过在pH值从5到8、以1.0 pH单位递增的一系列已知pH缓冲液中，测量氧化峰电位的位置，并按照5.3节所述记录循环伏安图来建立。
5. 代表性结果
在静止溶液中使用修饰碳糊填充微针获取计时安培曲线（例如用于葡萄糖或乳酸检测）时，施加相应的检测电位后，电流会立即下降，并最终衰减至稳态值。图6展示了一个典型结果，该数据来自对乳酸微针依次加入2 mM乳酸并进行记录。每次加入乳酸后，必须短暂搅拌溶液。15秒时的电流随乳酸浓度增加而上升；该电流响应可用于测定未知溶液中乳酸的浓度。或者，可在搅拌溶液（或流动溶液）中进行连续监测，如在葡萄糖浓度逐步升高溶液中的示例所示（图5）。同样，随着葡萄糖浓度增加而产生的电流上升可用于对未知溶液的葡萄糖响应进行校准。每次浓度突增后，必须留出足够时间使溶液达到稳定状态。图6显示了在0.1 M磷酸盐缓冲液中，pH敏感微针对pH值从5到8（以1个pH单位递增）四种不同pH溶液测得的循环伏安图。氧化峰电位随pH升高发生偏移；该现象被用作pH值的指示依据。
图1. 在Solidworks中创建的微针阵列STL文件图像（A），以及显示支撑结构的屏幕截图（B）。
图 2. 微针阵列（A）及该阵列中单个微针（B）的扫描电子显微照片。
图 3. 柔性扁平电缆组装示意图。步骤包括改造柔性扁平电缆（A），烧蚀出图案化圆圈（B），添加最初烧蚀的Melinex层并填充碳浆（C），以及添加第二层烧蚀的Melinex层并与微针阵列对接（D）。 点击此处查看大图。
图 4. 在 0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中，于 -0.15 V 下进行 15 秒计时电流扫描，对乳酸敏感糊剂进行校准。每次电流增加对应加入 2 mM 乳酸。
图5. 在-0.05 V电位下对葡萄糖敏感糊剂进行计时安培扫描校准。每次响应信号的下降对应加入2 mM葡萄糖。校准过程中使用搅拌的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）。本研究中采用外部Ag/AgCl电极作为参比电极，并使用Pt电极作为对电极。
图 6. 0.1 M 磷酸盐缓冲液中 pH 敏感型碳糊电极在 pH 5–8 范围内以 1 pH 单位递增的循环伏安图（CV）（青色 = pH 8.0，绿色 = pH 7.0，紫色 = pH 6.0，红色 = pH 5.0）。第五条 CV 曲线用于相对于 Ag/AgCl 参比电极和 Pt 丝对电极的分析。
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讨论
在器件制备之前，已综合考虑了该基于微针的传感器设计的多个方面。为了实现实时检测，传感器的响应时间必须较短；在本方案中，每个测试的传感器响应时间均低于十五秒。本方案所采用的糊剂还考虑了其在体内环境中的选择性，因为体内环境含有可干扰电极响应的电活性生物分子。除了糊剂成分外，还通过选择合适的工作电位以最大限度地减少干扰性电活性物质的影响。成功制备微针阵列需要选择合适的微针结构设计和微针材料。这两个因素将决定微针是否能够穿透皮肤、保护电极免受物理损伤，并避免电极与组织直接接触。需要注意的是，测量过程中使用了外部的Ag/AgCl参比电极和Pt对电极；若将该器件用于人体或动物的体内实验，则需将这些电极集成于器件内部。
基于微针的传感器的每个组件都具有需要验证的特性，以确保其正常功能。在平面柔性电缆修饰过程中的质量控制（图3 B）包括确保激光烧蚀后镀锡铜线表面的绝缘层被完全去除（图3）。若激光烧蚀后未能完全去除铜线表面的绝缘层，可能导致因电接触不完全而产生不规则响应。激光烧蚀后的Melinex胶带需通过显微镜检...
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致谢
桑迪亚是一个多项目实验室，由洛克希德·马丁公司旗下的桑迪亚公司为美国能源部国家核安全管理局根据合同DE-AC04-94AL85000运营。作者感谢桑迪亚国家实验室实验室主导研究与开发（LDRD）项目提供的资助。
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参考文献
- Henry, S., McAllister, D. V., Allen, M. G., Prausnitz, M. R. Microfabricated microneedles: a novel approach to transdermal drug delivery. J. Pharm. Sci. 87, 922-925 (1998).
- Prausnitz, M. R. Microneedles for transdermal drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 56, 581-587 (2004).
- Miller, P. R., Gittard, S. D., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Xiao, X., Wheeler, D. R., Monteiro-Riviere, N. A., Brozik, S. M., Polsky, R., Narayan, R. J. Integrated carbon fiber electrodes within hollow polymer microneedles for transdermal electrochemical sensing. Biomicrofluidics. 5, 013415-013415 (2011).
- Windmiller, J. R., Zhou, N., Chuang, M. C., Valdés-Ramírez, G., Santhosh, P., Miller, P. R., Narayan, R., Wang, J. Microneedle array-based carbon paste amperometric sensors and biosensors. Analyst. 136, 1846-1851 (2011).
- Windmiller, J. R., Valdés-Ramírez, G., Zhou, N., Zhou, M., Miller, P. R., Jin, C., Brozik, S. M., Polsky, R., Katz, E., Narayan, R., Wang, J. Bicomponent microneedle array biosensor for minimally-invasive glutamate monitoring. Electroanal. 23, 2302-2309 (2011).
- Ricci, F., Moscone, D., Palleschi, G. Ex vivo continuous glucose monitoringwith microdalysis technique: The example of GlucoDay. IEEE Sensors J. 8, 63-70 (2008).
- Zimmermann, S., Fienbork, D., Flounders, A. W., Liepmann, D. In-device enzyme immobilization: Wafer-level fabrication of an integrated glucose. Sens. Actuat. B. 99, 163-173 (2004).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Biomicrofluidics. 88, 739-742 (2012).
- Miller, P. R., Skoog, S. A., Edwards, T. L., Lopez, D. M., Wheeler, D. R., Arango, D. C., Xiao, X., Brozik, S. M., Wang, J., Polsky, R., Narayan, R. J. Multiplexed microneedle-based biosensor array for characterization of metabolic acidosis. Talanta. 88, 739-742 (2012).
- Rofstad, E. K. Microenvironment-induced cancer metastasis. Int. J. Radiat. Biol. 76, 589-605 (2000).
- Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
- Warburg, O., Wind, F., Negelein, E. The metabolism of tumors in the body. J. Gen. Physiol. 8, 519-530 (1927).
- The Tumour Microenvironment: Causes and Consequences of Hypoxia and Acidity. Novartis Foundation Symposium 240. Goode, J. A., Chadwick, D. J. , John Wiley & Sons, Ltd. (2008).
- Cardone, R. A., Casavola, V., Reshkin, S. J. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nature Rev. Cancer. 5, 786-795 (2005).
- Robergs, R. A., Ghiasvand, F., Parker, D. Biochemistry of exercise-induced metabolic acidosis. Am. J. Phys. 287, R502-R516 (2004).
- Wang, J., Liu, J., Chen, L., Lu, F. Highly selective membrane-free, mediator-free glucose biosensor. Anal. Chem. 66, 3600-3603 (1994).
- Makos, M. A., Omiatek, D. M., Ewing, A. G., Heien, M. L. Development and characterization of a voltammetric carbon-fiber microelectrode pH sensor. Langmuir. 26, 10386-10391 (2010).
- Wang, J., Chen, Q., Pedrero, M. Highly selective biosensing of lactate at lactate oxidase containing rhodium-dispersed carbon paste electrodes. Anal. Chem. Acta. 304, 41-46 (1995).
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