巨噬细胞在多种组织的稳态和病理过程中发挥核心作用。本文介绍的方法包括在体内耗竭巨噬细胞、从小鼠骨髓穿刺物中诱导极化巨噬细胞，以及将巨噬细胞过继转移至小鼠体内。这些技术有助于明确极化巨噬细胞在健康与疾病中的作用。
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摘要
摘要
巨噬细胞在应对感染性挑战或损伤的先天免疫反应中发挥关键作用，不仅启动先天免疫反应，还调控获得性免疫反应。巨噬细胞功能障碍可导致机体无法产生适当的免疫应答，因此已被认为与多种疾病过程相关，包括炎症性肠病。巨噬细胞表现出极化表型， broadly 分为两大类：经典活化的巨噬细胞由 IFNγ 或 LPS 刺激活化，在应对细菌感染中发挥重要作用；而替代性活化的巨噬细胞由 IL-4 或 IL-13 活化，参与清除细胞碎片和组织重塑，并被认为在炎症消退阶段发挥作用。在炎症反应过程中 体内，巨噬细胞存在于多种浸润性免疫细胞构成的复杂混合物中，可能通过加剧或缓解炎症参与其中。为明确巨噬细胞的作用 原位 在整体动物模型中，有必要研究从复杂环境中耗竭巨噬细胞所产生的效应，以探讨巨噬细胞表型的作用问题。 原位，可获得表型定义的极化巨噬细胞 离体，从骨髓穿刺物中分离并回输至小鼠体内，回输前可选择性地耗竭巨噬细胞。在本实验方案中，采用含氯膦酸盐的脂质体与PBS注射对照组相比，在右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中实现结肠巨噬细胞的耗竭。此外，极化巨噬细胞被诱导生成 离体 通过静脉注射转移至小鼠。该方法的一个注意事项是，含氯膦酸盐的脂质体可耗竭所有专业性吞噬细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞；因此，为确保观察到的耗竭效应具有巨噬细胞特异性，有必要通过过继性移植巨噬细胞来重建表型。在小鼠中实现系统性巨噬细胞耗竭的另一种方法是将小鼠回交至CD11b-DTR背景，这是一种极佳的互补策略。含氯膦酸盐脂质体介导的耗竭方法的优势在于，无需进行小鼠回交所需的时间和费用，且可在任何遗传背景的小鼠（如C57BL/6、BALB/c或混合背景）中使用。
方案
1. 使用含氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞
- 脂质体在 4 °C 下保存。注射前两小时，将含氯膦酸盐的脂质体、含 PBS 的脂质体或无菌 PBS（注射对照）从冰箱中取出，使其平衡至室温（18 °C）。
- 将装有脂质体的管子上下颠倒 8–10 次，确保均匀分布，然后吸取 200 μl 加入 1 ml 注射器中。在注射器前端安装一根 26 号针头。
- 用左手抓住小鼠耳后方的皮肤，提起足够多的皮肤以固定其头部和四肢。
- 倾斜小鼠，使其头部略朝向地面，从而使内脏器官远离注射部位，注射部位位于腹部右下象限。
- 在注射前，将注射器在手掌间滚动并倒置 6 次，以使脂质体溶液均匀分布。
- 将针头以 30–40 度角插入小鼠腹部右下侧，注射 200 μl 脂质体溶液或 PBS。
- 在诱导性炎症模型（如 DSS 诱导的结肠炎）中，应在实验性炎症开始前 4 天对小鼠进行注射，以确保清除驻留的巨噬细胞，并在实验过程中每 2 天注射一次，以清除新浸润的巨噬细胞。
- 实验结束时，在进行预定的实验分析的同时，取目标部位的组织，用多聚甲醛固定，通过免疫组织化学染色确认巨噬细胞的清除情况。
2. 从骨髓穿刺液中诱导极化巨噬细胞
- 8至12周龄小鼠的骨髓可获得最高产量的骨髓来源巨噬细胞。处死小鼠后，将其仰卧放置，并固定四肢，尽量拉伸肢体。
- 在无菌操作台中取出股骨和胫骨，并尽可能去除附着的肌肉组织。
- 使用装有26号针头的5 ml注射器，以含10%胎牛血清（FCS）的IMDM培养基冲洗骨髓。
- 将冲洗出的骨髓细胞用含10% FCS的IMDM培养基稀释至40 ml，转移至75 cm2组织培养瓶中，于37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。此步骤可去除贴壁的间充质细胞或成熟巨噬细胞，从而富集造血祖细胞。
- 将含有非贴壁祖细胞的培养上清转移至50 ml圆锥形Falcon离心管中，以1200 rpm离心5分钟。
- 用5 ml含10% FCS的IMDM培养基重悬细胞沉淀，通过将细胞悬液以1:20比例稀释于冰醋酸中计数有核细胞。该操作可裂解所有细胞（包括红细胞），残留的细胞核可在血细胞计数板上进行计数。
- 将细胞重悬于完全培养基中，调整浓度为0.5×106 个细胞/ml，完全培养基成分为：IMDM、10% FCS、150 μM单硫代甘油（MTG）以及10 ng/ml的M-CSF、GM-CSF或IL-3。由M-CSF诱导分化的巨噬细胞为经典活化型巨噬细胞，而由GM-CSF或IL-3诱导分化的巨噬细胞则为替代活化型巨噬细胞。
- 在第4天更换培养基，离心收集非贴壁细胞并将其返回原培养瓶；在第7天更换培养基时，则弃去非贴壁细胞。
- 此外，在第7天可向含M-CSF诱导细胞的培养瓶中加入IFNγ（10 ng/ml）或IL-4（10 ng/ml），分别诱导巨噬细胞向经典活化型或替代活化型表型极化。继续孵育3天。
- 在第10天，吸除培养基，使用Cell Dissociation Buffer（Gibco-BRL）从组织培养瓶中解离细胞。室温（18 °C）下向细胞加入5 ml缓冲液作用5分钟，然后用手掌根部用力敲击瓶壁数次。在显微镜下观察确认细胞已完全脱落。将重悬的细胞转移至15 ml圆锥形Falcon离心管中，并用额外的10 ml含10% FBS的IMDM培养基冲洗培养瓶。合并细胞悬液，以300×g离心5分钟。
- 使用血细胞计数板计数活细胞，并以无菌PBS（pH 7.4）将细胞重悬至浓度为107 个细胞/ml。此时巨噬细胞已可用于小鼠体内注射。
- 保留1.0×106个巨噬细胞用于巨噬细胞表型鉴定。经脂多糖刺激后，经典活化型巨噬细胞分泌高水平的一氧化氮和IL-12p70，同时分泌较低水平的IL-10，而替代活化型巨噬细胞则相反。替代活化型巨噬细胞组成性表达YM1和精氨酸酶I（ArgI），可通过Western免疫印迹法检测。
3. 将巨噬细胞转移至小鼠体内
- 将巨噬细胞重悬于无菌 PBS 中，浓度为 107 个细胞/ml。由此可在总体积为 100 μl 的条件下进行静脉注射，共注射 106 个巨噬细胞。该体积适合经尾静脉安全、顺利地注射至小鼠体内。
- 使用加热垫或加热板对小鼠加热 5–10 分钟，以扩张尾静脉。全程需密切监测小鼠是否出现高热迹象。
- 将小鼠转移至固定装置中，确保可方便接触尾静脉。
- 旋转尾部 90°，使静脉朝上。静脉沿尾部两侧纵向走行，任一侧均可用于注射。
- 用酒精棉片清洁注射部位，使用带 26 或 28 号针头的 1 ml 注射器缓慢注入 100 μl（含 106 个巨噬细胞）。进针时针尖斜面朝上，以轻微角度几乎平行于静脉刺入。
- 若针头位置正确，则推注时无明显阻力，注射后静脉应变得透明。若针头未进入静脉，尾部会出现肿胀。一旦发生此情况，应立即拔出针头，在上次尝试位置的近端或另一侧静脉重新注射。每次注射必须使用新针头，因尾部组织较坚韧，针头在尾静脉注射过程中会迅速变钝。
- 注射完成后拔出针头，轻压注射部位直至出血停止，并继续观察小鼠至少 5 分钟，确保止血完全。
- 每 4 天重复一次巨噬细胞注射，以在整个实验过程中持续递送极化巨噬细胞。
- 实验结束时，在进行各项实验分析的同时，取目标部位组织，用多聚甲醛或福尔马林固定，通过免疫组织化学染色确认极化巨噬细胞的有效递送。
4. 典型结果
任何特定组织中常驻巨噬细胞的数量和表型均取决于所检测的组织类型，并会在感染或炎症过程中发生变化。同样，含氯膦酸盐的脂质体清除组织中巨噬细胞的能力也取决于给药途径以及向靶组织的有效递送。腹腔注射含氯膦酸盐的脂质体可导致右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠结肠中F4/80+巨噬细胞减少，通过巨噬细胞标志物F4/80的免疫组织化学染色可明显观察到这一现象（图1A）。组织切片的组织学染色也可用于确定巨噬细胞数量和表型的定量差异。图1B显示，与仅注射磷酸盐缓冲液（PBS）作为对照的小鼠结肠中未检测到清除效果相比，含氯膦酸盐的脂质体平均可清除约55%的巨噬细胞。每个数据点的数值均通过对6只小鼠的连续组织切片中F4/80和ArgI染色阳性细胞进行计数得出，每只小鼠取3个位点，每个位点分析3张切片，计数由两名对实验条件设盲的研究人员独立完成。这些结果表明，腹腔注射氯膦酸盐脂质体可在小鼠中有效清除结肠巨噬细胞。
在不同生长因子存在下，从小鼠骨髓中诱导生成巨噬细胞，可获得经典活化的巨噬细胞（MCSF诱导或MCSF诱导后经IFNγ处理）或替代活化的巨噬细胞（GM-CSF诱导、IL-3诱导，或MCSF诱导后经IL-4处理）。从小鼠两只股骨和两只胫骨中冲洗骨髓，通常每只8周龄小鼠可获得6×107个有核细胞，进而分别获得8×106个MCSF诱导的巨噬细胞、10×106个GM-CSF诱导的巨噬细胞或12×106个IL-3诱导的巨噬细胞。图2A显示了经脂多糖处理24小时后，巨噬细胞上清液中的亚硝酸盐含量及IL-12p70/IL-10比值。图2B展示了来自MCSF ± IL-4诱导条件下的0.5×106个巨噬细胞的典型Western blot分析结果，使用针对替代活化巨噬细胞标志物ArgI、YM1的抗体进行检测，并以GAPDH作为上样对照。这些数据表明，骨髓来源的巨噬细胞在诱导过程中可偏向于形成极化表型。
有效转移 离体 移植的极化巨噬细胞向组织的归巢取决于给药途径及对组织的可及性。在DSS诱导的结肠炎期间，静脉注射的巨噬细胞可迁移至炎症部位，而替代激活的巨噬细胞可减轻疾病严重程度。 图 3A 显示了注射极化骨髓来源巨噬细胞的小鼠结肠组织切片中巨噬细胞总数及ArgI+（替代性活化）巨噬细胞数量。通过疾病活动指数（基于体重减轻、直肠出血和粪便稠度降低的累积评分）展示了极化巨噬细胞向结肠转移对DSS诱导结肠炎的影响。图3B。这些结果表明 离体 衍生的过继性转移巨噬细胞可迁移至结肠并影响诱导性炎症。M1型巨噬细胞对炎症无显著影响，而M2型巨噬细胞可显著降低疾病活动指数。
图1. 含氯膦酸盐的脂质体可有效耗竭小鼠结肠中的 F4/80+ 和 F480+ArgI+ 细胞 体内. 采用混合遗传背景（C57BL/6 × 129Sv）的野生型小鼠F2代，给予5% DSS处理7天，在DSS处理前4天以及DSS处理期间的第0、2、4和6天，分别通过腹腔注射给予PBS（对照组）或含氯膦酸盐的脂质体（氯膦酸盐组）。(A) 取出结肠组织，固定后进行免疫组织化学染色，检测成熟巨噬细胞（F4/80）及M2型巨噬细胞标志物ArgI。(B) F4/80+ 和 ArgI+ 巨噬细胞的定量分析。由两名研究者在不知分组情况下，于每只小鼠3个切片中各选取6个视野，以40×放大倍数计数阳性染色细胞，每组共6只小鼠。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。<0.01.
图2. MCSF诱导的巨噬细胞表现出经典活化表型，而经IL-4处理的MCSF诱导巨噬细胞则表现出替代性活化巨噬细胞表型。（A）与经典活化表型一致，MCSF诱导的巨噬细胞在脂多糖刺激下产生更高水平的一氧化氮，可通过Griess法检测其下游代谢产物亚硝酸盐进行测定。这些细胞还产生较高的IL-12p70/IL-10比值，可通过ELISA检测。*P<0.01，n=3。（B）与替代性活化表型一致，经IL-4处理的MCSF诱导巨噬细胞组成性表达YM1和ArgI，可通过Western免疫印迹法检测。数据代表3次独立实验，结果相似。
图3. 静脉注射， 离体-衍生的替代性活化巨噬细胞迁移至结肠并减轻肠道炎症。在混合C57BL/6 × 129Sv遗传背景的野生型小鼠F2代中，给予5% DSS饮水连续6天。在DSS处理期间的第0天和第4天，通过静脉注射M1和M2型巨噬细胞。（A）取出结肠组织，固定后进行免疫组化染色，检测成熟巨噬细胞（F4/80）及M2型巨噬细胞标志物（ArgI）。对照组注射PBS的小鼠（C）、注射M1巨噬细胞的小鼠（+M1）及注射M2巨噬细胞的小鼠（+M2）的巨噬细胞定量分析，通过在每只小鼠3个组织切片中各选取6个视野（40×放大），计数阳性染色细胞完成，每组包含6只小鼠。计数由两位对实验分组设盲的研究人员独立完成。（B）治疗期间每日监测疾病活动度并进行评分，评分为体重减轻、直肠出血和粪便性状减低三项指标的加和。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。<0.05，n = 6 只小鼠，来自 2 次独立实验。
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讨论
巨噬细胞是一类具有吞噬功能的细胞，在免疫系统中发挥重要作用。它们负责启动固有免疫反应并调控获得性免疫反应。通常情况下，经典活化的巨噬细胞由IFNγ或LPS激活，主要负责清除病原体并引发炎症反应1相反，替代性活化的巨噬细胞由IL-4或IL-13激活，在炎症消退过程中参与碎片清除和组织重塑。1肠道中的特化巨噬细胞保留了其杀菌活性，但不会引发促炎反应2这种对有益菌群和食物抗原的耐受性，使得机体能够在清除突破上皮屏障的物质的同时，避免引发不适当且可能具有病理性的免疫反应。3结肠巨噬细胞功能异常可能与多种病理状态相关，包括炎症性肠病、肠易激综合征和结直肠癌。3-5巨噬细胞表型依赖于局部微环境，因此界定其在健康或疾病中的作用具有挑战性。本文所述方案可实现从复杂组织中耗竭巨噬细胞 体内 环境。此外，为了研究巨噬细胞表型的作用 原位，可获得表型明确的极化巨噬细胞 离体 从骨髓穿刺液中分离并过继转移至小鼠，可选择性预先耗竭巨噬细胞。
含氯...
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致谢
本研究获得了加拿大克罗恩病和结肠炎基金会向LMS提供的“研究资助拨款”支持，LMS还获得了加拿大胃肠病学会/加拿大健康研究学会/加拿大克罗恩病和结肠炎基金会新研究者奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含氯膦酸盐的脂质体 | Clodronateliposomes.org | ||
| 含PBS的脂质体 | Clodronateliposomes.org | ||
| 无菌 PBS，pH 7.4 | Invitrogen | 14190 | |
| IMDM | Invitrogen | 12440 | |
| 胎牛血清（FCS） | Invitrogen | 12483 | |
| 乙酸 | BDH Aristar | BDH3092-500MLP | |
| 单硫代甘油（MTG） | Sigma | 96-275 | |
| 重组小鼠MCSF | Stemcell Technologies | 02951 | |
| 重组小鼠GM-CSF | Stemcell Technologies | 02935 | |
| 重组小鼠IL-3 | Stemcell Technologies | 02903 | |
| 重组小鼠IFNγ | Stemcell Technologies | 02746 | |
| 重组小鼠IL-4 | Stemcell Technologies | 02714 | |
| 细胞解离缓冲液 | Invitrogen | 13150-016 | |
| 大鼠抗F4/80抗体 | AbD Serotec | MCA497GA | |
| 小鼠抗ArgI抗体 | BD 转导实验室 | 610708 | |
<强>表1. 本方案中使用的特定试剂。 |
参考文献
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