单细胞与多细胞环境中侵袭足介导的细胞外基质降解的定量测量

摘要

我们描述了一种用于制备荧光明胶包被的显微镜盖玻片的典型方法，以可视化由侵袭性伪足介导的基质降解。本文介绍了利用现有软件进行计算分析的技术，可用于定量混合细胞群体中单个细胞以及涵盖整个显微视野的多细胞群体所导致的基质蛋白水解水平。

摘要

细胞向局部组织的侵袭是发育和稳态维持中的重要过程。侵袭过程的失调及随之发生的细胞迁移是多种病理过程的特征，包括炎症、心血管疾病和肿瘤细胞转移。¹上皮或内皮基底膜中细胞外基质（ECM）成分的局灶性蛋白水解降解是启动细胞侵袭的关键步骤。在肿瘤细胞中，广泛的 体外 分析表明，细胞外基质的降解是由富含腹侧肌动蛋白的膜突起结构（称为侵袭性伪足）完成的^2,3侵袭伪足在紧邻细胞外基质（ECM）的位置形成，并通过基质金属蛋白酶（MMPs）的作用调控ECM的降解。肿瘤细胞形成侵袭伪足的能力与其侵入局部间质及邻近血管结构的能力直接相关。³.

利用荧光显微镜观察细胞在包被了染料标记基质蛋白的玻璃盖玻片上形成的侵袭伪足介导的细胞外基质（ECM）降解，已成为评估基质蛋白水解程度和细胞侵袭潜能的最常用技术^4,5。本文介绍一种使用 commercially available Oregon Green-488 明胶偶联物制备荧光标记玻璃盖玻片的标准方法。该方法易于扩增，可快速制备大量包被的盖玻片。我们展示了在此过程中常遇到的一些常见显微镜伪影，并说明如何避免这些问题。最后，我们描述了使用 readily available 计算机软件进行定量分析的方法，以评估单个细胞及整个细胞群体介导的标记明胶基质降解情况。所述实验流程能够准确且可重复地监测侵袭伪足活性，也可作为评估调控蛋白表达或测试抗侵袭化合物在单细胞和多细胞环境下对细胞外基质降解效果的平台。

方案

1. 俄勒冈绿488-明胶包被盖玻片的制备

1. 配制未标记的5%（w/w）明胶/蔗糖储备液：将1.25 g明胶和1.25 g蔗糖加入PBS中，定容至50 ml。将明胶储备液在37 °C下温育 °C，并确保完全融化后使用。将最终混合物储存在4 °C.
2. 将直径为13 mm的1号玻璃盖玻片分别放入24孔塑料细胞培养板的每个孔中进行清洗。每孔加入500 μ向每个孔中加入1 mL 20%硝酸，孵育30分钟。吸除硝酸溶液，用去离子水洗涤盖玻片三次。
3. 用500覆盖盖玻片 μ50 分之 1 μ每孔加入 g/ml 多聚-L-赖氨酸（由 0.1% 储存液用去离子水稀释而成），室温孵育 20 分钟。吸除溶液，用 PBS 洗涤三次。多聚-L-赖氨酸包被有助于上层标记明胶的均匀涂布与牢固结合。
4. 加入500 μ向每个孔中加入0.5%戊二醛（使用前新鲜配制），并将24孔板置于冰上孵育15分钟。吸除液体，用预冷的PBS洗涤3次。在进行明胶包被前，务必彻底去除所有PBS残留。在所有洗涤步骤中均需将孔板保持在冰上，直至加入明胶。
5. 按照制造商的说明书复溶 Oregon Green 488 标记的明胶，并将该溶液与步骤 (1.1) 中的未标记 5% 明胶/蔗糖溶液一同升温至 37 °C. 将一份 Oregon Green 488 明胶与八份未标记明胶/蔗糖混合稀释即; 500 μ将 Oregon Green 488 明胶加入 4 ml 5% 明胶混合液中）。移液 100 μ37℃下保存的稀释后488-明胶混合物的l °C）将足量明胶滴加到每个盖玻片上，使其自然铺展覆盖整个盖玻片表面，避免手动涂布（手动涂布可能导致盖玻片涂层不均匀，如图所示）。 图3B）。保持稀释后的488-明胶混合物在37℃至关重要 °在包被过程中需保持在 C，以防止过早固化。从这一步开始，应尽可能将盖玻片避光保存，以避免潜在的光漂白。可使用偶联了不同荧光染料的其他细胞外基质蛋白替代Oregon Green 488明胶（见讨论部分）。
6. 待所有盖玻片在同一块24孔板中完成包被后，将24孔板倾斜，通过真空抽吸去除各孔中的多余明胶。将包被好的盖玻片在室温下避光孵育10分钟。
7. 用 PBS 清洗盖玻片三次，然后加入 500 μl 新鲜配制的 5 mg/ml 硼氢化钠（NaBH₄在室温下孵育15分钟，以还原并灭活残留的戊二醛。硼氢化钠会产生气泡，每个盖玻片表面及周围均可见细小气泡。
8. 去除 NaBH₄ 用真空抽吸法快速扫过每个孔的外围，吸出溶液。注意不要吸起在 NaBH 处理过程中从组织培养板底部脱落的任何漂浮盖玻片。₄ 处理。漂浮至顶部的脱落盖玻片可轻轻推回孔底，但需注意避免损坏蛋白涂层。每孔用 PBS 洗涤三次，随后在室温下用 70% 乙醇孵育盖玻片 30 分钟。
9. 采用无菌操作技术，将含有盖玻片的培养板转移至I级或II级细胞培养用层流罩中，用无菌PBS冲洗盖玻片三次。此时，可将盖玻片置于PBS中，避光保存于4℃。 °至少两个月的 C。
10. 将用于降解实验的盖玻片用无菌针头和镊子小心转移至新的24孔板中的空孔内。使用适用于待测细胞类型的完全培养基，使盖玻片平衡1–24小时。操作时需注意避免翻转盖玻片或划伤明胶涂层（参见 图 3B).

2. 在 Oregon Green 488-明胶包被的盖玻片上接种和处理细胞以检测细胞外基质降解

1. 在24孔板的每个孔内的盖玻片上接种3-5×10⁴个细胞。
2. 进行时间进程实验，以确定特定细胞系或细胞类型发生侵袭伪足降解活性的最佳时间。大多数侵袭性细胞需要4-24小时才能观察到明显的降解现象，但该时间范围可能因细胞类型而异，应通过实验确定。为同步侵袭伪足的活性，可用基质金属蛋白酶抑制剂（例如，GM 6001）处理细胞一段时间，随后洗去抑制剂以启动侵袭伪足活性（例如参见⁶）。
3. 用PBS洗涤盖玻片三次，然后加入500 μl 10%缓冲福尔马林磷酸盐溶液固定细胞15分钟。再用PBS洗涤三次，接着用含0.4% Triton X-100的PBS溶液透化处理4分钟。再次用PBS洗涤三次以去除Triton X-100。
4. 采用任何标准免疫荧光染色方案对细胞进行标记（例如参见⁷），同时使用荧光标记的鬼笔环肽对细胞进行共染色以显示肌动蛋白丝（F-actin），并使用定位于侵袭伪足的已知标志蛋白（如cortactin⁵、TKS5⁸或N-WASp⁹）进行标记。若使用Oregon Green 488或FITC标记的明胶，则应避免使用488通道标记的二抗或GFP标记的蛋白，以防信号干扰。
5. 将染色后的盖玻片小心倒置，置于载玻片上的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂或其他类似试剂液滴中，完成封片。
6. 为评估基质降解情况，使用常规荧光显微镜或共聚焦显微镜在相应通道下对细胞成像。由于荧光标记的明胶被蛋白水解作用清除，降解区域在盖玻片上表现为较暗的区域（图4A）。对细胞的肌动蛋白和侵袭伪足标志蛋白进行染色，可在合并图像中确认基质降解位点处存在侵袭伪足（图4A）。
7. 也可通过活细胞成像结合荧光标记的重组蛋白实时监测降解活性，以追踪侵袭伪足的形成及基质降解过程^5,10,11。

3. 通过测量归一化基质降解来定量荧光明胶降解

该分析提供相对于细胞面积或细胞数量的基质降解归一化面积。它适用于分析包含多个细胞的整个显微视野，这些细胞经集体处理后接受了siRNA、生长因子或治疗剂的作用。对于此分析，使用较低放大倍数下采集的图像即可高效地获取细胞群体的相关信息。

1. 在 ImageJ 中打开图像¹²ImageJ 显微图像分析软件可从以下网址下载： http://www.macbiophotonics.ca/imagej/.
2. 通过选择菜单命令“检查比例信息”分析/设置比例尺。 此信息将随多种文件格式自动导入，但如有需要也可手动输入。必须进行适当的缩放设置，以确保测量结果以微米而非像素为单位进行报告。
3. 选择要跟踪的适当测量指标，方法是选择“分析/设置测量。检查 面积 和 阈值限制.
4. 使用荧光明胶图像计算降解面积（图 5A).
5. 对图像进行阈值处理（“图像/调整/阈值）以设定上下像素强度值，用于选择降解区域（以红色标出）； 图5B）。在后续图像中，使用 设置 在“阈值”窗口中点击按钮，为所有图像设置相同的阈值，以客观地选择降解区域。
6. 在某些情况下，采集图像时盖玻片可能并非完全平整，导致明胶的强度在图像中出现变化。如果这种变化在图像阈值处理时引发问题，可通过减去背景来校正明胶区域光照不均的情况（“处理/减去背景）或使用带通滤波器过滤（"处理/快速傅里叶变换/带通滤波器）或伪平场滤波器（“Process/Filters/Pseudo Flatfield”），直至背景强度均匀。
7. 测量基质降解区域（"分析/分析颗粒“分析颗粒”窗口中，选择颗粒大小 > 0 以去除选区中的噪声。显示 大纲 以识别感兴趣区域（ROIs）。检查 显示结果 和 总结 以显示测量结果。如果图纸已明确标出所有降解区域图5C），将总面积测量值复制到电子表格中。如果选择了其他对象（如碎片），仅记录相关感兴趣区域（ROI）的面积。
8. 使用鬼笔环肽染色（F-actin）图像计算细胞面积（图5D).
9. 对图像进行阈值处理（“图像/调整/阈值）以设定像素强度的上限和下限值，从而选中细胞的边缘（以红色标出）； 图 5E）。在后续图像中，使用 设置 在“阈值”窗口中点击按钮，为所有图像设置相同的阈值，以客观地选择细胞区域。
10. 10 测量细胞的面积（“分析/分析颗粒在“分析颗粒”窗口中，选择颗粒大小 > 0 以去除选区中的噪声。显示 大纲 以确定用于分析的区域（图5F）。检查 显示结果 和 总结 以显示区域测量结果。请勿勾选 包含孔洞 如果细胞簇中存在间隙，则簇内未被选中的像素将不计入细胞面积的计算。选择 好的.
11. 复制 面积 将相关感兴趣区域（ROI）的结果导入电子表格。
12. 计算每单位细胞总面积的明胶降解面积¹³.
13. 另一种方法是通过计数细胞核数量来报告每个细胞的降解面积图5G）。如果不同处理组之间的细胞区域因操作而发生变化，则此步骤是必要的。当细胞核分离良好、强度均匀且呈圆形时，自动计数效果最佳。自动计数细胞核（“插件/颗粒分析/细胞核计数器选择 最小和最大颗粒尺寸，一个 阈值法 和一个 平滑方法检查 减去背景，分水岭滤波，将颗粒添加至ROI管理器 和 显示摘要 (图5H).
14. 如果细胞核重叠严重，或形状、纹理不规则，自动计数可能无法产生准确的结果图 5H，右侧箭头）。在此情况下，可使用细胞计数工具（“插件/颗粒分析/细胞计数器）。这将在手动计数过程中标记细胞时进行计数图5I).
15. 将细胞（细胞核）数量复制到电子表格中。计算每单位总细胞数的明胶降解面积。

4. 混合细胞群体中单个细胞明胶降解荧光定量分析

为了评估群体中特定细胞相对于视野内其他细胞所导致的基质降解情况例如转染细胞与非转染细胞）的情况下，可对第3节中的操作步骤进行修改，以测量单个细胞下方的降解区域面积。此时需要增加一个荧光通道用于标记转染细胞。在此情况下，使用更高倍数的显微图像并选择分布良好的分离细胞将更便于定量分析。

1. 通过选择菜单命令“检查比例信息”分析/设置比例尺。 选择“合适的测量指标”以进行跟踪分析/设置测量参数。检查 面积 和 阈值限制.
2. 对于未相互接触的单个细胞，使用F-actin图像识别每个细胞图6A). 阈值 图像（见3.9）图6B）。重要的是要捕捉到细胞的边缘，但阈值内可能包含未被选中的内部孔洞。应使用相同的强度值在各图像间选择细胞边界。
3. 测量细胞面积时，使用“Analyze/分析颗粒 在“分析颗粒”窗口中，选择大小 >0（用于消除噪声），显示 大纲， 并检查 显示结果，添加到管理器 和 包含孔洞 （记录轮廓内的整个区域）。选择 好的 并从结果窗口记录每个细胞的面积。
4. 鉴定哪些细胞已被转染（图6C).
5. 使用荧光明胶图像确定降解区域（图 6D）。如有需要，对明胶图像进行滤波以获得均匀的背景强度（参见3.6）。 阈值 选择降解区域，记录阈值设置参数（图 6E）。在后续图像中，使用相同的上下限强度值（使用 设置 阈值窗口中的按钮，以客观地选择降解区域。
6. 测量细胞下方明胶降解区域的面积。在经过阈值处理的荧光明胶图像上，通过在“ROI Manager”窗口中选择细胞区域作为感兴趣区域（ROI），显示细胞的轮廓。 测量 (图6F记录结果，并计算每个细胞的降解面积归一化值或细胞面积。

5. 代表性结果

该实验流程的总体示意图如图1所示。本实验包括玻璃盖玻片的制备及其表面涂覆荧光标记的明胶，将细胞接种至涂有荧光明胶的盖玻片上，使细胞降解明胶基质，随后对细胞进行固定和荧光标记，以用于荧光显微镜分析；通过成像观察荧光基质以评估基质完整性，并利用计算机软件对明胶基质的降解程度进行客观定量分析。

图1. 整体示意图，突出显示荧光明胶包被、细胞接种、固定与免疫标记以及基质蛋白降解评估中的关键步骤。

准备和包被玻璃盖玻片的关键操作步骤如图2所示。

图2. 示意图展示制备用于明胶基质包被的玻璃盖玻片所涉及的各个步骤。在光照下（灯泡）、冰上（冰块）以及避光条件下（未点亮的灯泡）进行的步骤以卡通形式标出。避光操作步骤有助于防止荧光基质发生光漂白。

若操作得当，盖玻片将被Oregon Green 488偶联明胶均匀包被，在显微镜下观察时呈现均一的荧光信号（图3A）。由于包被、处理、储存或使用包被盖玻片不当而可能出现的典型伪影如图3B所示。

图 3. 明胶包被盖玻片制备与操作过程中可能遇到的伪影示例。A. 共聚焦Z轴扫描的正交视图，显示按照规定方案制备的 Oregon Green 488 标记明胶包被盖玻片典型的颜色和均匀性。盖玻片应具有约 1–2 μm 厚的均匀包被层，如 X-Z（底部）和 Y-Z（右侧）共聚焦平面上所示。B. 明胶包被盖玻片在包被和处理过程中可能出现的伪影包括：包被过程中因混合不充分、手动涂布或明胶混合物局部凝固导致盖玻片覆盖不完全（包被不均）；操作时用针或镊子划伤导致包被基质被移除（刮除）；长时间储存过程中盖玻片表面干燥，形成“鹅卵石”样外观（脱水）；以及成像过程中因长时间或高强度光照导致荧光明胶表面发生光漂白（bleaching）。白色箭头指示光漂白区域，其中包含一个接种的 OSC19 头颈部鳞状细胞癌细胞。Oregon Green 488 标记的明胶被伪彩显示为白色，以增强图像对比度。标尺：10 μm。

在此过程中产生的薄基质为评估细胞降解细胞外基质（ECM）的能力提供了一种灵敏的方法。图4展示了OSCC19细胞在俄勒冈绿-488标记的明胶盖玻片上形成的侵袭性伪足活性示例，通过常规共聚焦显微镜成像，并在三维去卷积后采用容积填充图像渲染技术进行成像。

图4. 侵袭伪足降解细胞外基质活性的代表性示例。A. 侵袭伪足及其对应明胶基质蛋白水解的可视化。将OSC19细胞接种于Oregon Green 488标记的明胶盖玻片上培养10小时后，固定细胞并用罗丹明标记的鬼笔环肽（F-肌动蛋白）和抗皮层肌动蛋白（cortactin）抗体（通过Alexa Fluor 647二抗显色并伪彩为绿色）进行染色。在合并图像中，侵袭伪足表现为F-肌动蛋白和皮层肌动蛋白在细胞质中的局灶性聚集，并与基质中明胶清除区域（基质中的暗孔）重叠。方框内带箭头的区域指示单个侵袭伪足及局灶性基质蛋白水解区域，如下方放大图所示。标尺：10 μm。B. 侵袭伪足穿透细胞外基质的体积填充可视化。将OSC19细胞按(A)中方法接种并染色后，通过采集23个连续的0.32 μm光学z平面切片（共7.04 μm），分别获取罗丹明标记的鬼笔环肽和Oregon Green 488标记的明胶信号。每个通道的原始LSM文件集在AutoQuant X2.2软件中打开，并使用推荐参数（10次迭代，中等噪声水平）对每组图像堆栈进行三维盲去卷积处理。处理后的图像以TIFF堆栈格式保存，随后在NIS Elements软件中打开并以体积视图结合α混合模式进行三维渲染。调整LUT后创建子体积以显示细胞内部边缘存在侵袭伪足的区域。背侧边缘视图显示侵袭伪足（红色，箭头）插入下方明胶层（绿色）。腹侧边缘视图显示突出的侵袭伪足以及盖玻片下方明胶降解区域，表现为绿色基质中出现红色信号的区域（箭头）。展示的总图像区域被裁剪为77 × 65 μm；细胞大小约为60 × 40 μm。

图5展示了按照方案步骤3所述的归一化明胶基质降解定量过程中的若干关键步骤。该方法旨在对整个视野范围内的明胶降解进行无偏定量，适用于评估视野内多个细胞所介导的基质降解情况。

图 5. 屏幕截图展示在显微图像中对全部细胞进行归一化明胶降解的计算机辅助定量分析的关键步骤（如实验方案步骤 3 所述）。所有荧光图像均已转换为灰度图像，以更清晰地显示红色阈值设定和感兴趣区域（ROI）标记。A. Oregon Green 488 标记的明胶图像，显示降解发生处的暗区（“孔洞”）（步骤 3.4）。B. 经阈值处理的明胶图像，以红色突出显示降解区域（步骤 3.5）。C. 示意图显示用于测量降解面积的感兴趣区域（ROI）（步骤 3.7）。D. 罗丹明-鬼笔环肽对 F-肌动蛋白的染色图像（步骤 3.8）。E. 经阈值处理的肌动蛋白图像，以红色突出显示细胞总面积（步骤 3.9）。F. 示意图显示待测细胞区域（步骤 3.10）。G. DAPI 染色的细胞核图像（步骤 3.13）。H. 红色轮廓显示自动计数细胞核的结果（步骤 3.13）。Watershed 滤波器可将相互接触的细胞核分离开（白色箭头）。若细胞核重叠严重，则可能无法被分割为独立个体（红色箭头）。若细胞核形状不规则，可能被分割为多个对象（黄色箭头）。I. 使用细胞计数工具进行手动计数时标记细胞核的结果（步骤 3.14）。

图6展示了在混合细胞群体中量化单个细胞荧光明胶降解过程的若干关键步骤，如方案步骤4所述。在此，可在转染与非转染细胞的混合群体中分析转染细胞的基质降解能力。

图6. 对细胞群中单个转染细胞明胶降解情况进行定量分析的步骤截图。以过表达与FLAG表位标签融合的重组cortactin的单个转染OSC19细胞为例进行说明。所有荧光图像均已转换为灰度图像，以便更清晰地显示红色阈值区域和黄色感兴趣区域（ROI）标记。A. 使用罗丹明-鬼笔环肽标记的三个细胞的共聚焦图像（步骤4.2）。B. 基于F-actin染色结果，应用“阈值”和“分析颗粒”功能后绘制的细胞总面积（步骤4.2–3）。C. 抗FLAG免疫荧光标记的细胞群图像，显示一个表达FLAG标签cortactin的单细胞（以*标记）（步骤4.4）。D. Oregon Green 488标记的明胶图像，其中暗区（“孔洞”）表示发生降解的区域（步骤4.5）。E. 明胶图像经阈值处理后，以红色突出显示降解暗区（步骤4.5）。F. 阈值处理后的明胶图像与B图中细胞轮廓叠加（步骤4.6）。请注意，分析中仅统计位于细胞轮廓内的阈值化像素。位于当前细胞位置之外的降解区域（白色箭头）是细胞随时间在明胶表面迁移所致，不纳入分析范围。

讨论

观察细胞降解细胞外基质的能力，有助于揭示细胞侵袭早期所采用的分子机制。该技术由Wen-Tien Chen于20世纪80年代初首创^4,14,15，通过将荧光标记的细胞外蛋白包被于玻璃盖玻片上，随后进行显微分析，已成为评估多种细胞类型中侵袭伪足功能的主要方法。本方案描述了制备明胶包被盖玻片的基本步骤，所形成的胶原层厚度小于2 μm，适用于大多数常规荧光显微镜和共聚焦显微镜检测细胞对细胞外基质的降解能力^11,16-18，与先前报道的方法类似^19-21。这些特性使得包被盖玻片能够快速制备，并有效检测基质降解的初始阶段。由于底层为坚硬的玻璃表面，所形成的薄明胶基质具有较高的灵敏度，可能有助于促进侵袭伪足的形成，这是细胞对整体基质环境高固有刚度的一种响应²²。然而，此类基质并不适用于侵袭伪足延伸过程或更深入的形态学分析，后者通常需采用较厚的明胶层（30–100 μm）、类似方法包被的Transwell小室或电子显微镜技术来实现^20,23,24。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	Sigma	G1890	猪皮来源
蔗糖	Fisher	BP220
12 mm 盖玻片	Fisher	50-121-5159
24 孔板	Fisher	08-772-1	BD Falcon
硝酸	Ricca	R5326000	20% 溶液
聚-L-赖氨酸	Electron Microscopy Sciences	19320-B	0.1% 溶液
戊二醛	Sigma	G7526	8% 溶液
Oregon Green 488 标记的明胶	Invitrogen	G-13186
硼氢化钠	Sigma	213462
Triton X-100	Fisher	BP151
罗丹明-鬼笔环肽	Invitrogen	R415
抗皮层肌动蛋白抗体（克隆 4F11）	Millipore	05-180
抗 FLAG 抗体	Millipore	MAB3118
Alexa Fluor 647 标记的山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A21235
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930
LSM 510 共聚焦显微镜	Zeiss
ImageJ 软件	公共领域		http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
AutoQuant X2.2 软件	Media Cybernetics
NIS Elements 软件	Nikon