本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。
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摘要
摘要
线粒体通透性转换孔（mtPTP）是一种非特异性通道，形成于线粒体内膜，可转运分子量小于1.5 kDa的溶质。尽管该通道的确切分子身份仍有争议，但已有研究表明亲环素D、VDAC和ANT等蛋白质参与了mtPTP的形成。虽然mtPTP开放在细胞死亡中的作用已得到充分证实1，但越来越多的证据表明，mtPTP在线粒体Ca2+稳态2、生物能量学和氧化还原信号传导3过程中也发挥着生理功能。
mtPTP 的开放由基质 Ca2+ 触发，但其活性可受多种其他因素调节，如氧化应激、腺苷酸耗竭、高浓度无机磷酸盐（Pi）、线粒体膜去极化或解偶联以及长链脂肪酸4。体外实验中，可通过外源性添加 Ca2+ 提高线粒体基质内 Ca2+ 浓度（钙保留能力）来诱导 mtPTP 开放。当线粒体内 Ca2+ 水平达到一定阈值时，mtPTP 开放，促进 Ca2+ 释放，导致质子驱动力耗散、膜电位崩溃以及线粒体基质体积增加（肿胀），最终引起线粒体外膜破裂和细胞器功能的不可逆丧失。
本文介绍一种荧光测定法，可用于对分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放进行全面表征。该检测方法可同时测量 mtPTP 开放时发生的三个线粒体参数变化：线粒体 Ca2+ 处理能力（通过测定反应体系中 Ca2+ 浓度反映其摄取与释放）、线粒体膜电位以及线粒体体积。用于测定反应体系中 Ca2+ 和线粒体膜电位的染料分别为 Fura FF 和 JC-1。Fura FF 是一种膜不通透性、比率型指示剂，在 Ca2+ 存在时其激发波长发生偏移；JC-1 是一种阳离子性、比率型指示剂，在膜电位较低时形成绿色单体，在膜电位较高时形成红色聚集体。线粒体体积的变化通过记录线粒体悬液的光散射来测定。由于 mtPTP 开放检测需要高质量且功能完整的线粒体，本文还描述了获得完整、高度偶联且功能正常的分离心脏线粒体所必需的操作步骤。
方案
1. 小鼠心脏线粒体的分离
- 为分离心脏线粒体，根据当地机构动物护理与使用委员会批准的程序，对小鼠进行麻醉并实施安乐死。
注意：线粒体分离方案的所有步骤都必须在冰上进行。使用预冷的缓冲液以及预冷的培养皿、Falcon 管和 Eppendorf 管。本方案中提供的体积适用于含有 2 个小鼠心脏的样本。
- 取出心脏，置于冰冷的线粒体分离缓冲液（300 mM 蔗糖，10 mM Na-HEPES，200 μM EDTA，pH 7.4）中，冲洗去除血液。
注意：为获得最佳结果，应使用 KOH 和乙酸调节线粒体缓冲液的 pH。
- 将心脏置于冰冷的培养皿上，去除脂肪和心房，用刀片充分剪碎，直至获得均匀的组织样品。
- 将剪碎的心脏组织转移至50 ml Falcon离心管中，加入10 ml含有0.1 mg/ml胰蛋白酶的线粒体分离缓冲液，冰上孵育消化10分钟。
注意：在分离过程中使用胰蛋白酶可提高线粒体的分离得率，因此在不同线粒体制备过程中应保持胰蛋白酶的用量一致。我们建议在不含胰蛋白酶的条件下分离线粒体并检测其功能，以确保该酶不会干扰线粒体的正常功能。
- 加入 10 ml 线粒体分离缓冲液（含 0.1% 无脂肪酸 BSA 和 5 mg 胰蛋白酶抑制剂（大豆）），通过反复倒置试管数次以中和胰蛋白酶。
注意：线粒体分离缓冲液可预先配制，并于 -20 °C 保存。解冻后需检查 pH 值。胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂或 BSA 必须在实验当天加入线粒体分离缓冲液中。
- 在 4 °C 条件下，以低至中等速度离心 1 分钟，回收消化后的组织。
- 将组织重悬于 8 ml 线粒体分离缓冲液（含 0.1% 无脂肪酸 BSA）中，使用配备特氟龙研杵的电动 Dounce 匀浆器进行匀浆（1,200–14,000 rpm，4–6 次）。匀浆过程中保持样品置于冰上。
- 将匀浆液转移至 15 ml Falcon 管中，在 4 °C 条件下以 800×g 离心 10 分钟，沉淀细胞核和组织碎片。
- 收集含有线粒体的上清液至 Eppendorf 管中，在 4 °C 条件下以 8,000×g 离心 15 分钟。
- 小心移除顶部白色层，并用 1 ml 线粒体分离缓冲液洗涤剩余的较深色沉淀（含线粒体）。
- 在 4 °C 条件下以 8,000×g 离心 15 分钟。弃去上清液，将线粒体沉淀重悬于 150 μl 线粒体分离缓冲液中。将线粒体置于冰上，用于后续实验。
注意：为获得功能测定的最佳结果，建议在线粒体分离后4小时内使用。
- 使用 Bradford 法测定线粒体蛋白含量。
2. 分离线粒体的质量控制
2.1. 呼吸控制率（RCR）的测定
- 使用空气饱和的水校准Oxytherm氧电极，以建立最大氧信号线。当获得稳定的氧水平后，加入100 μl新配制的10 mM连二亚硫酸钠溶液，以建立零氧信号线。所有测量在30 °C下进行。
- 向Oxytherm反应室中加入2 ml线粒体呼吸缓冲液（125 mM KCl，20 mM HEPES，3 mM MgCl2，400 μM EGTA，300 μM DTT，5 mM KH2PO4，pH 7.2），并加入1 μM鱼藤酮，密封反应室后开始记录。
- 当氧信号稳定后，加入250 μg线粒体，记录1分钟的基础呼吸。此时呼吸速率应非常低，因为线粒体仅利用内源性底物进行呼吸（State 1呼吸）。
- 加入5 mM琥珀酸，记录信号1分钟。在State 2呼吸期间，耗氧量应有所增加。
- 加入150 μM ADP以诱导State 3呼吸。此时由于通过氧化磷酸化合成ATP，耗氧量应显著增加。持续记录信号直至呼吸速率减慢，表明ADP已消耗完毕并转入State 4呼吸。记录State 4呼吸至少1分钟。
- 加入1 μM CCCP，记录信号1分钟。此时解偶联呼吸应达到最大值。
注意： CCCP 对线粒体呼吸的作用具有剂量依赖性：高浓度的 CCCP 可能抑制氧气消耗，因此应谨慎进行滴定。
- 通过将 State 3 呼吸期间的耗氧速率除以 State 4 呼吸期间的耗氧速率，计算呼吸控制比（RCR）。目标 RCR 应 ≥ 4。
2.2. 线粒体膜完整性的评估（细胞色素 c 检测）
- 用70%乙醇和水彻底清洗Oxytherm反应室，并重复步骤2.1.2–2.1.4。
- 加入1 mM ADP，记录1分钟内的氧气消耗量。
- 加入10 μM细胞色素c。由于细胞色素c不能透过完整的线粒体膜，若呼吸作用增加，表明线粒体膜已破损或受损。
3. 线粒体通透性转换孔开放的检测
- 设置荧光分光光度计以进行线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。使用FelixGx程序创建一个新的硬件配置（Quanta master稳态模式），包括光源、激发单色器、样品室以及分别位于激发单色器90°和270°位置的两个检测器（图4）。为实现最大时间分辨率，在硬件配置菜单中必须禁用两个发射单色器（90°和270°），并启用样品室中90°和270°位置的发射滤光片。此步骤将移除发射波长的电机控制功能，并将每个单色器固定在特定波长。如果未禁用发射单色器，每个检测器将在两个波长之间循环，导致重复测量数据的记录。
- 创建一个新的采集协议，选择“Multi Dye”类型，并输入以下染料参数：
- Fura（高Ca++）：激发波长340 nm，发射波长525 nm（检测器1）
- Fura（低Ca++）：激发波长380 nm，发射波长525 nm（检测器1）
- JC1（聚集体）：激发波长543 nm，发射波长595 nm（检测器2）
- JC1（单体）：激发波长498 nm，发射波长525 nm（检测器1）
- 肿胀：激发波长525 nm，发射波长525 nm（检测器1）
- 将激发和发射狭缝设置为1 nm，温度设置为37 °C。
- 为获得Fura和JC-1的比率信号，生成两条衍生曲线：Fura（高Ca++）/Fura（低Ca++）和JC1（聚集体）/JC1（单体）。
- 手动调节检测器1和检测器2的发射波长分别为525 nm和595 nm。
- 在一次性四面透明甲基丙烯酸酯比色皿中，混合1 ml线粒体测定缓冲液（120 mM KCl，10 mM NaCl，1 mM KH2PO4，20 mM HEPES-Tris，pH 7.2）、1 μM鱼藤酮、5 mM琥珀酸和800 nM Fura FF。加入250 μg线粒体，并将样品放入样品室中。确保磁力搅拌器已开启。
- 开始记录。1分钟后暂停采集，加入500 nM JC-1，然后重新开始采集。JC-1比率信号应上升，表明活性线粒体摄取了染料。持续记录直至JC-1信号达到平台期（通常在5分钟内）。
- 加入20 μM CaCl2。应立即观察到Fura FF比率信号的瞬时升高，这是由于测定缓冲液中Ca2+浓度增加所致，随后因线粒体摄取Ca2+而逐渐下降。JC-1比率信号应出现短暂的瞬时降低，提示线粒体膜电位轻微去极化。
- 等待Fura FF比率信号恢复至基础水平后，再进行下一次CaCl2脉冲（间隔约1-1.5分钟）。以固定间隔重复脉冲，直至线粒体无法继续积累Ca2+并开始向测定缓冲液中释放Ca2+。mtPTP的开放表现为Fura FF比率信号因Ca2+释放而同步升高，JC-1比率信号因膜电位崩溃而下降，以及光散射因线粒体肿胀而减弱（图5）。
- 在mtPTP激活后，分别通过加入1 mM EGTA、1 μM CCCP和5 μg/ml 阿拉丁菌素来验证Fura FF、JC-1和肿胀信号的特异性。
- 为验证mtPTP开放的特异性，可在存在1 μM环孢素A（环亲素D抑制剂）的情况下重复步骤3.6–3.9（环亲素D是mtPTP的组成部分）。在环孢素A存在时，mtPTP的开放所需CaCl2脉冲次数显著多于对照样品（图6）。
4. 代表性结果
图2展示了分离的小鼠心脏线粒体典型的呼吸控制。通过向以琥珀酸为底物进行呼吸的线粒体中添加ADP，可达到状态3呼吸，其特征是与仅含底物的情况相比，耗氧量显著增加。当添加的ADP消耗完毕后，进入状态4呼吸，此时耗氧速率减慢，与添加ADP前的速率相当。呼吸控制比（RCR）通过将状态3呼吸的耗氧速率除以状态4呼吸的耗氧速率获得。细胞色素c测试用于评估线粒体外膜的完整性：当向以琥珀酸和ADP为底物呼吸的线粒体中加入细胞色素c时，若呼吸速率未进一步增加，则表明线粒体外膜完整（图3）。
分离的心脏线粒体中mtPTP开放的代表性图像如图所示 图4在此情况下，通过添加 4 CaCl 诱发 mtPTP 开放2 脉冲（20 μM 每次间隔1.5分钟。通过线粒体Ca几乎同时释放可明显观察到mtPTP的开放2+ （Fura FF 比值信号升高）、线粒体膜电位崩溃（JC-1 比值信号降低）以及线粒体体积增大（肿胀信号降低）。当加入环孢素 A 时，其与线粒体通透性转换孔（mtPTP）中的亲环素 D 组分结合，mtPTP 的开放需要 7 次 CaCl₂ 脉冲刺激2 而不是4（图5).
图 1. 分离心脏线粒体中多参数线粒体通透性转换孔开放实验方案的流程图。从小鼠中取出心脏并利用差速离心法分离线粒体。通过极谱法测定呼吸控制比以及在细胞色素 c 存在下线粒体膜的完整性，对线粒体样品进行定性评估。通过连续添加 CaCl2 诱导分离线粒体中线粒体通透性转换孔的开放，并使用荧光分光光度计监测线粒体内的 Ca2+ 释放、膜电位崩溃以及线粒体基质肿胀来测定孔的开放情况。
图2. 测量 分离心脏线粒体的呼吸控制比（RCR）。在琥珀酸和ADP存在下测定分离心脏线粒体在状态3下的耗氧量，以及在ADP消耗后状态4下的耗氧量。通过添加CCCP检测分离线粒体对解偶联剂的反应。图中数值表示分离线粒体的耗氧速率，单位为nmol/min/mg蛋白。
图 3. 分离心脏线粒体膜完整性的测定。通过在存在琥珀酸和ADP的条件下测定分离线粒体的耗氧量，并在添加细胞色素 c 后进行比较，以评估线粒体膜的完整性。图中数值表示分离线粒体的耗氧速率，单位为 nmol/min/mg 蛋白质。
图4. 用于多参数检测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的荧光分光光度计硬件配置。荧光分光光度计的硬件配置包括光源、激发单色器、样品室，以及两个固定发射波长分别为525 nm和595 nm的检测器。检测器1用于Fura FF高/低Ca2+、JC-1单体及肿胀信号的信号检测；检测器2用于检测JC-1聚集体信号。
图 5. 分离心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。通过依次加入 20 μM CaCl2 诱导 mtPTP 开放，表现为线粒体释放 Ca2+、线粒体膜电位崩溃以及线粒体基质体积增大（肿胀）。胞外线粒体 Ca2+ 和膜电位采用比率型荧光探针 Fura FF（绿色曲线）和 JC-1（红色曲线）进行检测。线粒体肿胀通过在 525 nm 处记录光散射（黑色曲线）来测定。使用 1 μM CCCP 和 5 μg/ml 阿拉梅西汀（一种微生物毒素）验证 JC-1 信号和肿胀信号的特异性。
图6. 在环孢素A存在下，对分离的心脏线粒体中线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放的多参数测量。环孢素A（1 μM）增加了打开分离心脏线粒体中mtPTP所需的CaCl2脉冲次数。
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讨论
本文所述方案介绍了评估分离心脏线粒体中通透性转换孔开放所必需的实验步骤（图1 和图4）：小鼠心脏线粒体的分离方法、确保其完整性和功能性的呼吸控制、监测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放过程中涉及的线粒体参数及其检测所用染料、荧光分光光度计仪器的设置，以及mtPTP开放的表征。本方案所用的荧光分光光度计可同时快速测量这三个参数。然而，基本方案也可使用其他市售仪器完成，尽管时间分辨率会有所降低。也可使用非比率型染料，但无法对Ca2+浓度和线粒体膜电位进行定量测定5。
在检测线粒体通透性转换孔（mtPTP）开放时，获得高质量的线粒体样品至关重要，因为线粒体积累 Ca2+ 的能力以及维持膜电位的能力密切相关。例如，我们发现呼吸控制比（RCR）较低的线粒体表现出 JC-1 聚集减少以及 Ca2+ 转运能力下降。我们用于分离心脏线粒体的方法是在先前发表的方案6, 7基础上改进而来，经呼吸控制比和细胞色素 c...
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致谢
本工作由 HL094536（B.J.H.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| 胰蛋白酶抑制剂（大豆） | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| 连二亚硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 细胞色素 c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| 阿莱霉素 | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| 环孢素 A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| 15 ml 玻璃-聚四氟乙烯匀浆器（Potter-Elvehjem 型） | Wheaton Industries | ||
| 顶置式搅拌器 | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm（带温度控制的氧电极） | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 双发射光谱荧光仪 | Photon Technology International, Inc. |
参考文献
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