Nanotopology细胞粘附在可变角度的全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM）

Summary

细胞粘附在基板上的拓扑结构是由可变角度的总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度测量。

Abstract

表面的拓扑结构， 例如，在衬底上生长的细胞中，确定由可变角度总内部反射荧光显微镜（VA-TIRFM）与纳米精度。将细胞培养在透明的幻灯片，并与荧光标记物均匀地分布在它们的细胞膜中孵育。照明发生由一个平行的激光束根据变量的总内部反射（TIR）的角度，用不同的穿透深度的瞬态电磁场。荧光图像后，在约10个不同的角度照射的记录允许，计算细胞衬底的距离的精度为几纳米。这样确定的各种细胞株， 例如，肿瘤细胞和恶性细胞少，密合性的差异。此外，可能发生的变化时的细胞粘附化学或光动力治疗可以进行检查。与其他方法相比，超分辨率显微镜的光照射保持活细胞的非常小，并且没有损坏预期发生。

Introduction

当光束传播通过的介质的折射率n _1，满足的第二介质的折射率n ₂ 1的一个接口，全内反射发生的所有角度，这是大于临界角的入射角_ΘΘ=反正弦（N ₂ / N _1）。尽管被全反射入射光束的唤起的瞬态电磁场，渗入所述第二介质和呈指数衰减，与从界面的垂直距离z根据I = I _0（z）的^{_{易通/天（Θ）。}} I（z）的对应的电磁场和d（Θ）的强度，所给出的在波长λ的穿透深度

_{D（θ）=（λ/4π）（1} ²罪^2Θ - N ^{_{2 2）-1} / 2}

据报道在文献^1,2中 _{，I（0） 站} |电子乘以传输系数T（Θ），比n ₂ / n _1个与入射光的强度相对应。如果该光束的电场矢量的偏振垂直于入射平面的（ 即所跨越的入射和反射光束的平面），该传输系数由下式给出

T（Θ）= 4余弦^2Θ/ [1 - （n _2个 / nL的_^1）2]

Protocol

1。播种和培养细胞

1. 种单个细胞， 例如 U373-MG或U-251-MG的成胶质细胞瘤细 ​​胞在一个典型的密度为100个细胞/ mm ^2的载玻片上，并成长为4872小时，在培养基中（ 例如与10％胎牛血清的RPMI 1640培养基和抗生素）使用的培养箱，在37℃和5％CO _2的 。
2. 孵育细胞的膜标记物， 例如 6-十二烷酰基-2-二甲基氨基萘（laurdan）60分钟施加在8μM（培养液中^）4，或细胞质标记的浓度， 例如:钙黄绿素acetomethlyester申请在40分钟浓度为^5μM3，或相关联的膜光敏剂， 例如，原卟啉IX诱导后，培养4小时，其前体5 -氨基乙酰丙酸（5-ALA，1毫摩尔^）4,5。
3. 洗涤细胞用培养基或磷酸盐缓冲盐水（PBS）在荧光显微镜之前

2。 VA-TIRFM

1. 使用一个直立的的显微镜， 例如蔡司Axioplan，并更换冷凝器的照明设备，按文献。 3具有半球形或半圆筒状的玻璃棱镜光学耦合到的对象滑动（参见图1）。
2. 使用的平行准直的激光束成像后的玻璃棱镜和进一步的光学元件（ 例如<....

Discussion

描述了一种方法，用于测量细胞衬底与纳米精度的距离。目前，超高分辨率显微镜的方法， 例如 ，基于结构照明⁷或单分子检测^8-10以及受激发射损耗（STED）显微镜是相当大的兴趣。然而，没有这些技术允许的轴向分辨率低于50nm。此外，需要相当高的为50100 W / cm ²的辐照度为单分子的方法和超过3000瓦/厘米²的受激发射损耗显微镜。这超过太阳辐照度（约100毫瓦/厘米^2）由几个数量级，使之迅速对活细胞的伤害是可能发生的。然而，在VA-TIRFM实验，辐照度可以被限制到小于20 mW / cm ^2的 ，允许几个几分钟甚至几小时的曝光时间没有任何伤害的活细胞^12，所以，持久的实验与MULtiple风险出现的可能。每个实验的主要先决条件是良好的的角校准和均匀照明的清洁对象的幻灯片。

VA-TIRFM技术可施加到相关的技术或生物的表面， 例如测量细胞粘附到透明基板的许多主题。细胞生长，细胞迁移或细.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
名称	公司	类型	评论
恒温箱	Nunc公司	Nunc公司蜂星 QM1300SVBA
层流	霍尔滕安全	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM +10％FCS + 1％青霉素/链霉素	BIOCHROM		栽培介质
玻璃对象的幻灯片	马林费尔德	纯白色的玻璃	使用了特殊的清洗程序
6-十二烷酰基-2-二甲基氨基萘（laurdan）	分子探针		荧光标记（储备液:2 mm的乙醇）
显微镜	卡尔·蔡司	Axioplan 1
激光二极管	PicoQuant	LDH 400与驱动程序PDL 800-B	波长:391纳米
单模光纤系统	点源	kineFlex	可用于准直光学器件
EMCCD相机	安道​​尔	DV887DC	背照式摄像头