可变角度全内反射荧光显微镜下细胞黏附的纳米拓扑结构

摘要

通过变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上黏附拓扑结构的纳米级精度测量。

摘要

利用变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上生长时表面拓扑结构的纳米级精度测定。e.g.，将细胞培养在透明载片上，并与均匀分布于其质膜中的荧光标记物共同孵育。通过平行激光束以不同全内反射（TIR）角度进行照射，产生具有不同穿透深度的渐逝电磁场，从而实现照明。在约10个不同角度照射下采集荧光图像，即可计算出细胞与基底之间的距离，精度达数纳米。由此可确定不同细胞系之间黏附性的差异，e.g. 癌细胞与低度恶性细胞之间的差异。此外，还可检测化学或光动力处理对细胞黏附性可能造成的变化。与其他超分辨率显微技术相比，该方法的光照暴露强度极低，不会对活细胞造成损伤。

引言

当一束光在折射率为 n₁ 的介质中传播并遇到折射率为 n₂ < n₁ 的第二种介质的界面时，若入射角 Θ 大于临界角 Θ_c = arcsin(n₂/n₁)，则会发生全内反射。尽管入射光束被完全反射，但仍会激发出一种倏逝电磁场，该场会穿透进入第二种介质，并随垂直于界面的距离 z 呈指数衰减，其强度表示为 I(z) = I_{0 ^e-z/d(Θ)}。其中 I(z) 表示电磁场的强度，d(Θ) 表示在波长 λ 下的穿透深度，其表达式为

d(Θ) = (λ/4π) (n₁² sin²Θ - n₂²)^-1/2

如文献报道^1,2，I₀ 对应于入射光强 I_e 与透射系数 T(Θ) 及比值 n₂/n₁ 的乘积。若该光束的电场矢量垂直于入射面（即 由入射光束与反射光束所张成的平面）偏振，则该透射系数由下式给出：

T(Θ) = 4 cos² Θ / [1 - (n₂/n

方案

1. 细胞接种与培养

1. 单细胞接种 例如 U373-MG 或 U-251-MG 胶质母细胞瘤细胞，接种密度通常为 100 个细胞/mm²² 在玻璃载玻片上培养细胞，并在培养基中培养48-72小时（例如 RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和抗生素，在培养箱中培养 37 °C 和5% CO₂.
2. 将细胞与膜标记物共同孵育， 例如 6-十二烷酰基-2-二甲氨基萘（laurdan）以指定浓度处理60分钟 8 μM （在培养基中）⁴或细胞质标记物 例如 钙黄绿素乙酰甲酯以一定浓度处理40分钟 5 μM³或一种膜结合型光敏剂 例如 经其前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA；1 mM）孵育4小时后诱导生成的原卟啉IX^4,5.
3. 在进行荧光显微镜观察前，使用培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。

2. VA-TIRFM

1. 使用直立显微镜， 例如 蔡司 Axioplan，并按照参考文献3所述，将其聚光镜替换为照明装置，该装置包含一个半球形或半圆柱形玻璃棱镜，通过光学耦合与样品载玻片连接（参见 图1).
2. 使用一束平行准直激....

讨论

一种用于以纳米级精度测量细胞-基质距离的方法。目前，超分辨率显微镜技术的方法， 例如 基于结构光照明显微技术⁷ 或单分子检测^8-10 以及受激发射损耗（STED）显微镜技术¹¹ 具有相当大的研究兴趣。然而，这些技术均无法实现低于 50 nm 的轴向分辨率。此外，所需的辐照度高达 50­100 W/cm² 单分子方法需要超过 3,000 W/cm² 用于STED显微镜。这超过了太阳辐照度（约100 mW/cm²）²）高出几个数量级，因此很可能迅速对活细胞造成损伤。然而，在VA-TIRFM实验中，辐照强度可被限制在20 mW/cm²以下²，可在不损伤活细胞的情况下实现数分钟甚至数小时的曝光时间¹²因此，进行多次曝光的长期实验显得完全可行。每次实验的主要先决条件是良好的角度校准以及对洁净样品载玻片的均匀照明。

VA-TIRFM 可应用于与技术或生物表面相关的众多研究领域，例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养箱	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
层流柜	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1% 青霉素/链霉素	BIOCHROM		培养基
玻璃载玻片	Marienfeld	纯白玻璃	采用特殊清洗程序
6-十二酰基-2-二甲氨基萘（laurdan）	Molecular Probes		荧光标记物（储备液：2 mM 乙醇溶液）
显微镜	Carl Zeiss	Axioplan 1
激光二极管	PicoQuant	LDH 400 配驱动器 PDL 800-B	波长：391 nm
单模光纤系统	Point Source	kineFlex	与准直光学元件联用
EMCCD 相机	Andor	DV887DC	背照式相机