通过变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上黏附拓扑结构的纳米级精度测量。
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摘要
摘要
利用变角全内反射荧光显微镜（VA-TIRFM），可实现对细胞在基底上生长时表面拓扑结构的纳米级精度测定。e.g.，将细胞培养在透明载片上，并与均匀分布于其质膜中的荧光标记物共同孵育。通过平行激光束以不同全内反射（TIR）角度进行照射，产生具有不同穿透深度的渐逝电磁场，从而实现照明。在约10个不同角度照射下采集荧光图像，即可计算出细胞与基底之间的距离，精度达数纳米。由此可确定不同细胞系之间黏附性的差异，e.g. 癌细胞与低度恶性细胞之间的差异。此外，还可检测化学或光动力处理对细胞黏附性可能造成的变化。与其他超分辨率显微技术相比，该方法的光照暴露强度极低，不会对活细胞造成损伤。
引言
当一束光在折射率为 n1 的介质中传播并遇到折射率为 n2 < n1 的第二种介质的界面时，若入射角 Θ 大于临界角 Θc = arcsin(n2/n1)，则会发生全内反射。尽管入射光束被完全反射，但仍会激发出一种倏逝电磁场，该场会穿透进入第二种介质，并随垂直于界面的距离 z 呈指数衰减，其强度表示为 I(z) = I0 e-z/d(Θ)。其中 I(z) 表示电磁场的强度，d(Θ) 表示在波长 λ 下的穿透深度，其表达式为
d(Θ) = (λ/4π) (n12 sin2Θ - n22)-1/2
如文献报道1,2，I0 对应于入射光强 Ie 与透射系数 T(Θ) 及比值 n2/n1 的乘积。若该光束的电场矢量垂直于入射面（即 由入射光束与反射光束所张成的平面）偏振，则该透射系数由下式给出：
T(Θ) = 4 cos2 Θ / [1 - (n2/n1)2]
在TIRFM测量中，对于检测到的荧光强度，必须将样品所有层的光吸收进行积分，并乘以相关染料的荧光量子产率η以及检测的立体角Ω。如先前报道3，该强度可由下式描述：
IF (Θ) = A T(Θ)òc(z) e-z/d(Θ) dz
如果将所有与入射角Θ和坐标z无关的因素都归入实验常数A中，则当荧光分子的浓度c(z)被视为几乎恒定时，方程3可解析求解
- 或在所有 z ≥ Δ 的坐标处，例如，位于距界面距离为 Δ 的细胞的细胞质内。在此情况下，积分需从 z = Δ 计算至 z = ∞，结果为
IF = A c T(Θ) d(Θ) e-Δ/d(Θ)
- 或在 z = Δ - t/2 与 z = Δ + t/2 之间，即厚度为 t 的薄层内，例如位于距界面距离为 Δ 处的细胞膜。在此情况下，若 t 远小于 Δ，则荧光强度可计算为
IF = A c T(Θ) t e-Δ/d(Θ)，
其中 t 与 Δ 相比很小。
根据公式（4）和（5），若记录了不同角度 Θ 下的荧光强度图像 IF，并以 1/d 的函数形式评估 ln (IF / T d)（公式 4）或 ln (IF / T)（公式 5），即可计算细胞-基底距离 Δ。本文所用的膜标记物 laurdan（见下文）采用公式（5）进行评估。
如先前报道3，图像采集与评估需要满足以下条件：
- 激发光在样品上均匀分布，
- 符合双层模型（基底和细胞质的折射率分别为 n1 和 n2）。当细胞质膜非常薄，且细胞与基底之间的细胞外介质层厚度远小于入射光波长时，该条件成立。
此外，采用中等数值孔径（通常 A ≤ 0.90）的显微镜物镜有利于避免因介质界面近场辐射各向异性导致的亮度偏差。
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方案
1. 细胞接种与培养
- 单细胞接种 例如 U373-MG 或 U-251-MG 胶质母细胞瘤细胞，接种密度通常为 100 个细胞/mm²2 在玻璃载玻片上培养细胞，并在培养基中培养48-72小时（例如 RPMI 1640 培养基，添加 10% 胎牛血清和抗生素，在培养箱中培养 37 °C 和5% CO2.
- 将细胞与膜标记物共同孵育， 例如 6-十二烷酰基-2-二甲氨基萘（laurdan）以指定浓度处理60分钟 8 μM （在培养基中）4或细胞质标记物 例如 钙黄绿素乙酰甲酯以一定浓度处理40分钟 5 μM3或一种膜结合型光敏剂 例如 经其前体5-氨基乙酰丙酸（5-ALA；1 mM）孵育4小时后诱导生成的原卟啉IX4,5.
- 在进行荧光显微镜观察前，使用培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
2. VA-TIRFM
- 使用直立显微镜， 例如 蔡司 Axioplan，并按照参考文献3所述，将其聚光镜替换为照明装置，该装置包含一个半球形或半圆柱形玻璃棱镜，通过光学耦合与样品载玻片连接（参见 图1).
- 使用一束平行准直激光，该激光经玻璃棱镜成像及后续光学元件（例如 凹面镜）再次在样品表面形成平行光束（远心瞳孔光线）。注意确保电场矢量垂直于入射面偏振。
- 使用位于聚光镜内部的可调反射镜，该反射镜成像于样品平面，并以可变的入射角（物光束）照射样品。该可调反射镜可由步进电机驱动，每个位置对应一个通过测角仪测量确定的明确定义的入射角。3.
- 使用临界角 Θ 校准可调反射镜的角度位置c=61.3°，作为玻璃-水界面的固定值。θc 当荧光染料存在时，通过改变Θ可观察到其可视化现象例如 1 mM 黄素单核苷酸（FMN）溶于水中。镜面位于 Θ=Θ 处c 存储在镜片定位程序中。
- 设置相机参数（背照式 Andor Ixon EMCCD，DV887DC，ANDOR Technology，Belfast，U.K.）6），包括温度、增益、记录时间以及扫描速度。
- 使用适当放大倍数的物镜，并优先选择中等数值孔径（例如 40×/0.75 或 63×/0.90 水浸）并将样品载玻片置于显微镜下定位。使用浸油以确保样品与玻璃棱镜之间形成光学接触。在改变照明角度（Θ≥Θ）的条件下，对相同样品记录荧光图像。c 与 Θc 对应于 64.5° 用于细胞-玻璃界面）。一个角度范围 66°-74° 步骤包括 0.5° 建议使用1°。荧光检测时应选用合适的长通或带通滤光片。
3. 数据分析
- 读取在不同角度 Θ 下记录的图像（例如 ASCII 格式），以及相机设置（用于背景 discrimination）、激发波长，和玻璃（n1 = 1.52）与细胞（n2 = 1.37）的折射率，输入至分析程序（LabView；NanoCell）。对于每组参数，穿透深度 d(Θ) 和透射因子 T(Θ) 将自动计算。
- 根据公式 5（膜标记）或公式 4（细胞质标记）选择用于分析细胞-基底距离 Δ 的图像。照明不均匀的单张图像（例如显示条纹）可予以排除。
- 计算细胞-基底拓扑结构图像，并选择合适的颜色编码进行显示。在分析过程中，可显示单个像素的剖面图，如图 2所示。这些剖面图可作为拟合质量的参考指标。
- 保存分析记录。
4. 代表性结果
代表性实验采用由南丹麦大学欧登塞分校分子肿瘤学系Jan Mollenhauer教授实验室提供的基因工程改造的U251-MG胶质母细胞瘤细胞进行。在这些U251细胞的两个亚克隆中，利用Tet-On诱导表达系统过表达肿瘤抑制基因TP53或PTEN，从而使这些细胞的致瘤潜能降低，可被视为恶性程度较低的细胞。未携带抑制基因的高恶性U251-MG细胞作为对照组，同时使用U251-MG野生型细胞进行进一步比较。激发光源采用半导体激光二极管（LDH400配PDL 800-B驱动器，Picoquant，德国柏林），发射近连续的皮秒脉冲序列（波长：391 nm；脉冲能量：12 pJ；重复频率：40 MHz）。
在 图3 TIRFM 图像显示激活了 TP53 肿瘤抑制基因并用 laurdan 孵育的 U251-MG 胶质母细胞瘤细胞8 μM；60 分钟）分别针对不同入射角进行展示 66.0°, 69.0° 和 73.0° 分别对应约140 nm、75 nm和60 nm的隐失电磁场穿透深度。随着穿透深度减小，荧光强度降低（见标尺），且荧光信号来源于细胞更表层的区域。例如 细胞边缘的黏着斑）。细胞-基质距离（以可视化方式显示在 图3d 通过0-600 nm的颜色编码显示，细胞间的差异显著，仅几纳米（白色-黄色）至250-300 nm（深红色）不等。 即 局灶性接触点与较大的细胞-基质距离彼此相邻。这一现象同样存在于PTEN抑癌基因被激活的U251-MG胶质母细胞瘤细胞中。图4d），而U251-MG对照组和野生型细胞的细胞-基底距离相对恒定，典型值为80-100 nm（黄色； 图4b）和150-200 nm（橙红色； 图 4a).
图 1. 直立显微镜中用于VA-TIRFM的照明装置。由步进电机驱动的可调反射镜可实现±0.25°的角分辨率。
图 2. 单个像素的评估曲线（示意图）。当将 ln[IF/T(Θ)] 对 1/d(Θ) 作图时，其斜率代表细胞-基底距离 Δ。该斜率通常可测定至约 ±10% 的精度。一个由非均匀照明导致的异常值已被标记并排除在分析之外。
图 3. U251-MG 胶质母细胞瘤细胞在与 Laurdan（8 μM；60 分钟）孵育后，TP53 抑癌基因激活状态下的全内反射荧光显微镜（TIRFM）图像，以不同照明角度记录（a-c）；通过颜色编码显示细胞与基底之间的距离范围为 0–600 nm（d）；激发波长：391 nm，检测波长：≥420 nm；图像尺寸：210 μm × 210 μm。 点击此处查看高清大图。
图 4. U251-MG 胶质母细胞瘤细胞与基底之间的距离在 0–600 nm 范围内，以颜色编码显示；(a) 野生型；(b) 对照组；(c) 抑癌基因 TP53 激活的细胞；(d) 抑癌基因 PTEN 激活的细胞；激发波长：391 nm，检测波长：≥420 nm；图像尺寸：210 μm × 210 μm。 点击此处查看高清大图。
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讨论
一种用于以纳米级精度测量细胞-基质距离的方法。目前，超分辨率显微镜技术的方法， 例如 基于结构光照明显微技术7 或单分子检测8-10 以及受激发射损耗（STED）显微镜技术11 具有相当大的研究兴趣。然而，这些技术均无法实现低于 50 nm 的轴向分辨率。此外，所需的辐照度高达 50100 W/cm2 单分子方法需要超过 3,000 W/cm2 用于STED显微镜。这超过了太阳辐照度（约100 mW/cm²）2）高出几个数量级，因此很可能迅速对活细胞造成损伤。然而，在VA-TIRFM实验中，辐照强度可被限制在20 mW/cm²以下2，可在不损伤活细胞的情况下实现数分钟甚至数小时的曝光时间12因此，进行多次曝光的长期实验显得完全可行。每次实验的主要先决条件是良好的角度校准以及对洁净样品载玻片的均匀照明。
VA-TIRFM 可应用于与技术或生物表面相关的众多研究领域，例如
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致谢
作者感谢巴登-符腾堡州政府、欧洲联盟—欧洲区域发展基金（Europäische Union - Europäischer Fonds für die regionale Entwicklung）对 ZAFH-PHOTONn 项目的资助，感谢德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）对研究资助项目编号 1792C08 的资助，以及感谢巴登-符腾堡基金会有限公司（Baden-Württemberg-Stiftung GmbH）对“Aurami”项目的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养箱 | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA | |
| 层流柜 | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1% 青霉素/链霉素 | BIOCHROM | 培养基 | |
| 玻璃载玻片 | Marienfeld | 纯白玻璃 | 采用特殊清洗程序 |
| 6-十二酰基-2-二甲氨基萘（laurdan） | Molecular Probes | 荧光标记物（储备液：2 mM 乙醇溶液） | |
| 显微镜 | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| 激光二极管 | PicoQuant | LDH 400 配驱动器 PDL 800-B | 波长：391 nm |
| 单模光纤系统 | Point Source | kineFlex | 与准直光学元件联用 |
| EMCCD 相机 | Andor | DV887DC | 背照式相机 |
参考文献
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