诺如病毒是胃肠炎的主要病因之一，但针对其进行表征的分子技术仍相对较新。本文报道了两种不同的反向遗传学方法，可高效拯救小鼠诺如病毒（MNV），该病毒是此类病毒中唯一可在细胞培养中增殖的成员。
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摘要
摘要
人类诺如病毒是全球大多数胃肠炎（GE）病例的致病原因，在无法避免人际密切接触的环境中反复出现这一问题 1, 2近年来，医院内暴发疫情的频率有所上升，导致医疗机构的正常运营受到显著影响，并造成巨大的经济损失。由于人类诺如病毒无法在细胞培养中完成有效的感染过程，新型抗病毒方法的研发受到了限制。 3最近分离出一种与人类诺如病毒密切相关的鼠诺如病毒（MNV） 4 但可在细胞中扩增 5 为这些病原体的研究开辟了新的途径 6, 7.
MNV 的复制会导致新的正义基因组 RNA 分子和亚基因组 RNA 分子的合成，后者对应于病毒基因组的最后三分之一（图1）。MNV 包含四个不同的开放阅读框（ORF），其中 ORF1 占据了基因组的大部分区域，编码由多聚蛋白前体切割产生的七种非结构蛋白（NS1–7）。ORF2 和 ORF3 位于亚基因组 RNA 区域内，分别编码衣壳蛋白（VP1 和 VP2）（图1）。最近，我们发现一个与 ORF2 重叠但处于不同阅读框的额外开放阅读框 ORF4 具有功能，可编码一种定位于线粒体的毒力因子（VF1）8。
包括诺如病毒在内的正义RNA病毒的复制发生在细胞质中，从而合成新的无帽结构RNA基因组。为了促进病毒翻译，病毒利用多种不同策略，旨在招募宿主细胞的蛋白质合成机制9-11。有趣的是，诺如病毒的翻译由多功能病毒蛋白引物VPg驱动，该蛋白共价连接在基因组RNA和亚基因组RNA的5'端12-14。这种复杂的翻译机制可能是传统反向遗传学方法在病毒回收效率上受限的主要因素之一。
本文报道了两种基于生成5'端加帽的小鼠诺如病毒-1（以下简称MNV）转录本的不同策略。其中一种方法同时涉及 体外 病毒RNA的合成与加帽，而第二种方法则涉及在表达T7 RNA聚合酶的细胞中转录MNV cDNA。这些反向遗传学系统与小型动物模型的建立，为深入解析病毒序列在复制和致病过程中的作用提供了前所未有的研究能力 15-17.
方案
1. 用于感染性MNV恢复的RNA转录与加帽
本方案旨在通过cDNA高效回收具有感染性的MNV 体外 转录及其后续过程 体外 加帽（第1.1节）。将所得的加帽转录本转染入细胞以回收具有感染性的MNV（第1.2和1.3节）。该方法提供了回收MNV最敏感的技术，典型产量超过105 每35毫米（直径）细胞培养皿中的MNV感染单位。具体方案如下：
1.1 合成具有感染性的带帽MNV转录本：
- 用限制性内切酶消化含有野生型MNV cDNA的质粒（pT7:MNV 3'Rz） NheI 以获得线性DNA。 Nhe识别MNV基因组3'端polyA尾之后的一个独特限制性酶切位点图2）。线性化质粒通常使用硅胶柱进行纯化（例如 GFX PCR DNA凝胶条带纯化试剂盒 来自 GE Healthcare）并在 H 中洗脱2O.
- 体外 使用T7 RNA聚合酶按照先前所述方法对线性化载体进行转录 17市面上有许多商业试剂盒可用于大量合成RNA，且具有良好的可重复性，例如 MEGAScript（Life Technologies）和 RiboMAX（Promega）。在进行后续分析之前，通常需对转录反应产物进行DNA酶消化处理；然而，在许多情况下此步骤并非必需，因为如下所述的氯化锂纯化法不能有效沉淀DNA。
- 分析RNA转录反应的一小部分等分试样，通常 0.5 μl 或更短，通过琼脂糖凝胶电泳检测，以确保转录反应高效进行且RNA为全长。尽管许多使用者可能希望运行变性凝胶以准确测定RNA大小，但我们通常采用非变性琼脂糖凝胶电泳作为快速分析RNA完整性的方法。在非变性琼脂糖凝胶上，相对于dsDNA Ladder，由感染性cDNA克隆pT7:MNV 3'Rz产生的MNV基因组迁移位置约为3 Kbp图3).
- 需考虑存在其他可替代的方法用于快速分析RNA完整性，例如使用Agilent生物分析仪（Agilent bioanalyser）图3).
- 请注意，如果上样RNA量过多，可能会导致凝胶分辨率下降。务必确保使用无RNase的试剂配制琼脂糖凝胶，以避免电泳过程中RNA降解，从而影响条带分辨率。将RNA加热至 65 °C 随后在冰上冷却在某些情况下也可能有帮助。
- 纯化RNA样品以去除未掺入的核苷酸。可用的方法有多种，包括基于硅胶柱的方法，但在本方案中，我们通常使用氯化锂作为一种经济有效的替代方法。为此，加入H2O，以达到最终体积 100 μl 然后加入 40 μl 的 氯化锂沉淀溶液 （7.5 M LiCl，50 mM EDTA，pH 8.0，Ambion）并将样品储存于 -20 °C 至少 30 分钟。
- 通过12,000 × g离心沉淀RNA g 在 4 °C 15 分钟。
- 移除上清液，注意不要扰动透明的 RNA 沉淀，并用 150 μl 70% 乙醇。将离心管在 12,000 X g 在 4 °C 15分钟。
- 去除乙醇后将RNA空气干燥，注意避免沉淀完全干燥，否则将难以重悬。
- 然后，将MNV转录本重悬于50-100 μl 的 RNA储存溶液 （Ambion）。应确保所有RNA完全溶解。如果RNA难以充分溶解，可将样品加热至 60 °C 可能有助于重新悬浮。在进行RNA定量之前，应通过离心去除任何不溶性物质。纯化的转录产物无帽结构，需要后续处理 体外 加帽步骤以具备感染性（ScriptCap m7G 加帽系统，Epicentre Biotechnologies）。
- 通过分光光度法对RNA进行定量。根据转录反应的性质和规模，典型产量范围为50-150 μg 每微克 RNA 100 μl 转录反应。在加帽反应前，应取100-300 ng样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，以分析RNA的完整性。图3).
- 为提高RNA加帽效率，将60至 70 μg MNV RNA转录本的 65 °C 孵育10分钟，然后立即将离心管置于冰上。此步骤可降低RNA结构对加帽反应可能产生的抑制作用。在预冷的微量离心机中瞬时离心，以收集加热过程中形成的液滴。
- 按照制造商建议配制加帽反应混合液（ScriptCap m7G 加帽系统，Epicentre Biotechnologies）。简而言之，加入60-70 μg 将MNV RNA加入至终反应体积 100 μl. 加帽反应体系可能包含 10 μl 10倍加帽缓冲液（500 mM TrisHCl pH 8.0, 60 mM KCl, 12.5 mM MgCl2） 10 μl 10 mM GTP 0.5 μl 20 mM S-腺苷甲硫氨酸 2.5 μl Scriptguard（100单位） 4 μl Scriptcap酶（40单位）
- 在反应体系建立过程中，将RNA转录本置于冰上以防止降解。充分混匀反应混合物，然后在指定条件下孵育 37 °C 孵育1小时。注意：反应体系的规模可根据所需加帽转录本的量进行相应调整。
- 使用上述方法通过LiCl沉淀纯化RNA（参见步骤1.1.6）。将沉淀溶于50-100 μl RNA储存溶液（Ambion）中，并定量RNA含量。通常，后续将RNA样本归一化至 1 μg/μl再次检查所有RNA是否已充分溶解。若未完全溶解，将样品加热至 60 °C 使其溶解。在进行RNA定量之前，通过离心去除不溶性物质。
- 在进行转染步骤之前，再次检查RNA的完整性。为此，取100–300 ng样品上样至1%琼脂糖凝胶中电泳图3).
1.2 通过氖介导的转染将 RNA 转入 Raw264.7 细胞以实现恢复：
为了在许可性细胞系中回收MNV感染性病毒粒子，可将带有帽子结构的MNV转录本通过电穿孔法转入Raw264.7细胞中 Neon 转染 系统（Invitrogen）。Raw264.7 细胞易受 MNV 感染，可支持多轮病毒复制及后续再感染。因此，典型的病毒产量将超过 105 每毫升感染单位在转染后24小时，但达到峰值于 >107 48 小时后的感染单位
- 转染前一天，将 Raw264.7 细胞以约 50% 汇合度接种。通常每 3 次转染需要两个 T75 培养瓶的细胞。
- 转染当天，用含 10% 胎牛血清（FCS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）刮取细胞单层，通过反复吹打确保形成单细胞悬液。
- 使用台盼蓝染色排除法，在血细胞计数板中测定活细胞浓度，以标记死细胞。
- 在 1,200 × g 条件下离心 5 分钟使细胞成团，然后重悬于含 10% FCS 的 DMEM 中，终浓度为 8 × 106 个细胞/毫升。
- 转染前立即为每次转染分装 1 毫升细胞悬液，并在 1,200 × g 条件下离心 2 分钟。吸除培养基，用 500 μl 不含 Mg2+/Ca2+ 的 PBS 洗涤细胞，再次在 1,200 × g 条件下离心 2 分钟。请注意，应尽可能长时间地将细胞保留在 DMEM 中，因为长时间存放在 PBS 中可能影响细胞活力和转染效率。
- 从离心管中移除 PBS，加入 130 μl 重悬液（Neon 转染系统试剂盒，Invitrogen），使细胞终浓度为 6 × 107 个细胞/毫升。重悬细胞时应小心操作，避免产生气泡，否则在转染过程中会引起火花放电，影响细胞存活。
- 向细胞中加入适量带帽的 MNV 转录本（图 2），通常向 130 μl 重悬细胞中加入 1.3 μg 带帽 RNA，并轻轻混匀。然后吸取 100 μl 混合液至 100 μl Neon 转染尖端。需特别注意确保电穿孔比色皿（Neon 转染系统试剂盒 100 μl 尖端）中无气泡形成，否则将导致实验失败。
- 使用单次脉冲（1,700 V，25 毫秒）进行电穿孔，确保脉冲过程中无火花产生，火花提示样品中存在气泡。若出现火花，应弃去该样品并重复转染。将细胞释放至含有 1 毫升不含抗生素、含 10% FCS 的 DMEM 的离心管中。请注意，若需更多转染细胞，同一尖端可重复使用最多三次，但仅限于相同的 RNA 样品。
- 随后，将管中细胞分装至各独立孔中，每孔加入适量预热的不含抗生素、含 10% FCS 的 DMEM。一般而言，步骤 1.2.8 中制备的 150 μl 细胞悬液足以用于一个 24 孔板的单孔（含 0.5 ml 预热 DMEM），而 300 μl 适用于 12 孔板的单孔（含 1 ml 预热 DMEM）。
- 将细胞置于 37 °C、10% CO2 条件下培养 24 至 72 小时。然后通过一次或多次冻融循环释放细胞内的感染性病毒颗粒，并采用空斑实验或 TCID50 法测定样品中的病毒滴度。请注意，裂解物在滴定前应通过最大转速离心 1–2 分钟或经 0.22 μm 孔径滤膜过滤以澄清。通常，MNV 在转染后 24 小时病毒滴度可达约 1 × 106 TCID50/ml，72 小时可达 1 × 109 TCID50/ml。
- 引入 pT7:MNV 3'Rz 质粒中的突变是否存在及其稳定性，通常通过在 Raw264.7 细胞中连续传代 2 至 5 次后对拯救出的病毒进行测序来确定。
1.3 通过脂质体转染法在 BHK-21 细胞中进行回收：
通过脂质体转染法（Lipofectamine 2000，Invitrogen）从加帽转录本中回收具有感染性的MNV，是一种更直接且通常更具成本效益的方法。由于Raw264.7细胞使用脂质为基础的方法转染较为困难，我们通常采用其他易于转染的细胞系，例如源自幼年仓鼠肾成纤维细胞的永生化细胞系BHK-21。在本实验室的标准操作中，我们使用BHK-21细胞系的衍生细胞BSR-T7，因为这些细胞不仅易于转染并支持MNV复制，而且缺乏合适的受体，从而阻止多轮再感染的发生。因此，该系统产生的病毒产量反映了单个复制周期的病毒增殖情况。当研究突变对病毒回收的影响时，该方法尤为适用，因为它与Neon介导的转染相比，可在显著降低成本的同时进行多次转染，且无需专用设备。值得注意的是，其他 readily available 的细胞系，如人胚肾293T细胞，也能有效支持MNV的回收，但应首先优化转染条件，以确保高效的RNA递送。
- 用胰蛋白酶消化BHK-21细胞（或BSR-T7细胞）的单层细胞，将7.5 × 105个细胞接种至直径35 mm的培养皿中，使用不含抗生素的生长培养基，在37 °C、10% CO2条件下过夜培养。若转染实验计划在接种当天进行，则每皿细胞数量加倍，并在37 °C、10% CO2条件下孵育2–3小时使细胞贴壁。请注意，适用于该方法的其他细胞还包括人293T细胞、人肝细胞癌Huh7细胞以及非洲绿猴Cos7细胞。
- 移除细胞培养基，更换为3 ml不含抗生素的新鲜培养基，以确保转染效率最大化。
- 将1–2 μg带帽的MNV转录本溶于100 μl Opti-MEM（Invitrogen）中，另将4 μl Lipofectamine 2000预先与100 μl Opti-MEM混合，再将两者混合。通过移液器上下吹打15次充分混匀样品，室温静置20分钟。
- 将含有带帽MNV转录本的转染复合物逐滴加入细胞单层中，并轻轻沿相互垂直的方向摇动培养皿。
- 在37 °C、10% CO2条件下孵育细胞24至72小时。随后通过反复冻融释放细胞内的感染性病毒颗粒，并通过空斑实验或TCID50法测定病毒滴度。通常可获得约1 × 106 TCID50/ml的病毒产量。
2. 在表达T7 RNA聚合酶的细胞中直接从cDNA回收具有感染性的MNV
本方案旨在通过细胞内表达的T7聚合酶转录携带全长基因组cDNA序列的感染性质粒，从而实现在细胞中恢复鼠诺如病毒（MNV）的感染性。尽管该方法可使用多种细胞系来恢复具有感染性的MNV，但我们通常在BHK-21和BSR-T7细胞中获得最高的病毒产量15。我们通常选用BSR-T7细胞，因为其生长速度比亲本BHK克隆细胞系更快。实验中，用编码T7 RNA聚合酶的禽痘病毒（FPV-T7）18感染细胞，该病毒作为辅助病毒驱动病毒RNA的表达，进而实现感染性病毒的恢复（图4）。尽管BSR-T7细胞组成型表达T7 RNA聚合酶，但其表达水平不足以在转染pT7:MNV 3'Rz质粒后、缺乏辅助病毒FPV-T7的情况下拯救出具有感染性的MNV。虽然该系统通常获得的病毒滴度至少比上述方法低10倍，但此方法仍为突变体的快速筛选提供了有效途径，可用于识别导致病毒功能受损的突变。通常首先采用该方法评估cDNA构建体的可行性。若某一构建体无法产生感染性病毒，或产生的病毒量明显低于野生型感染性克隆，则需进一步采用上述基于RNA的方法进行验证。
- 用胰蛋白酶消化BHK-21细胞（或BSR-T7细胞）单层，将7.5 × 105个细胞接种至35 mm培养皿中，使用不含抗生素的生长培养基，在37 °C、10% CO2条件下培养过夜。若转染操作计划在接种当天进行，则每孔接种细胞数量加倍，并在37 °C、10% CO2条件下孵育2–3小时，使细胞贴壁。
- 吸除细胞培养基，每孔加入700 μl FPV-T7（图4）。通常使用的感染复数（MOI）约为每个细胞0.5 PFU，该数值基于在原代鸡胚成纤维细胞上的滴定结果。但需注意，新制备的在原代成纤维细胞中扩增的辅助病毒需通过功能性滴定确定高效病毒回收所需的剂量。FPV-T7的增殖与滴定方案此前已有描述18。
- 在37 °C、10% CO2条件下孵育1小时，使FPV-T7感染细胞。随后加入2 ml含10%胎牛血清（FCS）的无抗生素DMEM培养基，在37 °C、10% CO2条件下继续孵育1小时，以促进T7 RNA聚合酶的表达。
- 进行感染性质粒转染时，首先吸除感染细胞的培养基，用2 ml培养基（含10% FCS的无抗生素DMEM）洗涤细胞，最后加入3 ml培养基覆盖细胞单层。培养基中不应添加抗生素，因其可能干扰Lipofectamine 2000（Invitrogen）的转染效率。
- 在100 μl Opti-MEM（Invitrogen）中加入1 μg野生型MNV cDNA感染性质粒（例如pT7:MNV 3'Rz），再与先前用100 μl Opti-MEM（Invitrogen）稀释的4 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen）混合。用移液器反复吹打15次充分混匀反应液，室温静置20分钟。
- 将所得转染混合液逐滴加入细胞单层中，并轻轻沿垂直方向摇动培养皿以混匀。
- 将FPV-T7感染且转染MNV质粒的细胞在37 °C、10% CO2条件下继续孵育24至72小时。转染感染性质粒pT7:MNV 3'Rz的细胞通常可产生1 × 104至5 × 104 TCID50/ml的病毒滴度。
3. 代表性结果
如图5所示，这两种反向遗传学方法在细胞培养中均能高效恢复具有感染性的MNV。将带有帽子结构的MNV RNA转染至Raw264.7细胞后24小时，可回收到滴度超过105 TCID50/ml的感染性MNV。类似地，将感染性质粒pT7:MNV 3'Rz转染至先前感染了表达T7 RNA聚合酶的辅助病毒FPV（FPV-T7）的BSR-T7细胞，所产生的病毒滴度也远高于104 TCID50/ml（图5）。这些通过合成RNA和DNA分子获得的病毒滴度值，与将来源于感染性病毒颗粒的天然VPg连接RNA转染相同细胞所获得的滴度值相似（图5）。这些结果表明，本文所述的反向遗传学方法在细胞培养中恢复基因组明确的MNV变异株方面具有很高的效率。
图 1. MNV 基因组及用于感染性病毒拯救的质粒示意图。 A，MNV 基因组结构的示意图。每个蛋白质编码区以单个白色方框表示。ORF1 翻译产生 7 种不同的非结构蛋白（NS1/2 至 NS7），这些蛋白通过前体多聚蛋白的自体蛋白水解加工释放。ORF2 编码主要衣壳蛋白 VP1，ORF3 编码次要衣壳蛋白 VP2，而与 ORF2 编码区重叠的 ORF4 编码毒力因子 VF1。基因组 RNA 和亚基因组 RNA 在其 3' 端均含有长度可变的 polyA 尾巴。B，包含 MNV cDNA 的质粒，用于本研究的反向遗传学方法（pT7:MNV 3'Rz）。MNV cDNA 在其 3' 端融合了一段由 26 个核苷酸组成的 polyA 尾巴。MNV cDNA 序列位于截短的 T7 启动子序列的下游，以实现 T7 启动的转录，并位于唯一的 NheI 位点及其后一段编码自切割核酶的 DNA 序列的上游。这些序列有助于确保 RNA 转录在基因组 3' 端的 polyA 尾巴之后立即终止。
图2. 从转录并加帽的RNA中恢复具有感染性MNV的实验流程概览 体外. 质粒 pT7:MNV 3'Rz 在 MNV 基因组序列下游紧邻位置进行线性化处理 NheI型限制性内切酶（步骤1）。DNA纯化后，生成MNV RNA转录本 体外 通过使用T7 RNA聚合酶进行转录（步骤2）。转录产物在非变性1%琼脂糖凝胶电泳中通常表现出约2.5–3 kb的表观迁移率（步骤3， 图3）。使用商品化的无RNA酶DNA酶去除模板DNA。随后通过LiCl沉淀法（步骤4）从游离核苷酸中纯化RNA。纯化后的RNA产物可进一步用于 体外 封口，此前已在 65 °C 以解开二级RNA结构（步骤5-6）。经LiCl沉淀纯化后，将RNA转染至Raw264.7细胞中（Neon转染系统，Invitrogen）或BSR-T7细胞（Lipofectamine 2000，Invitrogen）（步骤7-8）。一旦进入细胞，带帽的RNA转录本将被翻译成病毒蛋白，这些蛋白会催化病毒转录本复制，生成在5'端含有正确VPg分子的新MNV RNA分子。随后的复制循环伴随病毒蛋白翻译，将产生大量病毒基因组，这些基因组将被包裹形成具有感染性的病毒颗粒。为促进病毒从细胞中释放，可进行一次或多次冻融循环（步骤9）。病毒滴度可通过TCID50或噬斑实验方法测定。
图3. 沿着实验流程对MNV RNA转录本完整性的分析 A，合成的MNV RNA的完整性 体外质粒 pT7:MNV 3'Rz 首先使用 NheI型限制性内切酶。DNA纯化后，生成MNV RNA转录本 体外 通过使用T7 RNA聚合酶进行转录（第2泳道）。随后通过LiCl沉淀法将RNA从游离核苷酸中纯化（第3泳道）。转录产物与1-Kb DNA Ladder（New England Biolabs，第1泳道）平行电泳于非变性1%琼脂糖凝胶中。病毒转录本在非变性条件下的相对迁移率与2.5–3 Kb的dsDNA产物相似。B，MNV RNA转录本加帽后的完整性分析。先前经LiCl沉淀法纯化的MNV转录本（第2泳道）进行酶法加帽（第3泳道），再经LiCl沉淀法纯化（第4泳道）。C，分析在一项 安捷伦 RNA 6000 纳米芯片 MNV转录本（第二泳道）和加帽的MNV转录本（第三泳道），二者此前已用LiCl沉淀。同时平行电泳ssRNA ladder。
图4. 从cDNA中恢复感染性MNV的实验流程概览。 首先，用表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组禽痘病毒（FPV-T7）感染BSR-T7（或BHK）细胞（步骤1）。感染后，将细胞孵育2小时，以允许FPV蛋白（包括重组T7 RNA聚合酶）的表达（步骤2）。随后，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将质粒pT7:MNV 3'Rz转染入细胞（步骤3）。进入细胞后，pT7:MNV 3'Rz被T7 RNA聚合酶识别，并启动MNV RNA转录本的合成（步骤4）。基因组3'端含有的自切割δ-核酶序列可确保转录本的3'末端恰好位于polyA尾之后（步骤5）。部分病毒转录本在细胞内被FPV加帽酶进行加帽修饰（步骤6）。由此产生的加帽MNV转录本将被翻译，生成MNV蛋白，进而催化MNV转录本的复制。新合成的、在5'端带有正确VPg分子的MNV RNA分子将经历多轮复制，并伴随病毒蛋白翻译，最终形成具有感染性的衣壳化病毒。为促进病毒从细胞中释放，进行一次或多次冻融循环（步骤7）。随后可通过TCID50或噬斑实验测定病毒滴度。
图5. 不同反向遗传学方法获得的病毒滴度的代表性结果。灰色柱状图表示在Neon转染后24小时获得的病毒滴度，转染细胞数量为2 x 106 Raw264.7 细胞，或经脂质体转染 2 x 106 BSR-T7 细胞 体外 转录并加帽的MNV RNA。白色柱状图表示通常通过脂质体转染pT7:MNV 3'Rz（MNV cDNA）至2 x 106 先前用表达重组T7聚合酶的禽痘病毒（FPV-T7）感染2小时的BSR-T7细胞。为Raw细胞和BSR-T7细胞转染实验设置阳性对照时，我们通常使用 2 μg 来自感染MNV且含有高水平VPg连接的MNV RNA的细胞中提取的RNA。阴性对照使用了MNV RNA或携带移码突变（F/S）的pT7:MNV 3'Rz质粒，该突变可阻断复制，导致无法检测到病毒（数据未显示）。
讨论
本文展示了两种不同的反向遗传学方法，均可在细胞培养中成功拯救具有感染性的MNV。这两种方法均通过生成带有帽子结构的MNV转录本，使其能够被细胞核糖体识别，从而有效绕过病毒RNA基因组5'端必须共价连接VPg蛋白的绝对需求。体外转录后经酶法加帽的方法在拯救感染性MNV方面比在表达T7 RNA聚合酶的细胞中转录感染性质粒的方法更为高效，后者依赖于FPV加帽酶对转录本进行加帽。利用这些反向遗传学系统所获得的病毒滴度与从感染细胞培养物中纯化的VPg连接病毒RNA转染所得滴度相似17（图5）。将带有帽子结构的MNV RNA转染至允许性Raw264.7细胞后，所得病毒滴度仅比转染含VPg连接病毒RNA的感染细胞总RNA实验低1个数量级（图5）。这一结果激励我们进一步研究：若将VPg分子添加至这些系统所产生的转录本5'端，是否可提高病毒产量，从而揭示VPg在MNV细胞感染性中所起的功能机制。尽管如此，我们认为该反向遗传学系统效率极高，可与其他当前常用的RNA病毒反向遗传学系统相媲美——在这些系统中，体外转录的RNA所拯救的病毒滴度通常仅比真实病毒颗粒感染低10至100倍19, 20。
总体而言，当前的方法在诺如病毒分子生物学领域迈出了重要的一步，为我们提供了研究诺如病毒基因组中蛋白质和保守RNA基序功能作用的工具。这些方法已与现有的小鼠模型相结合，并已证明从感染性cDNA获得的MNV可在不到10天内导致>80%的STAT1-/-小鼠发生致死性感染4, 21。利用该系统，我们已成功获得具有衣壳蛋白突变以及多嘧啶 tract（参与多种宿主因子PTB和PCBP结合）突变的可存活小鼠诺如病毒，这些突变体在体内表现出一定程度的减毒表型in vivo21, 22。此外，我们最近证明，缺乏从ORF4表达VF1蛋白能力的病毒在细胞培养中能够有效复制，但在小鼠中的毒力相较于野生型MNV再次表现出降低8。这些研究激励我们基于MNV的研究设计人诺如病毒的减毒株，以探索其作为潜在疫苗候选物的可能性。
披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由授予伊恩·古德费洛（Ian Goodfellow）的惠康信托资深研究员奖和授予阿曼多·阿里亚斯（Armando Arias）的玛丽·居里欧盟内 fellowship（FP7 欧洲研究理事会）资助。我们谨此感谢赵耀康（Io Hong Cheong）、丽贝卡·罗比博士（Dr Rebecca Robey）和迈克·斯金纳博士（Dr Mike Skinner）允许我们使用安捷伦生物分析仪，并协助进行 RNA 样本检测。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化锂沉淀溶液 | Ambion | AM9480 | |
| RNA储存溶液 | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G 加帽系统 | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon 转染系统 | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon 转染系统试剂盒 | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 转染试剂 | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano 试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2939AA |
参考文献
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