本研究报道的新方案通过联合方法实现了在小鼠中以单细胞分辨率选择性检测肺转移灶 原位 肺灌注与固定及X-Gal染色 lacZ标记的肿瘤细胞。
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摘要
摘要
转移是大多数癌症类型患者死亡的主要原因，因此也是癌症研究的主要焦点。然而，通过放射影像学手段检测微转移灶以及成功对其进行治疗根除的效果仍然有限。
尽管动物模型已被证明是癌症研究中不可或缺的工具1，微转移灶的监测与可视化仍是一项挑战，临床前研究中对转移扩散的不准确评估可能导致临床试验结果令人失望2因此，人们迫切希望改进现有方法，以实现在正常组织中对转移灶进行可重复且可靠的单细胞水平检测。研究的主要重点是能够检测肿瘤细胞的技术 体内，如微型计算机断层扫描（micro-CT）、正电子发射断层扫描（PET）、生物发光或荧光成像3,4我们目前正在优化这些技术 体内 不同骨肉瘤模型中原发肿瘤生长和转移的监测。其中部分技术也可用于 离体 转移分析，除qPCR等经典方法外5，流式细胞术（FACS）6 或不同类型的组织学染色。作为基准，本研究建立了肿瘤细胞通过稳定转染或转导 lacZ 编码细菌β-半乳糖苷酶的基因，该酶可将显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）代谢为不溶性的靛蓝染料7 并可在小鼠组织中对肿瘤细胞进行高灵敏度和高选择性的组织化学蓝色染色 离体 直至单细胞水平，如图所示。这是一种低成本且无需复杂设备的工具，可实现对转移的精确验证8 在评估新型抗癌疗法的研究中9-11X-gal染色的一个限制因素是对比度较低 例如 血管丰富组织中与血液相关的红色染色问题。在肺组织中，该问题可通过以下方法解决： 原位 肺灌注，一种近期由 Borsig 建立的技术 等12 在麻醉条件下对小鼠肺脏进行灌注以清除血液并进行固定与包埋的研究人员 原位 通过气管进行充气。该方法还可防止肺组织塌陷，从而维持功能性肺泡的形态，提高组织用于组织学分析的质量。在本研究中，我们描述了一种新方案，该方案结合了X-gal染色 lacZ-表达肿瘤细胞和 原位 肺组织的灌注与固定。该优化后的方案可实现对肺内单个转移细胞的高灵敏度检测，并已在近期一项研究中使我们成功在小鼠模型中检出“静息态”肺微转移灶13，最初被描述为非转移性的14.
方案
1. 原位 肺灌注与固定
- 通过腹腔注射使小鼠麻醉，注射量约为 ~150 μl 含112.5 mg/kg（体重）氯胺酮、16.5 mg/kg 噻拉嗪和15 mg/kg 乙酰丙嗪的磷酸盐缓冲液（PBS）（或含适当镇痛成分的其他麻醉剂）。
- 当小鼠的反射消失后，将其背侧朝下固定在手术台上，并用70%乙醇润湿毛发，使毛发贴服。
- 从腹部向上切开皮肤至颈部，然后将其向两侧拉开或完全去除。
- 打开腹膜和胸腔至充分暴露。避免大血管破裂。例如 颈静脉，以避免后续灌注效率降低。
- 在肝脏下方剪断后腔静脉。
- 使用带有21G至24G针头的20 ml注射器，将10–15 ml PBS缓慢注入跳动心脏的右心室，直至肺组织完全变白且心脏停止跳动（停搏）。
- 用血管钳夹闭肝脏和膈肌上方的血管。
- 使用带有21G–24G针头的10 ml注射器，向右心室注入约2 ml含3%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。
- 在胸腔外暴露气管。使用同一支注射器，将约3 ml的含3%多聚甲醛的PBS溶液从气管头端（胸腔外）注入，直至肺完全膨胀。拔出针头后立即用血管夹夹闭穿刺部位远端的气管，并静置10分钟以完成固定。
- 在血管夹上方横断血管，移除血管夹，向右心室注入约 2 ml PBS 以清除多余的 PFA。
- 用针头刺穿所有肺叶的下部，在气管处移除血管夹，于第一针孔尾侧的气管内注入3-5 ml的PolyFreeze包埋介质与PBS按1:1比例配制的溶液，直至肺叶中的PFA被该溶液完全置换。
- 用镊子夹住心脏，切断结缔组织韧带、血管和气管，小心地取出肺脏。保持心脏与肺脏相连。
- 根据肺组织分析的具体需求，继续进行第2节或第3节中所述的实验方案。如果需同时进行两种分析，可先取下一个肺叶，按第3节所述步骤处理；其余与心脏相连的肺叶则按第2节所述方法处理。
2. 整个肺叶中lacZ标记的转移性肿瘤细胞的可视化
- 将肺组织放入带有紧密封盖的塑料杯中，用含2%甲醛的PBS溶液在室温下固定30-60分钟。
- 去除固定液，并用PBS充分清洗3次。
- 加入至少10 ml新配制的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）染色液（将X-Gal储存液[40 mg/ml溶于二甲基甲酰胺]按1:40比例稀释于基础染色液中；pH 7.1（表1）；避光操作）。
- 在漂浮的肺组织上方覆盖一块纱布，确保其完全浸没于溶液中，并将盖子松松盖上容器，以允许空气交换。
- 在37 °C避光条件下孵育3-5小时。
- 移除X-Gal溶液，用PBS冲洗一次以去除残留染色液（可选），然后加入4%多聚甲醛（PFA）。
3. 肺冷冻切片中lacZ标记的转移性肿瘤细胞的可视化
- 用未稀释的 PolyFreeze 包埋液将已标记的包埋模具填充至 1/3 处。将肺叶置于其上，并继续加入包埋液直至完全覆盖肺叶。注意避免产生气泡。
- 将包埋好的肺组织在 4 °C 下孵育 20 分钟。
- 随后将包埋的肺组织置于干冰与异戊烷的混合液中缓慢冷冻，并在 -80 °C 下保存。
- 在冷冻切片机上切取 7–10 μm 的冷冻切片，并将其贴附于 SuperFrostPlus 显微镜载玻片上。
- 将切片立即置于湿盒中，于 37 °C 下用 X-Gal 染色液孵育 24 小时。
- 用 PBS 漂洗切片两次，每次 5 分钟，然后用蒸馏水短暂漂洗。
- 用核快红复染 10–30 秒，蒸馏水漂洗后，使用 Immu-Mount 封片剂封片。
4. 典型结果
Asai 等 在原始文章中报道，源自亲本Dunn细胞的Dunn衍生LM8骨肉瘤小鼠模型中，皮下原位肿瘤与高转移性的LM8亚系细胞衍生的肿瘤不同，在同基因型C3H小鼠中不会自发形成可检测的肺转移灶14利用本文报道的技术，我们重新研究了Dunn/LM8小鼠骨肉瘤模型中转移灶的形成。我们利用了稳定的 lacZ转导的Dunn和LM8细胞及一种方案 原位 小鼠肺灌注与固定。皮下注射小鼠的灌注肺与未灌注肺的代表性图像 lacZ转导与非转导对照 Dunn 和 LM8 细胞如图所示 图1在注射了对照组Dunn细胞的小鼠中，非灌注肺和灌注肺中均未检测到肉眼及显微镜下转移灶图1A, i-iv）。但有趣的是，在注射了Dunn-lacZ 细胞，X-gal染色显示出单个细胞或小细胞簇的蓝色微转移灶（< 非灌注肺表面的0.1 mm图1A, 六). 原位 肺部灌注与固定进一步提高了邓恩（Dunn）的可检测性lacZ 微转移（图1A, 八）。然而，未观察到向外生长形成肉眼可见的病灶（图1A, v, 七).
在注射了对照 LM8 细胞的小鼠中，未灌注的肺组织表面可观察到透明、微弱且难以察觉的转移灶，其直径大于 0.1 mm（图 1B，i）。对肺组织进行灌注（图 1B，iii）并未改善转移灶的检出效果。然而，在注射了 LM8-lacZ 细胞的小鼠中，未灌注器官表面可检测到多个经 X-Gal 染色呈蓝色的宏观（图 1B，v）和微转移灶（图 1B，vi）。此外，肺组织灌注进一步提高了宏观和微转移灶的可检测性（图 1B，vii–viii）。因此，微转移灶和宏观转移灶呈现出更高的密度和更多的数量，这主要归因于灌注后组织的透明性增强，使得器官表面下方的病灶也变得可见。
使用肺组织冷冻切片进行的额外组织学分析证实，在注射了lacZ转导的Dunn和LM8细胞的小鼠中，肺转移灶的可检测性得到改善。在来源于Dunn-lacZ或LM8-lacZ细胞的原发性肿瘤小鼠中，与相应对照细胞诱导的原发性肿瘤小鼠不同，可在肺组织切片中观察到微转移灶甚至单个细胞病灶（图2）。此外，与注射对照LM8细胞的小鼠相比，注射LM8-lacZ细胞的小鼠肺部大转移灶也更为清晰可见（图2C，D）。
图 1. 在 C3H 小鼠未灌注（i, ii, v, vi）和灌注（iii, iv, vii, viii）肺组织中，检测非转导（i-iv）和 lacZ 转导（v-viii）的 Dunn（A）和 LM8（B）细胞的自发性转移。代表性 X-Gal 染色整体肺组织（A 和 B 中的 v, vii）及其相应放大图像（A 和 B 中的 vi, viii）中可见蓝色转移灶。注射未标记 LM8 细胞的小鼠器官中出现的大转移灶（> 0.1 mm）以星号标示（B 中的 i-iv）。放大图像所示区域代表整个肺组织的典型情况。比例尺在整体肺图像中表示 1 mm，在放大图像中表示 0.1 mm。 点击此处查看大图。
图 2. Dunn 和 LM8 细胞在肺冷冻切片中微转移灶的检测。将包埋于 O.C.T. 中的肺组织切片置于 X-Gal 染色液中，在湿润环境中 37 °C 孵育 24 小时，随后用核固红复染。箭头指示注射了 Dunn-lacZ（B）或 LM8-lacZ 细胞（D）的小鼠肺切片中可识别的微转移灶。注射未转导的 Dunn（A）或 LM8 细胞的小鼠肺切片中则无法检测到微转移灶。比例尺表示 0.1 mm。
讨论
在Dunn/LM8小鼠骨肉瘤模型中获得的上述结果，展示了新建立的结合X-Gal染色方法的强大功能 lacZ标记的肿瘤细胞与 原位 肺组织的灌注/固定。这两种技术的结合不仅能够以单细胞水平的高灵敏度检测微转移病灶，还能改善肺表面大转移灶的可视化效果。图1）以及肺组织切片（图2）。虽然X-Gal染色也可用于检测其他器官中的（微小）转移灶， 原位 灌注/固定仅能略微提高肺外组织中转移灶的检出率，这是由于这些器官本身具有与血液和组织相关的天然颜色13即使灌注被导向其他器官， 例如 肝脏，仅去除血液只能部分改善X-Gal染色与器官天然颜色之间的对比度。然而，该方法适用于任何类型的 lacZ标记的肿瘤细胞，将显著提高肺转移灶的检出率，可灵敏检测至单个静息细胞水平的微小转移灶，并实现对大转移灶和微小转移灶的简便且可靠的定量分析。该方法以及所有基于报告基因（包括荧光素酶和荧光蛋白）的技术均存在一个局限性，即转基因表达的稳定性。如文中所示 图2d，并非所有大转移灶内的肿瘤细胞都呈蓝色，表明缺乏β-半乳糖苷酶活性。这可能与坏死有关，但更可能是由于转基因表达的丢失。我们观察到Dunn和LM8细胞在下调 lacZ 以及在持续选择表达的条件下仍能保持稳定的其他转基因。因此，在近期的研究中，我们转而使用小鼠的 K12 和 K7M2 以及人类的 HOS、143B 和 SaOS-2 骨肉瘤细胞系，这些细胞系均能维持稳定 lacZ 表达 体外 以及 体内 随时间推移可达100%。
一旦稳定 lacZ-表达有保障，该技术可应用于基因改造肿瘤细胞的研究中， 例如 从机制上研究组织定植的过程13 以及用于旨在根除转移性病灶的新疗法的开发与测试15,16此外，它还可作为改进现有放射学成像技术（如PET、(微)CT和MRI）的基准，用于早期检测转移性病灶。在一项近期使用不同示踪剂的PET研究（未发表）中，我们验证了 体内 检测到肺转移灶随后 离体 采用所述方案。在一项正在进行的研究中，使用新型小动物微计算机断层扫描仪（SkyScan），我们迄今能够检测到肺转移灶 体内 缩小至0.5 mm大小 离体 低至0.3毫米，但我们目标是达到0.1毫米的分辨率。有趣的是，这一尺寸界限正是我们采用联合方法区分大转移灶与微转移灶所设定的标准 原位 灌注与X-Gal染色。这再次凸显了该方法灵敏、实用，且简便经济。
致谢
作者谨此感谢苏黎世大学生理学研究所Lubor Borsig博士在肺灌注技术方面提供的建议。 本研究得到了苏黎世州癌症协会、苏黎世Walter L.和Johanna Wolf基金会、苏黎世Lydia Hochstrasser基金会、瑞士国家科学基金会（SNF，瑞士）、瑞士Balgrist协会以及苏黎世大学的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯胺酮（ketamine） | Vétoquinol AG | 100 mg/ml 溶液 | |
| 赛拉嗪（xylazine） | Streuli Pharma AG | 20 mg/ml 溶液 | |
| 普瑞喹兰（acepromazine） | Fatro S.p.A. | 10 mg/ml 溶液 | |
| 布氏型止血钳 | Fine Science Tools | 18051-35 | 弯曲，35 mm |
| 带盖塑料杯 | Semadeni | 2988 | 带盖的25 ml 杯子 |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）；粉末 | Axxora | ALX-582-002-G005 | 溶于N,N-二甲基甲酰胺至40 mg/ml，避光保存于-20℃ °C |
| 基础染色液，调节至 pH 7.1，4℃避光保存 °最长可保存1个月 | 自制 | 100 ml/L 10xPBS，1.64 g/L K3Fe(CN)6，2.1 g/L K4Fe(CN)6，2 ml/L 1M MgCl2，2 ml/L 10% NP40，1 ml/L 10% 脱氧胆酸钠 | |
| PolyFreeze包埋介质 | Polysciences；瑞士经销商：Brunschwig | 19636-1 | |
| 包埋模具 | Polysciences | 18646A-1 | |
| Leica CM1850 冷冻切片机 | 徕卡显微系统 | ||
| SuperFrost 载玻片 | Menzel | J1800AMNZ | |
| 核固红-硫酸铝溶液 | Division Chroma Waldeck GmbH&Co KG 分销商：Medite | 84-0241-00 | |
| Immu-Mount | Thermo Electron，瑞士经销商：Histocom | 9990412 | |
<强>表1. 试剂和设备 |
参考文献
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