黑质与腹侧被盖区多巴胺调节的全面分析

摘要

多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。

摘要

多巴胺是中枢神经系统中被广泛研究的一种神经递质。事实上，由于其在运动活动和奖赏相关行为中的重要作用，过去五十年来，科研人员一直在深入探究与多巴胺调控相关的分子缺陷。这些关于大脑中多巴胺调控的研究，主要集中于黑质纹状体通路和中脑伏隔核通路的终末区域——即纹状体和伏隔核——中多巴胺调控的分子基础。此外，此类研究通常仅将多巴胺组织含量归一化至湿组织重量进行分析。对于调控多巴胺的蛋白质（如酪氨酸羟化酶（TH）蛋白、TH的磷酸化状态、多巴胺转运体（DAT）以及囊泡单胺转运体2（VMAT2）蛋白）的研究，往往未在同一组织样本中同时分析多巴胺的组织含量。能够同时分析多巴胺组织含量及其调控蛋白（包括翻译后修饰）不仅有助于深入理解多巴胺与TH、DAT或VMAT2的蛋白水平及功能之间的关系，还能提高样本利用效率。这不仅降低了研究成本，而且使研究人员能够在几乎任意实验范式下获得关于多巴胺分子调控机制的深刻见解。

我们将分析重点聚焦于中脑。尽管在大多数多巴胺调控研究中，黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）通常被忽视，但经过练习后，这些核团可以较容易地进行分离。可对多巴胺组织含量以及酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）或囊泡单胺转运体2（VMAT2）进行系统性检测。目前已有大量文献报道了SN和VTA中多巴胺功能对行为的影响，以及外源性物质或疾病过程对这些区域的干扰作用^1-5。此外，某些化合物（如生长因子）对多巴胺及其调控蛋白具有显著影响，且这种影响在SN或VTA中尤为明显^6-8。因此，本文介绍该方法旨在为希望深入探究特定处理如何调节行为及多巴胺调控机制的实验室提供参考。本文提供了一种多步骤方法，用于分析来自啮齿类动物中脑的黑质和VTA组织中的多巴胺含量、TH、DAT或VMAT2蛋白水平，以及TH的磷酸化状态。对TH磷酸化的分析不仅有助于深入了解TH活性的调控机制，还可揭示在特定实验范式下影响胞体-树突核团的信号转导级联变化。

我们将演示分离这两个核团的解剖技术，以及对分离组织进行样本处理的方法，从而获得揭示多巴胺调控分子机制的表达谱 体内 特异于每个细胞核 （图1）.

方案

1. 解剖

1. 在湿冰上冷却啮齿类动物脑切片模具（冠状面切片间隔1 mm）、一个含有5把剃刀的培养皿以及一把#11解剖刀。另取一个容器，将已标记的2 ml微量离心管置于干冰中预冷。
2. 实验人员将选择安乐死方法。我们采用短暂异氟烷麻醉，结果具有可重复性。理想情况下应使用挥发性麻醉机。若无此设备，可使用一个带有平台的大号电池罐。将电池罐置于经批准的通风橱内，在平台下方放置浸透异氟烷的纱布垫，静置3–5分钟，使异氟烷充分饱和罐内空间。将大鼠放入罐中，待其意识丧失后立即取出并进行断头。迅速取出脑组织（理想情况下不超过两分钟），用冷水冲洗后立即放入预冷的啮齿类动物脑切片模具中。
3. 将脑组织放入模具后1分钟，开始插入预冷的剃刀片。若需同时分析纹状体、伏隔核及中脑核团，应从视交叉前方约2 mm处开始。随后每隔1 mm插入一片冷剃刀，直至到达脑桥中段，每次插入新剃刀时应错开位置，以便后续更轻松地逐片取出。
4. 拔出剃刀时，注意观察海马起始位置。当海马完全环绕中脑后，开始使用#11解剖刀片进行切片，如图2所示。
5. 立即将分离的组织放入干冰上预冷的微量离心管中。在大鼠中，通常可从至少两片、最多三片冠状切片中分离出黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）。将组织储存于-80 °C，直至进行后续处理。

2. 组织分析：多巴胺及其代谢物的高效液相色谱法

讨论

如图1所示，上述方法可从大鼠或小鼠的黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）单一样本中，同时获得多组关于多巴胺及其调控蛋白TH、DAT和VMAT2的检测结果。再次强调，实施本方案的优势在于研究者能够获得操作条件匹配的多巴胺调控机制读数 体内 在几乎所有实验范式下均可实现这一目标，从而通过减少每次实验所需的动物数量，显著节约实验资源。

研究人员必须严格遵守解剖过程中（4°C）、组织储存（至少-70°C）、组织超声处理（从储存温度取出后立即在冰冻HPLC缓冲液中进行超声）以及后续沉淀形成和处理步骤中的温度要求。一旦沉淀物在SDS溶液中完成超声和煮沸处理，样品可继续在室温下进行后续操作。用于HPLC分析的存档样品以及为蛋白质分析制备的样品缓冲液应保存在-80°C。

该方案的主要优势再次体现在其内在的操作性匹配方法，可用于分析与多巴胺调节相关的结果 体内 此外，将多巴胺组织检测结果标准化为多巴胺能神经纤维标志物（TH、DAT），可在很大程度上确保研究者一致且准确地分离黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential. Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode. Data Acq. System: Waters Empower Pro 2. Injector: Waters WISP 717 Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo-Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer
Table 2. Specific reagents.
10% SDS			10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)			10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution			1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer			Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer			Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)			Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)			Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau			Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution			5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)			PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)			Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.