多巴胺在中脑核团中受到独特调控，这些核团含有多巴胺神经元的胞体和树突。本文介绍一种解剖与样本处理方法，旨在最大化对啮齿类动物黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中脑核团内多巴胺调控研究的结果质量，从而提升结论的可靠性与科学洞察力。
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本文内容
摘要
摘要
多巴胺是中枢神经系统中被广泛研究的一种神经递质。事实上，由于其在运动活动和奖赏相关行为中的重要作用，过去五十年来，科研人员一直在深入探究与多巴胺调控相关的分子缺陷。这些关于大脑中多巴胺调控的研究，主要集中于黑质纹状体通路和中脑伏隔核通路的终末区域——即纹状体和伏隔核——中多巴胺调控的分子基础。此外，此类研究通常仅将多巴胺组织含量归一化至湿组织重量进行分析。对于调控多巴胺的蛋白质（如酪氨酸羟化酶（TH）蛋白、TH的磷酸化状态、多巴胺转运体（DAT）以及囊泡单胺转运体2（VMAT2）蛋白）的研究，往往未在同一组织样本中同时分析多巴胺的组织含量。能够同时分析多巴胺组织含量及其调控蛋白（包括翻译后修饰）不仅有助于深入理解多巴胺与TH、DAT或VMAT2的蛋白水平及功能之间的关系，还能提高样本利用效率。这不仅降低了研究成本，而且使研究人员能够在几乎任意实验范式下获得关于多巴胺分子调控机制的深刻见解。
我们将分析重点聚焦于中脑。尽管在大多数多巴胺调控研究中，黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）通常被忽视，但经过练习后，这些核团可以较容易地进行分离。可对多巴胺组织含量以及酪氨酸羟化酶（TH）、多巴胺转运体（DAT）或囊泡单胺转运体2（VMAT2）进行系统性检测。目前已有大量文献报道了SN和VTA中多巴胺功能对行为的影响，以及外源性物质或疾病过程对这些区域的干扰作用1-5。此外，某些化合物（如生长因子）对多巴胺及其调控蛋白具有显著影响，且这种影响在SN或VTA中尤为明显6-8。因此，本文介绍该方法旨在为希望深入探究特定处理如何调节行为及多巴胺调控机制的实验室提供参考。本文提供了一种多步骤方法，用于分析来自啮齿类动物中脑的黑质和VTA组织中的多巴胺含量、TH、DAT或VMAT2蛋白水平，以及TH的磷酸化状态。对TH磷酸化的分析不仅有助于深入了解TH活性的调控机制，还可揭示在特定实验范式下影响胞体-树突核团的信号转导级联变化。
我们将演示分离这两个核团的解剖技术，以及对分离组织进行样本处理的方法，从而获得揭示多巴胺调控分子机制的表达谱 体内 特异于每个细胞核 （图1）.
方案
1. 解剖
- 在冰水浴上冷却啮齿类动物脑切片模具（冠状面切片间隔1 mm）、含有5把刀片的培养皿以及一把#11解剖刀。另取一个容器，将已标记的2 ml离心管置于干冰中预冷。
- 实验人员将选择安乐死方法。我们采用异氟烷进行极短时间的麻醉，已获得可重复的结果。理想情况下应使用挥发性麻醉剂蒸发器。若无此设备，可使用一个大型电池罐并内置平台。将电池罐置于经批准的通风橱内，在平台下方放置浸透异氟烷的纱布垫，等待3–5分钟使罐内充分饱和。将大鼠放入罐内，待其意识丧失后立即取出并实施断头。迅速取出脑组织（理想情况下在两分钟内完成），用冷水冲洗后立即放入预冷的啮齿类动物脑切片模具中。
- 将脑组织放入模具后1分钟，开始插入预冷的刀片，若需同时分析纹状体、伏隔核及中脑核团，则从视交叉前方约2 mm处开始。每隔1 mm插入一片预冷刀片，直至脑桥中段，每次插入时应错开位置，以便后续更轻松地逐个取出刀片。
- 拔出刀片时，观察海马起始位置。当海马完全环绕中脑后，开始使用#11刀片进行切片，如图2所示。
- 立即将分离的组织放入干冰上预冷的离心管中。在大鼠中，通常可从至少两个、最多三个冠状切片中分离出黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）。将组织储存于-80 °C，待后续处理时使用。
2. 组织分析：多巴胺及其代谢物的高效液相色谱法
有关高效液相色谱（HPLC）设备及维护的完整信息，请参见文末的高效液相色谱分析。
- 从干冰中取出组织后，立即使用预冷的 0.1 M HClO4-EDTA 溶液（含 0.1 M HClO4 和 0.1 mM EDTA）进行轻柔匀浆9，该溶液中含有浓度为 20 ng/mL 的 N-甲基多巴胺，作为高效液相色谱（HPLC）分析过程中样品回收率的内标物。我们使用的匀浆仪为 Branson Sonifier 150，设定为最大功率的 10%（10 档中的第 1 档）。推荐的超声体积如下：
大鼠：黑质（SN）单侧解剖为 250 μl，双侧解剖为 400 μl；腹侧被盖区（VTA）单侧解剖为 200 μl，双侧解剖为 400 μl。
小鼠（仅限双侧解剖）：黑质（SN）为 200 μl，腹侧被盖区（VTA）为 200 μl。 - 匀浆完成后，将样品置于干冰上保存。随后将样品在 DuPont Sorvall Microspin 24S 离心机中以 12,000 RPM 离心，以沉淀蛋白沉淀物，用于后续的 Western blot 检测。上清液直接进样至 HPLC。推荐以下进样体积以实现大鼠或小鼠样品的精确分析：黑质（SN）为 150 μl（来自任一制备样品），腹侧被盖区（VTA）为 160 μl（来自任一制备样品）。
- 通过将适量的多巴胺组分单胺类物质及其代谢物*溶解于 0.1 M 高氯酸和 0.1 mM EDTA 溶液中，配制浓度为 1 mg/ml 的储备标准品。除色氨酸为 5 mg/ml 外，其余各化合物浓度均为 1 mg/ml。将储备标准品分装为每份 10 μl 的等分试样，储存于超低温冰箱中备用。
*如适用，所有质量均已根据化合物的盐形式进行校正。
取 10 μl 储备标准品稀释至 100 ml 高氯酸溶液中，制备工作标准品。工作标准品浓度为 0.1 μg/ml（色氨酸除外，其浓度为 0.5 μg/ml）。取 50 μl 工作标准品进样至 HPLC，使每种组分在色谱柱上的上样量为 5 ng（色氨酸为 25 ng）。 - 测定样品等分试样中多巴胺的回收率：
测定样品等分试样中多巴胺回收率涉及多个步骤。 - 首先，将样品中多巴胺峰高除以标准品中多巴胺峰高，再将该比值乘以标准品中多巴胺的总量（ng）。我们的标准品中多巴胺浓度为 0.1 ng/μL，每次检测使用 50 μL 标准品，因此标准品中多巴胺总量为 5 ng。因此，可使用以下公式计算特定样品中多巴胺的回收量：
（样品中多巴胺峰高 / 标准品中多巴胺峰高）× 5 ng - 利用内标物 N-甲基多巴胺校正样品损失：
通过将样品中 N-甲基多巴胺峰高除以标准品中 N-甲基多巴胺峰高，并将该比值乘以标准品中 N-甲基多巴胺的总量（ng），以相同方式计算样品中 N-甲基多巴胺的实际回收量。与多巴胺类似，我们的标准品中 N-甲基多巴胺浓度为 0.1 ng/μL，每次检测使用 50 μL 标准品，因此标准品中 N-甲基多巴胺总量为 5 ng。因此，可使用以下公式计算特定样品中 N-甲基多巴胺的回收量：
（样品中 N-甲基多巴胺峰高 / 标准品中 N-甲基多巴胺峰高）× 5 ng
然而，由于每个样品中的 N-甲基多巴胺并非来源于样品本身，而是来源于 HPLC 缓冲液，因此需计算每个样品中预期的 N-甲基多巴胺含量。HPLC 缓冲液中 N-甲基多巴胺浓度为 20 ng/mL（即 0.02 ng/μL），因此每个样品中预期的 N-甲基多巴胺总量可通过将 HPLC 缓冲液中 N-甲基多巴胺浓度乘以用于 HPLC 分析的样品等分体积获得。如下式所示：
（0.02 ng/μL）×（用于 HPLC 分析的样品等分体积） - 利用预期值与实测值之间 N-甲基多巴胺的差异，可对多巴胺回收量进行校正，以补偿样品损失。只需计算预期 N-甲基多巴胺与实测 N-甲基多巴胺的比值，并将该比值乘以实测多巴胺回收量。因此，样品等分试样中多巴胺总量的最终计算公式如下：
（样品中多巴胺峰高 / 标准品中多巴胺峰高）×（标准品中 N-甲基多巴胺峰高 / 样品中 N-甲基多巴胺峰高）×（0.02 ng/μL）×（用于 HPLC 分析的样品等分体积） - 样品中多巴胺的总回收量：
由样品等分试样中测得多巴胺回收量，可推算出该样品中多巴胺的总量。方法是将回收的多巴胺量（ng）除以等分体积，再乘以样品匀浆所用 HPLC 缓冲液的总体积。公式如下：
（样品等分试样中多巴胺量（ng）/ 样品等分体积）×（样品匀浆所用 HPLC 缓冲液总体积）。
读者可参考以下研究2,4,10，以获得关于多巴胺及其代谢物测定的全面介绍，并结合黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）以及纹状体和伏隔核中多巴胺调控蛋白的检测结果进行综合分析。
3. 组织分析：总蛋白测定及TH与DAT结果的最终标准化
- 将沉淀的蛋白质沉淀物（来自HPLC缓冲液处理）置于湿冰上以维持 4 °C确保所有缓冲液均已移除并存档（如需进行确证性分析）。如果需要对黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）进行双侧处理（仅限大鼠），添加 300 μL （SN）或 200 μL (VTA) 加入含5 mM Tris (pH 8.3) 和1 mM EDTA的1% SDS溶液至沉淀中，混匀后超声处理。加入 150 μL 将SDS溶液加入SN沉淀中 100 μl 若处理单侧解剖的组织，则加入VTA组织沉淀中。
- 将样本置于接近沸腾的水中约 5 分钟，以完成蛋白质变性，随后冷却至室温。此步骤中需确保管盖紧固。
- 使用BCA法测定样品中的蛋白质浓度，并绘制蛋白标准曲线（白蛋白标准品），浓度范围为2 - 40 μg 蛋白。检测 5 μl 以三份样本的体积进行检测，取中位数值，根据标准曲线确定蛋白质量。再除以检测体积，得到蛋白浓度。注意，这是将总TH、DAT和VMAT2结果归一化为总蛋白回收量的两个步骤中的第一步。
- 使用含有二硫苏糖醇的上样缓冲液制备样品，用于10%丙烯酰胺凝胶的还原性SDS-电泳。理想情况下，最终总蛋白浓度应约为2 μg/μl选择该浓度的原因是为了减少最终测定TH磷酸化所需的样品体积，因为约100 μg 总蛋白上样量需精确，以定量Ser31和Ser40位点酪氨酸羟化酶（TH）的磷酸化水平。若加入上样缓冲液后样品呈现黄色，表明样品酸性过强，应加入1 M Tris（pH 8.2） 10 μl 直至蓝色恢复。
- 按如下步骤准备用于多巴胺调节蛋白检测的样品：
- TH：根据TH蛋白的校准标准（以ng计），测定TH的浓度（以每总蛋白中的ng TH计） μg 黑质中的蛋白含量预计为每份约 0.05–0.27 ng TH μg 总蛋白 2,4,7,10,11根据0.5 - 5.0 ng TH的线性TH标准曲线，并使用抗TH一抗（Millipore 货号 AB152，以PVP T-20封闭液按1:1000稀释），该一抗可产生线性标准曲线，黑质中总蛋白的最佳上样量应为约10 μg. VTA 中 TH 的浓度范围约为每 0.4 至 1.0 纳克 TH μg 蛋白 4,11因此，VTA 的总蛋白上样量应约为 ~5 μg.
- DAT：黑质或腹侧被盖区中的多巴胺转运体（DAT）相对含量显著低于其相应的终末投射区——纹状体和伏隔核中的含量 4. 以回收的TH蛋白为参照标准化后的DAT相对表达量在黑质和腹侧被盖区也显著较低。因此，与投射末梢区域的上样量相比，检测黑质或腹侧被盖区DAT蛋白所需的上样量需大得多。至少需要 30 μg VTA 中 DAT 评估的精确性需要一定量的总蛋白，以及名义上的上样量 50 μg SN 中的总蛋白含量测定是必要的。所用的一抗为 Santa Cruz 公司产品，货号 sc-1433。
- VMAT2：以总蛋白为标准化参照，VMAT2在中脑-伏隔核通路中的表达高于黑质-纹状体通路。然而，相对于TH的表达水平，VMAT2在黑质（SN）中的表达最高，在纹状体中最低。 4. 使用 Santa Cruz 公司产品目录号 sc-15314，总蛋白上样量约为 ~40 μg 用于VMAT2的定量分析最为理想。
- 使用10%丙烯酰胺凝胶通过SDS-PAGE电泳分离适量的总蛋白。采用Bio-Rad Protean II电泳仪进行检测，该装置适用于大尺寸凝胶。将蛋白转至 0.45 μm 孔径硝酸纤维素膜。转膜使用Hoeffer转膜槽，设定电压至少27伏，可过夜进行转膜。
- 让印迹膜干燥至少30分钟，然后用丽春红S染色液（1% 丽春红S溶于5%冰醋酸）染色约5分钟。用0.2%盐酸溶液剧烈脱色，直至蛋白条带清晰可见且背景染色完全去除。使用Image J获取丽春红S染色图像，以进一步定量各泳道中的相对蛋白上样量，并对TH、DAT或VMAT2结果进行归一化处理图3).
4. 组织分析：位点特异性酪氨酸羟化酶磷酸化
TH 在丝氨酸31或丝氨酸40位点的磷酸化可增加儿茶酚胺能细胞中 L-DOPA 的生物合成 12尽管尚不明确在黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）等多巴胺能脑区中，各磷酸化位点达到促进L-DOPA生物合成所需的磷酸化程度，但已有证据表明，丝氨酸31（ser31）位点的磷酸化在调控L-DOPA生物合成过程中发挥着重要作用 10 并与纹状体、伏隔核、黑质和腹侧被盖区的多巴胺组织含量共同变化 2, 10然而，必须包含对丝氨酸40（ser40）的检测，因为大量研究表明，当磷酸化达到一定阈值时，会影响TH的活性 12.
尽管丝氨酸19（ser19）的磷酸化单独作用时不影响酪氨酸羟化酶（TH）的活性13,14，但由于在去极化条件下细胞外Ca2+是增加ser19磷酸化所必需的，因此ser19磷酸化可被视为多巴胺能神经元中Ca2+依赖性信号通路的一个标志12。此外，仅在黑质（SN）和腹侧被盖区（VTA）中，ser19磷酸化与丝氨酸31（ser31）磷酸化之间存在显著的正相关关系10，这表明ser19的磷酸化状态可能影响ser31的磷酸化，从而间接影响L-DOPA的生物合成。
用于精确量化特定位点TH磷酸化化学计量比的上样注意事项： 以下介绍了在分离组织中准确、精确测定特定位点TH磷酸化水平所需考虑的因素。在可能的情况下，应在样本TH磷酸化评估中加入经过校准的TH磷酸化标准品。上样量必须考虑每个磷酸化位点固有的化学计量比，以确保检测能够使磷酸化信号落在所用抗体的动态工作范围内。最后，每个样本进入检测时所含的内源性总蛋白也应加载至标准曲线泳道中。这一点可通过使用不表达TH的载体蛋白（如大鼠肝脏蛋白）轻松实现。
- ser19. 在三个磷酸化位点中，SN 和 VTA 中 ser19 的磷酸化化学计量水平最高，范围为 0.15 - 0.25 2,10,11。另一个考虑因素是，根据我们的检测方法，ser19 磷酸化信号在 0.5 至 5.0 ng 磷酸化-ser19 的线性范围内可被定量 10。基于上述因素，上样总 TH 蛋白量在 5 至 10 ng 之间（由此估计样品中含 0.75 - 2.5 ng 磷酸化-ser19）可对 ser19 位点 TH 磷酸化水平进行可靠测定。我们使用 Phosphosolutions 一抗（货号 #p1580-19），稀释比例为 1:1000。
- ser31. 与相应的终末投射区域相比，SN 和 VTA 中 ser31 的磷酸化化学计量水平相对较低，范围约为 0.04 - 0.10 2,4,10,11。根据我们的检测方法，ser31 磷酸化信号在 0.5 至 7.0 ng 磷酸化-ser31 的线性范围内可被检测 10。基于上述因素，上样总 TH 蛋白量在 10 至 30 ng 之间（由此估计样品中含 0.50 - 3.0 ng 磷酸化-ser31）可对 ser31 位点 TH 磷酸化水平进行可靠测定。参见 图 4A 以了解 ser31 定量的示例。我们使用由 21st Century Biochemicals（美国马萨诸塞州波士顿）生产的实验室自研亲和纯化一抗，并利用实验室内部标准品验证了其对磷酸化表位的特异性 2。
- ser40. SN 和 VTA 中 ser40 的磷酸化化学计量水平范围约为 0.02 - 0.06 2,4,10,11。根据我们的检测方法，ser40 磷酸化信号在 0.2 至 2.0 ng 磷酸化-ser40 的线性范围内可被检测 10。基于上述因素，上样总 TH 蛋白量在 10 至 30 ng 之间（由此估计样品中含 0.20 - 1.8 ng 磷酸化-ser40）可对 ser40 位点 TH 磷酸化水平进行可靠测定。参见 图 4B 以了解 ser40 定量的示例。我们使用 Phosphosolutions 一抗（货号 #p1580-40），稀释比例为 1:1000。
5. 代表性结果
- 黑质与腹侧被盖区的多巴胺含量比较 在定量分析中，可采用三种多巴胺（或其代谢物）的检测指标：解剖组织中总回收量、单位总蛋白中的多巴胺含量，以及单位酪氨酸羟化酶（TH）蛋白中的多巴胺含量（下表1展示了纹状体、黑质、伏隔核和腹侧被盖区的数据）。黑质与腹侧被盖区的总多巴胺回收量较为接近，每2至3个冠状切片解剖样本的回收量在6–9 ng之间2。若将多巴胺回收量标准化为总蛋白含量，则根据所采用的解剖方法，腹侧被盖区的单位蛋白多巴胺含量高于黑质，黑质平均为6–8 ng/mg蛋白，而腹侧被盖区为9–10 ng/mg蛋白2,4。最后，将多巴胺含量标准化为所回收的总TH蛋白时，也应显示出黑质与腹侧被盖区之间的差异，腹侧被盖区的比值更高10，两个区域间的多巴胺/TH蛋白比值范围为0.2至0.8 ng多巴胺每ng TH蛋白2,10。
多巴胺能区域 总多巴胺回收量 每mg蛋白的多巴胺含量 每ng TH的多巴胺含量 纹状体 214 ± 16 165 ± 13 0.56 ± 0.11 黑质 8.4 ± 0.8 6.1 ± 0.5 0.18 ± 0.03 伏隔核 60 ± 6 75 ± 4 0.77 ± 0.03 腹侧被盖区 6.0 ± 1.0 9.2 ± 1.4 0.22 ± 0.03 - 总蛋白含量：TH、DAT、VMAT2 使用校准后的TH蛋白标准进行定量，黑质中回收的TH蛋白量高于腹侧被盖区（黑质为60 ng，腹侧被盖区为26 ng2）。然而，当标准化为总蛋白含量时，这一关系发生逆转，腹侧被盖区的单位总蛋白TH含量约为黑质的3至5倍（腹侧被盖区约为0.32 ng/μg蛋白，黑质约为0.09 ng/μg蛋白）4,10。
在SN和VTA中，DAT的预期回收量相似，腹侧被盖区的总蛋白或总TH标准化后的DAT回收量略高4。值得注意的是，与相应的终末投射区域相比，这些区域中的DAT蛋白丰度显著较低4。
以总蛋白为基准，VMAT2在腹侧被盖区的回收量高于黑质4；但当标准化为TH蛋白时，黑质中的VMAT2回收量略高4。 - TH蛋白的位点特异性磷酸化 多项研究一致表明，黑质与腹侧被盖区在Ser19、Ser31和Ser40位点的TH磷酸化水平具有稳定特征，且与相应的终末投射区域存在关联。Ser19位点的磷酸化水平在黑质和腹侧被盖区显著高于纹状体和伏隔核（黑质和腹侧被盖区约为0.2–0.3，纹状体和伏隔核约为0.05–0.15）2,4,7,10,11。Ser31位点的磷酸化在黑质和腹侧被盖区明显低于其终末投射区域，在这些胞体-树突区域中的水平约为0.06–0.102,4,7,10,11。在使用NSD-1015抑制芳香族氨基酸脱羧酶后，仅在腹侧被盖区观察到Ser31磷酸化水平增加约2倍10。Ser40位点的磷酸化在黑质和腹侧被盖区的范围为0.02至0.05，该化学计量比通常与相应的终末投射区域无显著差异2,4,7,10,11。
图1. 单次组织解剖获得的多巴胺能检测结果。
图 2. 分离中脑多巴胺能神经网的解剖技术。从腹侧被盖区（VTA）中分离黑质（SN）的解剖方法。1. 去除覆盖的皮层和海马体（在上图中这些结构已被移除）。2. 做一个垂直切口，将SN的色素区域与VTA分开。3. 在黑质背侧和最外侧部分的上方，沿中线或接近中线处做一水平切口。4. 将黑质从脑干其余部分小心剥离。一旦黑质被移除，以类似方式将腹侧被盖区从中脑其余部分剥离。注意：该脑区通常在相对于前囟的坐标AP 5.7处观察到。
图 3. 总蛋白上样量的第二次（也是最终）归一化——用于ImageJ分析的Ponceau S染色。大鼠黑质样品中总酪氨酸羟化酶（TH）测定的Ponceau S蛋白染色结果。从左侧开始的前五条泳道为标准总TH曲线，其中加入了28 μg来自大鼠肝脏匀浆的蛋白，以匹配黑质样品的蛋白上样量。接下来的一条泳道含有分子量（MW）标记物。其余泳道包含约28 μg来自大鼠黑质样品的蛋白。蛋白上样量基于BCA法测定的各样品蛋白浓度。然而，尽管理论上上样量应相等，但各样品间Ponceau S染色深浅存在差异，表明蛋白浓度存在轻微变异，因此需通过ImageJ分析对每一样品的Ponceau S染色量进行归一化校正。
图4. 对照组与处理组中TH磷酸化的代表性结果。来自先前研究4的生理盐水和甲基苯丙胺处理的Wistar大鼠的丝氨酸31位点磷酸化酪氨酸羟化酶（pTH）和丝氨酸40位点pTH的代表性Western印迹结果。A. 大鼠黑质样本中的ser31 pTH。 校准后的ser31 pTH标准曲线范围为0.3 ng至2.0 ng，处于检测的线性范围内。根据先前对总TH水平的Western印迹分析，每个样本上样总TH量为6 ng。B. 大鼠腹侧被盖区样本中的ser40 pTH。 校准后的ser40 pTH标准曲线范围为0.2 ng至1.5 ng，处于检测的线性范围内。根据先前对总TH水平的Western印迹分析，每个样本上样总TH量为9 ng。
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讨论
如图1所示，上述方法可从大鼠或小鼠的黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）单一样本中，同时获得多组关于多巴胺及其调控蛋白TH、DAT和VMAT2的检测结果。再次强调，实施本方案的优势在于研究者能够获得操作条件匹配的多巴胺调控机制读数 体内 在几乎所有实验范式下均可实现这一目标，从而通过减少每次实验所需的动物数量，显著节约实验资源。
研究人员必须严格遵守解剖过程中（4°C）、组织储存（至少-70°C）、组织超声处理（从储存温度取出后立即在冰冻HPLC缓冲液中进行超声）以及后续沉淀形成和处理步骤中的温度要求。一旦沉淀物在SDS溶液中完成超声和煮沸处理，样品可继续在室温下进行后续操作。用于HPLC分析的存档样品以及为蛋白质分析制备的样品缓冲液应保存在-80°C。
该方案的主要优势再次体现在其内在的操作性匹配方法，可用于分析与多巴胺调节相关的结果 体内 此外，将多巴胺组织检测结果标准化为多巴胺能神经纤维标志物（TH、DAT），可在很大程度上确保研究者一致且准确地分离黑质（SN）或腹侧被盖区（VTA）...
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致谢
本工作的资助来源如文献2,10所引，部分来自美国衰老研究联合会、Edward P. Stiles 信托基金和路易斯安那州西北部生物医学研究基金会向 MF Salvatore 提供的研究资助，以及 LSU 健康科学中心-什里夫波特分校向 BS Pruett 提供的 Ike Muslow 博士前奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
高效液相色谱系统： | |||
基本系统由 Shimadzu LC10-ADvp 高效液相色谱泵、Waters WISP 717 自动进样器以及一根 250 × 4.4 mm、5 微米 Spherosorb ODS-1 C18反相色谱柱（Waters），Bioanalytical Systems（BAS）TL12双玻璃碳电极，两台BAS LC4B电化学检测器，以及Waters Empower 2数据采集与积分系统。 | |||
色谱柱温度保持在 30-45 °C（BAS LC22A色谱柱加热器）。流动相为0.1 M磷酸钠（pH 3.0）、0.1 mM EDTA、0.2–0.4 mM辛烷磺酸钠（Eastman-Kodak）和0.35%乙腈（v/v），经0.45微米滤膜过滤。流速为1.2 ml/min。通过调节pH、辛烷磺酸钠浓度和色谱柱温度，优化四升批次的流动相以实现最佳分离效果。流动相循环使用，并持续用氦气吹扫以去除溶解氧。为在较长时间内保持良好的分离分辨率，流动相的循环使用几乎是必需的。通过使用流路切换阀（由积分仪控制），将每次运行最初2–7分钟的流动相排入废液，从而延长流动相的使用期限。 | |||
电极相对于Ag/AgCl参比电极维持在约0.78 V和0.95 V的电位。较高电位的电极仅用于色氨酸（以及NMDA内标）的测定。0.78 V电位在检测单胺类物质及其他非色氨酸化合物时可提供更优的信噪比。色谱图存储于Empower工作站的硬盘中，随后进行处理，并将数据直接导入Excel电子表格，用于计算代谢物含量及汇总分组数据。 | |||
泵：Shimadzu LC-10AD | |||
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| 甘油 | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| 甘氨酸 | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B8026-5G | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | D-9163 | |
| 蛋白标准品 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA 蛋白质检测试剂 A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein 标准品 | 伯乐（Bio Rad） | 161-0373 | |
| [125I]-蛋白A，比活性 | Perkin-Elmer | ||
表2. 特异性试剂。 | |||
| 10% SDS | 10 g SDS，100 mL 去离子水20 | ||
| 1% SDS（pH 调至 8.2） | 10 mL 10% SDS，60.5 mg Trizma Base，37.22 mg EDTA，90 mL 去离子水20 | ||
| 硫酸铜 II 溶液 | 1 g 硫酸铜（II） 25 mL 去离子水20 | ||
| 3X 样品缓冲液 | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g 二硫苏糖醇 0.463 g 甘油 30 g 溴酚蓝 10 mg 去离子水20（最初将上述试剂加入40 mL H20，在量筒中；然后加入 H20，直至总体积达到100 mL）HCl（根据需要添加，调节pH至6.85）将溶液分装至50个2.0 mL离心管中并冷冻。（配制总量为100 mL）：所需3X上样缓冲液体积 = ½ 样品中使用的SDS体积 | ||
| 1X 样品缓冲液 | 使用去离子水将3倍浓度的上样缓冲液稀释至1倍浓度的上样缓冲液20 | ||
| 10倍跑胶缓冲液（配制4 L） | Trizma 碱 121.1 g 甘氨酸 577 g SDS 40 g | ||
| 10倍转移缓冲液：（配制4 L） | 甘氨酸 360 g Trizma Base 96 g | ||
| 猩红染色 | Ponceau S 0.5 g，乙酸 5 mL，去离子水20.95 mL | ||
| 0.2% HCl 溶液 | 5.2 mL 盐酸加入 500 mL 去离子水中20 | ||
| PVP-T20 封闭液（配制 4 L） | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g 硫柳汞 0.4 g 1M Tris pH 7.6（500 mL 去离子水中含 60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base）20）- 50 mL | ||
| 10倍印迹缓冲液（配制4 L） | Tween 20 20 g Tris 碱 14 g Tris HCl 61 g | ||
表3. 蛋白质测定与蛋白质印迹实验方案 | |||
酪氨酸羟化酶标准品： 本实验室所使用的经校准的TH蛋白及磷酸化标准品源自PC12细胞提取物，其TH蛋白含量和磷酸化化学计量比已通过先前校准的TH标准品进行分析，而该标准品最初来源于John Haycock博士的实验室。 11. |
参考文献
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466(2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867(2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
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