一种从野生幼虫中提取血细胞的简易方案

摘要

昆虫血细胞在昆虫发育的各个阶段均执行多种重要功能，包括免疫和非免疫功能。目前关于血细胞类型和功能的知识主要来源于对昆虫遗传模型的研究。本文介绍了一种从野生毛虫中提取、定量和可视化血细胞的方法。

摘要

昆虫血细胞（相当于哺乳动物的白细胞）在昆虫整个生命周期的多种生理过程中发挥着重要作用¹。在鳞翅目（蛾类和蝴蝶）和双翅目（真蝇类）昆虫的幼虫阶段，血细胞来源于淋巴腺（一种特化的造血器官）或胚胎细胞，并可延续至成虫阶段。胚胎来源的血细胞参与发育过程中的细胞迁移以及炎症期间的趋化性调控，同时也参与细胞凋亡，对胚胎发育至关重要²。血细胞介导昆虫先天免疫反应的细胞分支，其功能包括细胞铺展、细胞聚集、结节形成、吞噬作用以及对异物的包裹作用³。它们还负责在感染过程中协调特定的体液免疫防御反应，例如抗菌肽及其他效应分子的产生^4,5。目前对血细胞形态与功能的研究主要集中在遗传学或生理学昆虫模型上，包括果蝇Drosophila melanogaster^6,7、埃及伊蚊Aedes aegypti和冈比亚按蚊Anopheles gambiae^8,9，以及烟草天蛾Manduca sexta^10,11。然而，关于非模式昆虫物种——尤其是从野外采集的物种——其血细胞的多样性、分类、形态及功能，目前仍缺乏足够的研究信息¹²。

本文介绍了一种从野生幼虫中提取血细胞的简单且高效的方法。我们以近末龄期的Lithacodes fasciola（黄肩蛞蝓蛾）（图1）和Euclea delphinii（刺 oak 蛞蝓）幼虫（鳞翅目：刺蛾科）为例，证明可从单个幼虫中分离出足够体积的血淋巴（昆虫血液），并计数血细胞数量。该方法可用于高效研究这些物种以及其他从野外采集的近缘鳞翅目幼虫的血细胞类型，也可与免疫学检测方法结合使用，以研究微生物或寄生生物感染后血细胞的功能¹³。

方案

1. 材料准备

1. 使用硼硅酸盐玻璃毛细管和微电极拉制仪制备针尖（尖端直径1-2 μm，锥度3-4 mm）。仪器参数设置：ramp：561；velocity：20；heat：560；delay：1；pull：100；pressure：500。
2. 配制收集液：60% Grace's Medium（GM），添加10%胎牛血清（FBS）和20%抗凝缓冲液（含98 mM NaOH、186 mM NaCl、1.7 mM EDTA 和 41 mM 柠檬酸，pH 4.5）。上述溶液需在无菌条件下新鲜配制，并始终置于冰上保存。
3. 配制孵育缓冲液：90% Grace's Medium（GM）添加10%胎牛血清（FBS）。该溶液也需新鲜配制，并始终置于冰上保存。
4. 收集液和孵育液的总体积均需准备至少15 μl × 昆虫数量。

2. 用收集液注射毛虫

1. 在采集血细胞前，将倒数第二龄幼虫置于冰上冷藏20分钟以进行麻醉。
2. 将一根洁净的钝头毛细针（16号）的钝端插入连接至20 ml玻璃注射器的管路中（图2）。将装有收集液的管子敞口放置在实验台上，缓慢用缓冲液充满毛细针。毛细针通常充入约10–15 μl收集液，具体体积取决于毛虫的大小（每10 mg毛虫总体重约需1 μl溶液，即总体重的0.01%）。将针头放置在解剖显微镜旁的一团黏土上固定。
3. 将毛虫放入培养皿中，使其侧卧，以便清晰观察气门（图3）。
4. 在解剖显微镜下观察，用一对镊子固定毛虫，并将针头靠近其中一个气门处——该区域的昆虫表皮通常较柔软。轻轻将毛细针压在昆虫体壁上。一旦针头刺穿表皮，即将全部溶液注入毛虫体内（图3）。注意避免将气泡注入毛虫体内。注射后毛虫身体会膨胀（例如，体积增加20%），但不应破裂或渗漏。
5. 将毛虫放回冰上，使其背部朝上，以防止缓冲液从伤口泄漏（图3）。
6. 对每只用于血淋巴提取的毛虫重复步骤2.1–2.4。在此阶段，让所有昆虫在冰上继续冷藏30分钟后再进行后续操作。

3. 血细胞的提取

1. 将幼虫置于解剖显微镜下的培养皿中。
2. 使用无菌解剖刀在幼虫后部区域做一个浅层切口（长2-3 mm）（图3）。注意不要损伤肠道或其他内部器官；目的是小心刺破表皮，并收集含有血细胞的缓冲液/血淋巴混合物，来自单个昆虫。
3. 用柔软的塑料镊子轻轻挤压幼虫，同时用10 μl移液器吸头收集血淋巴混合物（约10-20 μl），再次注意避免损伤内部组织（图3）。血淋巴从幼虫体壁挤出的液滴中获取。弃去幼虫残体。
4. 将每只单独幼虫的血淋巴分别收集到已标记的硅化0.5 ml微量离心管中。
5. 向每份来自单只幼虫的血淋巴样品中加入等体积的孵育溶液（约10-20 μl）。血淋巴样品始终置于冰上保存。
6. 对实验中使用的每只幼虫重复步骤3.1–3.5。

4. 血细胞的定量分析

1. 在计数血细胞之前，立即将血淋巴样品与孵育液混合。此处理可实现血细胞的充分分离，并防止细胞聚集。
2. 使用洁净的移液器吸头，将10 μl已混合孵育液的血淋巴样品转移至血细胞计数板上。
3. 使用复式显微镜，计数并记录血细胞计数板中央网格中至少15个大方格内的血细胞数量（每个方格面积：0.04 mm²，深度：0.1 mm）（图3）。将这些数值相加，得到15个方格内血细胞总数。
4. 每次样品操作之间，使用装有去离子蒸馏水的冲洗瓶彻底冲洗血细胞计数板及其盖玻片，并用Kimwipes（Kimberly-Clark）擦拭干燥。
5. 对每个血淋巴样品重复步骤4.1–4.4。
6. 按下述方法计算每只幼虫每毫升血淋巴体积内的平均血细胞数量：

血细胞计数板网格中方格的总体积：（0.04 mm² 面积）×（0.1 mm 深度）= 0.004 mm³ × 15 个方格 = 0.06 mm³ = 所计数的全部15个方格的总体积。

（15个计数方格中血细胞总数之和 / 15个计数方格的总体积）× 2 稀释倍数 = 血细胞数/mm³ × 1,000 = 血淋巴中血细胞数/ml。

结果

本文所述方案可从单个幼虫中采集至少10–20 μl的昆虫血淋巴。采用该方法收集的血细胞无细胞聚集、黑化缺陷、组织碎片或其他污染物。因此，可在显微镜下直接观察并计数血细胞，且可在数小时内完成对多只昆虫的观察。我们观察到，样本中大多数血细胞为浆细胞³（血细胞呈不对称铺展）（图4）。目前我们正在对这些幼虫中发现的不同类型血细胞进行详细表征（Stoepler et al.，未发表数据）。本文所述方法为快速、准确计数来自野外实验采集的单个幼虫总血细胞数量提供了有效手段。

尽管不同昆虫物种之间以及同一物种内的血细胞密度可能存在显著差异¹，我们发现L. fasciola幼虫的血细胞数量范围为每毫升血淋巴1.10 × 10⁶ - 8.23 × 10⁶个细胞（平均值：3.51 × 10⁶；n = 31只幼虫），该范围处于先前其他鳞翅目物种报道的数值范围内¹⁴。

讨论

此前已有文献报道过从具有医学重要性的昆虫以及鳞翅目模式昆虫中提取血细胞的方法^{9, 14}。血细胞提取方法需根据昆虫种类、发育阶段及其形态特征进行相应调整。例如，可通过剪断烟草天蛾（Manduca）幼虫腹部末端附近的弯曲角状突起，便捷地获取血淋巴¹⁵。由于蛞蝓状幼虫（Limacodidae科）缺乏此类腹部结构，我们开发了一种专门适用于野外采集的小型幼虫的血淋巴提取方案。该方法能够高效地分离出含有大量血细胞的血淋巴，所获样本可直接用于后续实验或储存。此外，成蚊血细胞的采集通常包含一个耗时的步骤，即需仔细去除其足、翅以及腹部末端¹⁶；而本方案无需此类操作，因此从蛞蝓状幼虫中分离血细胞的过程更为简便快捷。本技术的局限性可能包括：1）与其他所有血细胞提取方法一样，昆虫需在实验当天处死；2）同种同发育阶段的幼虫之间，血细胞数量可能存在显著差异，因此需使用多个个体以计算每单位体积血淋巴中的平均血细胞数量。

我们计划在今后的研究中利用该方法，对从森林中采集的毛虫不同发育阶段的血细胞类型进行形态学表征。该检测方法还可作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微移液管拉制仪	Sutter Instruments	P-1000
硼硅酸盐玻璃管	Sutter Instruments	B100-50-10	外径：1.0 mm，内径：0.50 mm
Grace's 培养基	Sigma	G8142
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	SH3007102	经热灭活
Dumont #5 镊子	Fine science tools	11252-40
Neubauer 血细胞计数板	Hausser Scientific	3200
塑料管	Tri-Tech	TT-3-32OD	外径：3/32英寸，内径：1/32英寸
玻璃医用注射器	Fortuna Optima	D-97877	50 ml 容量
钝头针	Small Parts	NE-162PL-25	16 号 × 1" 长度