在骨转移的发病机制中，血管生成是一个关键过程，因此成为成像与治疗的重要靶点。本文介绍一种部位特异性的乳腺癌骨转移大鼠模型，并描述了用于无创成像血管生成的策略 体内 采用磁共振成像、容积计算机断层扫描和超声技术。
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摘要
摘要
血管生成是癌症生长和转移形成的关键特征。在骨转移中，血管生成因子对肿瘤细胞在骨髓腔内的增殖以及肿瘤细胞与骨细胞相互作用导致的局部骨破坏均起着至关重要的作用。我们的目标是建立一种允许 体内 使用无创成像技术评估骨骼病变中的血管生成
为此，我们将105个MDA-MB-231人乳腺癌细胞注入浅表腹壁动脉，该方法可阻止转移灶在除相应后肢以外的其他身体部位生长1。肿瘤细胞接种后25-30天，骨转移灶在远端股骨、近端胫骨和近端腓骨部位特异性形成1。可采用磁共振成像（MRI）、容积计算机断层扫描（VCT）和超声（US）对骨转移灶中血管生成的形态学和功能学特征进行纵向研究。
MRI 可显示骨转移灶软组织部分的形态学信息，这些病灶最初局限于骨髓腔，随着进展会进一步突破皮质骨。通过动态对比增强 MRI（DCE-MRI），可获取并量化包括局部血容量、灌注及血管通透性在内的功能数据2-4。形态学 VCT 成像可高分辨率地显示骨破坏情况。与 MRI 发现互补，溶骨性病灶可位于骨髓内肿瘤生长区域的邻近部位。在施用对比剂后，VCT 血管造影可高分辨率地揭示骨转移灶内的大血管结构，而 DCE-VCT 能够深入观察这些病灶的微循环5,6。超声（US）可用于评估因皮质骨局部溶骨所致的骨骼病灶的形态学和功能特征。利用 B 模式和多普勒技术，可分别评估软组织转移灶的结构和灌注情况。DCE-US 可在注射微泡后对骨转移灶的血管化进行实时成像7。
综上所述，在特异性乳腺癌骨转移模型中，多模态成像技术（包括磁共振成像、容积计算机断层扫描和超声）可提供关于这些骨骼病变形态学及血管生成功能参数的互补信息。
方案
1. 细胞培养
- 在 RPMI-1640 培养基（Invitrogen，德国）中培养 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞（美国模式培养物集存库），培养基中添加 10% 胎牛血清（Sigma，德国）。将所有细胞培养物置于标准条件下（37 °C，湿润环境，5% CO2），每周传代 2–3 次，以维持细胞处于对数生长期。对于下文所述的动物模型，无需使用 MDA-MB-231 细胞的骨特异性亚系，因为肿瘤成瘤率超过 90%1。
- 使用含 2 mM EDTA 的磷酸盐缓冲液（PBS-，不含 Ca2+ 和 Mg2+）和 0.25% 胰蛋白酶（Sigma，Taufkirchen，德国）消化未长满的肿瘤细胞。用血细胞计数板（Neubauer 计数室）对 MDA-MB-231 细胞进行计数，并将其重悬于 RPMI-1640 培养基中（每 1 ml 含 5×105 个细胞）。
2. 骨转移的裸鼠模型
- 所有实验均经负责的政府动物伦理委员会批准。
- 使用6-8周龄的裸鼠，并在适当的无菌小动物系统（例如迷你屏障系统）中以无病原条件饲养。将动物置于受控环境中（室温21 ± 2 °C，湿度60%，12小时光照-黑暗循环），并为大鼠提供高压灭菌饲料和水，自由摄取（ad libitum）。
- 在动物手术前，注射镇痛药物（例如皮下注射卡洛芬4 mg/kg；由于其单次给药且半衰期较短（约8小时），卡洛芬不应影响肿瘤生长）。使用氧气（0.5 L/min）与异氟烷（1-1.5 vol. %）混合气体对大鼠进行麻醉，并确保大鼠已充分麻醉且呼吸规律，再开始后续操作。
- 将麻醉后的大鼠置于合适的双目手术显微镜（例如Leica）下，以16倍放大倍数进行操作。
- 使用剪刀（BC060r Iris剪刀 108 mm）在腹股沟区域切开皮肤及皮下组织，长度为2-3 cm。需解剖自股动脉（FA）发出的所有分支动脉，包括浅表腹壁动脉（SEA）、降膝动脉（DGA）、腘动脉（PA）和隐动脉（SA）。
- 在浅表腹壁动脉（SEA）起始处近端的股动脉以及降膝动脉（DGA）、腘动脉（PA）和隐动脉（SA）上放置夹子，以暂时阻断局部血流。在浅表腹壁动脉（SEA）远端结扎，以便在无出血情况下打开该血管（图1A）。
- 使用剪刀（Vannas Micro-SCRS-Grooved STR 85 mm）在结扎部位近端剪开浅表腹壁动脉（SEA）（图1B），并向SEA滴加1%罂粟碱溶液，以松弛血管，便于后续针头插入（图1C）。
- 用剪刀剪开SEA约一半管径，同时用镊子夹住血管切端，将一根针头（直径0.3 mm，长度42 mm）插入SEA管腔内（图1D, E）。如有条件，将针头固定于外部装置以减少可能导致血管壁穿孔的不规则移动。将注射器连接至针头。移除远端股动脉上的夹子，并将其置于隐动脉上（图1F）。
- 将悬浮于0.2 mL培养基中的MDA-MB-231细胞缓慢注入SEA。由于夹子的存在，MDA-MB-231细胞将被导向降膝动脉（DGA）和腘动脉（PA）。注射完成后拔出针头，并结扎SEA以防止出血，随后移除动脉夹子。使用外科夹关闭切口，并终止吸入麻醉。
- 术后监测期间，通常在肿瘤细胞接种后7-8周处死大鼠，以避免严重的骨骼并发症。在此期间应每日监测动物，评估肿瘤大小及是否存在疼痛迹象（如行为异常、体重减轻、运动功能障碍）。若动物肿瘤大小超过伦理允许上限，或在肿瘤生长过程中出现疼痛表现，应立即实施安乐死。
- 本研究使用免疫缺陷型（裸鼠）大鼠进行人源MDA-MB-231乳腺癌细胞的异种移植。选择裸鼠并非为了更清晰地观察肿瘤生长情况。
3. 磁共振成像（MRI）
- 肿瘤细胞接种后，需等待约25-30天的肿瘤生长期，再开始成像。进行磁共振成像时，使用专用的实验用扫描仪或配备合适动物线圈的人体磁共振系统。我们使用了一台人体磁共振系统（Symphony，Siemens，德国）和一个自制射频激发与检测线圈，该线圈设计为圆柱形体积谐振器，内径为83 mm，可用长度为120 mm（图2A）。
- 按照前述方法，使用氧气和异氟烷对大鼠进行麻醉。在尾静脉插入导管，并用胶带将其固定在尾巴上。连接装有对比剂的注射器（例如，约0.5 ml中含0.1 mmol/kg Gd-DTPA；Magnevist，Bayer-Schering，德国）。
- 将大鼠置于磁共振系统中，维持吸入麻醉。首先进行形态学磁共振序列扫描以定位骨转移灶（例如T2加权：快速自旋回波序列，TR 3240 ms，TE 81 ms，矩阵152 x 256，视野90 x 53.4 mm2，层厚1.5 mm，信号平均次数3次，扫描时间3分40秒）。
- 选取骨转移灶最大直径的层面，开始进行动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）序列扫描（例如饱和恢复快速小角度激发序列，TR 373 ms，TE 1.86 ms，矩阵192 x 144，视野130 x 97.5 mm2，层厚5 mm，采集次数512次，信号平均次数1次，扫描时间6分55秒）。在扫描开始约30秒后，于10秒内开始注射对比剂。每只动物完成上述磁共振检查的总时间约为15-20分钟。
4. 容积计算机断层扫描（VCT）
- 选择合适的CT系统，可以是用于人体的或实验用扫描仪。此处我们使用了一台配备平板探测器的容积计算机断层扫描原型机（图2B；Volume CT，Siemens，德国）。
- 按照前述方法使用氧气和异氟烷对大鼠进行麻醉。在尾静脉插入导管，并用胶带将其固定在尾巴上。连接装有对比剂的注射器（例如，每千克体重1克碘，体积约0.5 ml；Imeron 400，Bracco，德国）。
- 在吸入麻醉下将大鼠置于扫描仪上。VCT扫描参数如下：管电压80 kV，管电流50 mA，扫描时间51秒，旋转速度10秒，每秒帧数120，矩阵512 × 512，层厚0.2 mm。在平板探测器系统旋转的第二圈期间注射对比剂。完成上述VCT检查操作所需总时间约为每只动物5–10分钟。
- 采用改进的FDK（Feldkamp-Davis-Kress）锥束重建算法（核函数H80a，Afra，德国）进行图像重建。
5. 超声（US）
- 可用于此目的的实验性和临床超声系统均有供应。我们使用的是临床超声系统Acuson Sequoia 512，配备15L8线阵探头（图2C；Siemens-Acuson，Mountain View，CA）。
- 按照前述方法以氧气和异氟烷麻醉大鼠。在尾静脉插入导管，并用胶带将其固定于尾部。连接含有微泡造影剂的注射器（例如，约0.5 ml中含1.6 ml/kg；SonoVue，Bracco，意大利）。使用三脚架将超声探头固定于相应后肢，并在探头与后肢之间涂抹超声耦合剂。
- 进行B型成像（发射频率：17 MHz；机械指数：0.51），以确定骨转移灶的最大直径，并将探头固定于该位置。在B型图像上叠加多普勒信号，以获取组织灌注信息。请注意，只有破坏皮质骨的病灶才能被超声波探测到。
- 进行动态对比增强超声（DCE-US）时，将超声设备设为Cadence对比脉冲序列（CPS）模式（发射频率：7 MHz；机械指数：0.18），注射微泡造影剂并记录一段时长90秒的动态影像。完成上述超声检查步骤每只动物所需总时间约为10–15分钟。
6. 成像数据的后处理
- 利用 MRI、VCT 和超声的形态学信息，表征软组织肿瘤（MRI、超声）和骨转移灶的骨质破坏（VCT），并通过 DICOM 图像浏览器（例如 Osirix Dicom Viewer）确定病灶的位置、大小及体积。
- 为获取骨转移灶内血管的分支模式（血管造影），可使用 VCT 数据。利用动脉期信息，结合或不结合减影技术，重建二维或三维图像（例如使用 Osirix Dicom Viewer）。
- 为定量分析 DCE-MRI、DCE-VCT 和 DCE-超声中的血管化参数，应使用针对各成像模态的专用软件工具。对于 DCE-MRI，基于 Brix 的双室模型8,9，使用 Dyna Lab（Mevis Research, Bremen, Germany）计算骨转移灶中的血管参数：幅值 A（与血容量相关）和交换速率常数 kep（与灌注和血管通透性相关）。其他可用于分析的药代动力学模型亦可选用，例如 Tofts 模型10。
- 为定量分析 DCE-VCT 数据，可使用 Dyna Lab（Mevis Research, Bremen, Germany）对数据进行描述性分析，计算曲线下面积（AUC）或峰值增强（PE）等参数。
- 通过定量分析软件（例如 Qontrast, Bracco, Italy）对实时 DCE-超声信息进行量化，根据内置的团注模型分析动态影像序列。将感兴趣区（ROI）置于骨转移灶上，测定曲线下面积等描述性参数，或从彩色编码图中获取定量参数，例如局部血容量、局部血流量和充盈时间。
7. 代表性结果
经动脉内注射MDA-MB-231细胞至SEA后图1)，裸鼠相应后肢会出现部位特异性的骨转移。通过MRI、VCT和超声可无创成像局限于股骨、胫骨和腓骨的溶骨性病灶。图2)约在注射后25-30天开始，并持续随访数周。通过结合磁共振成像（MRI）、容积计算机断层扫描（VCT）和超声（US），包括平扫及对比增强技术，可对骨转移病灶提供互补性信息，这些病灶由软组织肿瘤（肿瘤细胞与间质）及相应的溶骨性病变（骨破坏）共同构成。为比较不同成像技术之间的数据，可在同一只大鼠上依次连续使用这三种成像方式。MRI可显示骨转移软组织的形态，该软组织最初局限于骨髓腔内，随着病程发展逐渐突破皮质骨。通过动态对比增强MRI（DCE-MRI）可获取并量化区域血容量、灌注及血管通透性等功能参数（图3）。骨结构，特别是转移灶中的溶骨性改变，可通过容积CT（VCT）进行高分辨率评估。与MRI结果互补，溶骨性病灶位于髓内肿瘤生长区域的邻近部位。VCT血管造影可显示骨转移灶大血管结构的改变，而动态对比增强VCT（DCE-VCT）则呈现相应的微循环特征。图4）。由于转移性病灶会导致皮质骨的局部破坏，因此可采用超声（US）通过B型模式和多普勒技术评估软组织肿瘤的形态学和功能特征。应用微泡造影剂后，动态对比增强超声（DCE-US）可实现骨转移灶血管化的实时成像。图5).
图 1. 裸鼠后肢经手术显微镜成像，已准备进行肿瘤细胞接种。A，股动脉（FA）的分支模式，包括腹壁浅动脉（SEA）、膝降动脉（DGA）、腘动脉（PA）和隐动脉（SA）；在SA、PA及近端FA上放置动脉夹，并结扎SEA；B，于结扎近端切断SEA；C，滴加罂粟碱后SEA肌肉松弛；D，用镊子夹起SEA并进行切开；E，将针头插入SEA；F，针头固定于SEA内（体外固定装置），通过SEA将MDA-MB-231肿瘤细胞注入DGA和PA，动脉夹确保注射方向。
图 2. A，人体磁共振系统（Symphony，Siemens，德国）及自制射频激发与检测线圈，置于扫描仪内；B，配备平板探测器的容积计算断层扫描仪（Volume CT，Siemens，德国）；C，临床超声系统 Acuson Sequioa 512（Siemens-Acuson，美国加利福尼亚州芒廷维尤）。
图3. 轴向MR切面。左侧面板为T2加权MRI；中间面板为幅值A（动态对比增强MRI）；右侧面板为交换速率常数kep（动态对比增强MRI）。箭头指示骨转移灶。DCE-MRI数据的颜色图谱从红色（高值）到蓝色（低值）变化。
图4. 溶骨性骨转移瘤的三维VCT重建图像（左图）、血管造影图像（中图），以及DCE-VCT轴向切面图，显示峰值增强参数（右图）。DCE-VCT数据的颜色图谱从红色（高值）到蓝色（低值）表示。
图5. 骨转移瘤的B模式（形态学，左图）、多普勒（灌注情况，中图）和CEUS（右图，注射微泡后血管化实时成像的峰值增强）超声图像。
补充视频 1。 点击此处查看补充视频。
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讨论
本文所述的诱导实验性骨转移方法结合影像学技术，可对裸鼠体内的溶骨性病灶进行纵向追踪。在本模型中，将MDA-MB-231人乳腺癌细胞注射至股骨远端动脉（SEA），该动脉是经由阴部上腹干连接髂动脉与股动脉的吻合支。因此，在结扎SEA后，膝关节供血区域的血流仍可维持。与已建立的骨转移模型相比，本模型的优势在于：与心内注射模型11相比，骨转移病灶具有部位特异性；与胫骨注射模型12相比，本模型包含了肿瘤细胞外渗及向靶组织迁移等致病过程。此外，该模型避免了系统性肿瘤负荷（尤其是内脏播散），从而可进行持续数周的长期纵向研究，进而减少所需实验动物数量1,13。
血管生成在骨转移发病机制中作为促进肿瘤细胞增殖并诱导骨吸收的关键过程的作用，此前已在研究中得到证实。 离体 研究14,15. 这里我们介绍 体内 采用MRI、VCT和超声等成像技术，无创评估这些病变中的血管生成。利用裸鼠模型，可获得关于血管化的互补信息，包括血容量和血管通透性/灌注功能信息（DCE-MRI、DCE-VC...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由德国研究基金会（SFB-TR 23 和 SFB-TR 79，T.B. 和 D.K.）资助。作者谨此感谢 Renate Bangert、Karin Leotta 和 Lisa Seyler 提供出色的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 | 美国模式培养物集存库 | HTB-26 | |
| RPMI-1640 | 英韦特洛根公司 | 61870 | |
| FCS | 英韦特洛根公司 | 10270 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | 英韦特洛根公司 | 25300 | |
| 卡洛芬 Rimadyl | 辉瑞制药有限公司 | PZN 110208 | |
| Magnevist | 拜耳-先灵公司 | PZN 6961516 | |
| Imeron 400 MCT | 布拉科公司 | PZN 228654 | |
| SonoVue | 布拉科公司 | PZN 1567358 | |
| 罂粟碱 | 阿尔法艾撒公司 | L 04152 | |
| 异氟烷 | 百特国际有限公司 | HDG 9623 | |
| Symphony（磁共振成像） | 西门子公司 | ||
| Volume CT（容积计算机断层扫描） | 西门子公司 | ||
| Acuson Sequioa 512（超声） | 西门子-阿库森公司 |
参考文献
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