冰结合蛋白（IBPs），也称为抗冻蛋白，能够抑制冰晶生长，是组织低温保存中一种具有前景的添加剂。研究IBPs的主要工具是纳升渗透压计。我们开发了一种自制的冷却台，安装在光学显微镜上，并通过自行编写的LabVIEW程序进行控制。本文所述的纳升渗透压计可对样品温度进行超灵敏的调控。
本文内容
摘要
摘要
冰结合蛋白（IBPs），包括抗冻蛋白、冰结构蛋白、热滞蛋白以及冰重结晶抑制蛋白，存在于适应寒冷环境的生物体中，通过与冰晶相互作用来保护这些生物免受冷冻损伤。IBPs存在于多种生物体中，包括鱼类1、植物2, 3、节肢动物4, 5、真菌6和细菌7。IBPs吸附在冰晶表面，阻止水分子在IBP吸附位点处加入冰晶格。在吸附的IBPs之间的冰晶表面生长的冰会形成高曲率界面，从而降低冰晶生长所需的温度，这一现象称为吉布斯-汤姆森效应。这种降温作用在熔点与非平衡冻结点之间形成一个温差区间（即热滞，TH），在此区间内冰晶生长被抑制8–10，见图1。IBP研究中的主要工具之一是纳升渗透压计，可用于测定IBP溶液的TH活性。纳升渗透压计，如Clifton仪器（Clifton Technical Physics, Hartford, NY）和Otago仪器（Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand），最初设计用于通过测量纳升级液滴的熔点降低来测定溶液的渗透压。这些设备曾用于测量泪液等生物样品的渗透压11，并被发现对IBP研究也具有应用价值。然而，对这些纳升渗透压计的手动控制限制了实验的可能性：温度变化速率难以精确控制，Clifton仪器的温度范围仅限于4,000 mOsmol（约-7.5 °C），且这些仪器无法提供温度随时间变化的记录功能。
我们设计了一套基于LabVIEW平台（National Instruments）的定制化计算机控制纳升渗透压测定系统。此前已描述过该冷台9, 10，其包含一个金属块，水流经其中起到散热器的作用，参见图2。该金属块上安装有热电制冷器，可通过商用温度控制器驱动，且该控制器可通过LabVIEW模块进行控制，参见图3。下文将提供进一步的细节。该系统的主要优势在于其高灵敏度的温度控制，参见图4。自动温度控制可实现固定温度梯度与包含额外实验细节的视频显微镜输出之间的协调同步。
为了研究TH活性的时间依赖性，我们测试了一种来自南极细菌Marinomonas primoryensis（MpIBP）的58 kDa超活性冰结合蛋白12。该蛋白在彼得·戴维斯（Peter Davies）研究组（女王大学，Queens University）构建的质粒中被标记了增强型绿色荧光蛋白（eGFP）10。我们发现温度变化曲线会影响TH活性。在这些实验中，对温度曲线的精确控制显著提高了TH测量的准确性。纳米升渗透压计还使我们能够检测IBP的重结晶抑制能力5, 13。通常情况下，重结晶是指大冰晶在小冰晶消失的同时继续生长的现象。IBP即使在低浓度下也能高效抑制重结晶14, 15。我们利用由LabVIEW控制的渗透压计，结合对图像的实时视频分析和样品室的温度反馈，定量追踪冰的重结晶过程，并维持恒定的冰相分数13。实时计算为实验过程提供了额外的控制选项。此外，我们开发了一种适用于倒置显微镜的载物台，用于容纳温控微流控装置，相关内容将另文报道16。
冷台系统
冷台组件（图2）由一组热电制冷器组成，用于冷却一块铜板。通过在热电制冷器下方的密闭腔室中循环冷水，将热量从冷台导出。铜板中央有一个直径为4 mm的孔，作为观察窗口。另钻有一个直径为1 mm的平面孔，用于安装热敏电阻。一个定制的铜圆盘（直径7 mm）放置在铜板上，并与观察窗口对齐，该圆盘上设有多个直径为500 μm的孔。空气以35 ml/sec的流速泵入，并使用Drierite（W.A. Hammond）进行干燥。干燥后的空气用于确保冷台环境的干燥。冷台通过一个9针接口连接至温度控制器（Newport Corporation，美国加利福尼亚州尔湾，型号3040或3150）。温度控制器通过电缆连接至计算机的GPIB-PCI卡（National Instruments，美国德克萨斯州奥斯汀）。
方案
0. 初步操作步骤
- 用于溶液注射的玻璃毛细管。 使用拉针仪（Narishige，东京，日本），从玻璃毛细管微管（Brand GMBH，韦尔泰姆，德国）制备尖端细小开口的移液毛细管。通过向毛细管中通入空气并在洁净水中观察微小气泡的形成来验证开口大小。若毛细管堵塞，可通过轻触或刮擦盛水容器壁的方式轻柔地敲断其尖端以打开开口。制备毛细管时应使其开口接近封闭，但仍足够开放，以便形成亚毫米级气泡。
- 铜片清洗。 将铜片在0.1% Micro-90洗涤剂（Cole-Parmer，弗农山，伊利诺伊州，美国）中进行超声清洗10分钟，随后用双蒸水冲洗。将铜片浸入异丙醇（工业级）溶液中，并再次超声处理10分钟。最后，使用过滤空气干燥铜片。此清洗步骤至关重要，可避免实验间冰结合蛋白（IBP）的交叉污染。
- 双层盖玻片组件组装。 组装双层盖玻片结构，以实现在不使水分凝结于盖玻片表面的前提下观察样品。该结构通过在两个盖玻片之间放置一颗Drierite干燥剂颗粒（直径2 mm；W.A. Hammond Drierite，泽尼亚，俄亥俄州，美国），并用热熔胶枪粘合而成。此设计可防止样品冷却至低温时产生冷凝水遮挡视野，同时避免了需持续向观察窗口吹送干燥空气的需要。
1. 冷却台设置
- 将冷却台的水流入口和出口连接至内径为 4 mm 的 Tygon 管（Saint-Gobain，Paris，France），并将水流入口管连接至水泵。
- 将一根内径为 4 mm 的 Tygon 管连接至冷却台的进气口，以输送干燥空气。空气通过串联的 Drierite 柱进行干燥。
- 启动空气泵和水泵。注意：冷却元件不得在无散热装置的情况下运行。
- 打开温度控制器、相机和 LabVIEW 程序。
2. 样品制备
- 在直径为7 mm、带有500 μm通孔的铜片背面滴加3-4 μl的B型浸油（Cargille Laboratories，Cedar Grove，新泽西州，美国）。
- 将铜片放置于冷却台上，使浸油面朝下。
- 将毛细管（钝端）连接至一段内径为0.7 mm的Tygon管，Tygon管另一端连接至2 ml玻璃注射器（Poulten-Graf，Wertheim，德国）。
- 使用毛细管前，检查其微小开口，确保开口尺寸合适（参见初步操作步骤）。
- 将玻璃毛细管缓慢插入已准备好的IBP蛋白样品管（2.4 μM MpIBP-GFP溶于20 mM CaCl2和25 mM Tris-HCl中，pH 8，样品制备细节见参考文献10），并拉动玻璃注射器，使玻璃毛细管中吸入0.1 μl蛋白溶液。
- 通过LabVIEW软件开始视频录制。
- 将含有蛋白溶液的玻璃毛细管尖端插入冷却台上铜片的其中一个孔中。
- 通过显微镜（Olympus，东京，日本，10倍物镜）观察，小心地用玻璃毛细管尖端穿透浸油层，并轻轻推动玻璃注射器，释放少量蛋白溶液（约10 nl），形成一个直径约200 μm的液滴。
- 用双层盖玻片组件覆盖冷却台上的孔（参见初步操作步骤）。
3. TH 活性测定
- 按下冷却按钮，将温度设置为 -40 °C。
- 最初，溶液液滴是透明的。在低温下，通常在 -30 °C 至 -35 °C 范围内，液滴颜色发生变化，表明溶液已冻结。样品冻结后立即缓慢升高温度，直至块状冰开始融化。必须逐步升高温度，以避免温度过冲，导致样品完全融化。
- 切换至 50 倍物镜，并通过调节温度开始融化冰晶。此调节过程为交互式操作，最后阶段通常以 0.002 °C 的微小温度步长进行。持续融化直至仅剩单个晶体，最终晶体尺寸应约为 10 μm。熔化停止时的最高温度即为熔点，该值将在后续视频分析阶段准确确定。
- 将温度设置为略低于晶体熔点的若干百分之一摄氏度，并开始设置 10 分钟延迟的温度梯度程序。根据需要调节升温速率。在此期间，晶体将暴露于 IBPs 中。
- 完成 10 分钟暴露时间后，温度将在 LabVIEW 程序控制下自动下降。
- 观察温度降低过程中晶体的形态变化。在某一时刻，可能观察到冰晶突然破裂。记录发生此现象时的温度，即为晶体破裂温度。
- 通过视频分析确定准确的熔点和破裂温度。首先，利用视频分析确定精确的熔点。需注意，熔化停止时的最高温度即为熔点。将该熔点值记录于电子表格程序中。随后，确定准确的晶体破裂温度，并同样记录该数值。熔点与冰点（即晶体破裂温度）之间的差值，即为 IBP 溶液的热滞活性。
4. 时间依赖性酪氨酸羟化酶活性的测定
- 按照第3.1-3.3节所述方案制备单个冰晶。
- 晶体形成后，根据需要设置程序降温的延迟时间，并启动程序降温。
- 延迟时间结束后，温度将按照设定的固定速率（根据操作者需求）自动下降。
- 记录晶体破裂时的温度，并计算暴露时间（即晶体形成至晶体破裂之间的时间）。
- 对不同的延迟时间重复实验，绘制热滞活性随暴露时间变化的曲线，以评估热滞活性的时间依赖性。
结果
TH 时间依赖性的测量
由 LabVIEW 操作的纳升渗透压计有助于实现精确的热滞（TH）活性测量。恒定的降温速率使得测量 TH 随时间的变化成为可能。纳升渗透压计所提供的精确温度控制对这些实验至关重要。冰晶在溶液中与冰结合蛋白（IBPs）接触的时间被定义为从冰晶形成（熔化过程结束）到冰晶周围冰突然生长（冰晶爆发）之间的时间段。我们发现，冰晶与 IBPs 的接触时间显著影响 TH 活性。较短的 IBP 接触时间（几秒钟）在 MpIBP-GFP 溶液（2.4 μM）中产生较低的 TH 活性（图 5）。随着 IBP 接触时间的延长，TH 活性逐渐增加，并在接触时间为 4 分钟时达到平台期。在较高的 IBP 浓度下，平台期在更短的时间内即可达到。
图1. 显示冰结合蛋白吸附于冰表面的示意图。经许可转载自10。
图 2. 冷却台。A) 与显微镜上的管道连接。B) 未安装上部铅板。C) 示意图。 点击此处查看大图
图3. LabVIEW 界面的截图。点击此处查看高清大图。
图 4. 温度稳定性图。温度控制器设置为每 15 秒降低温度 0.01 °C。
图 5. MpIBP 的热滞活性随冰晶暴露于 IBPs 时间的变化关系。每个时间点均为 3–6 次实验的平均值。
讨论
本研究展示了计算机控制的纳升渗透压仪的操作方法，该仪器能够实现对TH活性的精确测量，并具有卓越的温度控制能力。在任何对温度敏感的系统中，必须避免出现不必要的温度梯度。为防止本文所述装置中产生温度梯度，测试溶液液滴必须位于铜制冷却台圆孔的中心位置（步骤2.7）。此外，单晶应位于液滴中心而非边缘附近（大多数情况下，这一位置会自然形成）。文中描述的时间依赖性表明，降温速率可能会影响TH读数。因此，我们建议记录晶体在降温前接触溶液的时间，以及降温速率。通常情况下，我们在以每4秒0.01 °C的步长开始降温前，会等待10分钟。
采用由 LabVIEW 控制的冷却台，并将其适配用于倒置显微镜，以便对微流控器件进行热调控。该系统有助于开展涉及冰晶及带有 eGFP 标记的冰结合蛋白（IBPs）的溶液交换实验9, 10, 16。通过专用的适配电路将 3,040 温度控制器与系统连接，可将该 LabVIEW 控制系统适配至 Clifton 冷却台。此类系统已在 Davies 实验室中投入使用17。如需获取用于 Clifton 台的 LabVIEW 软件及专用适配电路设计，可提出申请。
综上所述，我们描述了一种纳升渗透压计，该设备能够灵敏地控制和调节温度及其升降速率（灵敏度达0.002 °C），并通过LabVIEW程序与视频界面协同，实现实时分析。该系统可进行可重复的速率控制实验，这对于研究冰结合蛋白（IBP）与冰相互作用的动力学至关重要。此类实验有助于阐明围绕IBP作用机制的多个长期存在争议的问题。
致谢
本研究由ISF、NSF和ERC资助。我们感谢Randy Milford、Michael Koren、Doug Shafer和Jeremy Dennison在温控载台技术方面的协助。Or Chen、Di Xu、Rajesh Sannareddy和Sumit Bhattachary在软件开发方面提供了帮助。我们感谢合作者Peter L. Davies教授和Laurie A. Graham博士的贡献 MpIBP 蛋白以及有益的讨论。我们还要感谢实验室成员 Maya Bar-Dolev 博士、Yangzhong Qin、Yeliz Celik 博士、Natalya Pertaya 博士、Ortal Mizrahy 和 Shlomit Guy 提供的用户反馈。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 浸油 B型 | Cargille Laboratories | 16484 | |
| 干燥剂 Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 清洗液 |  Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| 毛细管拉制仪 | Narishige | PB-7 | |
| 玻璃毛细管 | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm 长，1.15 mm 直径 |
| 温度控制器 | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| 光学显微镜 | Olympus | Model BH2 | |
| 10倍物镜 | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50倍物镜 | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD 相机 | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon 管 | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| 玻璃注射器（2 ml） | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI 卡 | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| 视频图像采集卡 IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW 系统设计软件 | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author 软件 | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
参考文献
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