尽管蜘蛛丝具有优异的机械和生化特性，但无法通过传统方法大量采集这种材料。本文介绍了一种高效制备人造蜘蛛丝纤维的策略，这对于研究蜘蛛丝生成及其作为新一代生物材料应用的科研人员而言，是一项重要的工艺过程。
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本文内容
摘要
摘要
随着社会进步和资源日益稀缺，开发具有高性能特性的新一代生物材料工程技术变得愈发重要。这些新型结构材料的开发必须快速、经济高效，并采用环境友好且可持续的加工方法和产品。蜘蛛能够纺出多种具有不同力学性能的纤维，为仿生学提供了丰富的下一代工程材料来源，其性能可与最优质的人造和天然材料相媲美。由于大量采集天然蜘蛛丝不切实际，合成丝的生产能够为科学家提供无限的纤维供应。因此，如果纺丝过程能够被简化并完善，人造蜘蛛丝纤维将有望广泛应用于防弹衣、外科缝合线、绳索和电缆、轮胎、乐器弦线以及航空与航天技术中的复合材料。为了推进合成蜘蛛丝的生产过程，并获得在连续纺丝过程中材料性能变异较小的纤维，我们开发了一种湿法纺丝方案，该方案整合了在细菌中表达重组蜘蛛丝蛋白、蛋白的纯化与浓缩、纤维挤出以及机械后处理等步骤。这是首次以可视化方式展示在实验室规模下纺制和分析人造丝纤维的逐步过程，同时提供了详细操作要点，以最大限度减少由同一批纺丝液制备的纤维之间的性能差异。这些方法的综合应用将推动人造丝的生产进程，最终获得优于天然蜘蛛丝的高质量纤维。
引言
蜘蛛丝具有卓越的力学性能，优于多种人造材料，包括高强度钢、凯夫拉（Kevlar）和尼龙。1 蜘蛛至少能纺出6至7种不同类型的纤维，这些纤维具有各不相同的力学特性，每种纤维的抗拉强度和延展性均经过特定设计，以执行特定的生物学功能。2 由于蜘蛛丝具有优异的力学性能、良好的生物相容性以及无毒、绿色环保的材料特性，科研人员正积极致力于将其开发为下一代生物材料。3,4 然而，由于蛛形纲动物具有同类相食和毒性的特点，通过养殖方式获取蜘蛛丝难以满足工业化大规模生产的需求。因此，科学家转而采用在转基因生物中表达重组蛛丝蛋白，并结合体外（in vitro）从纯化蛋白中纺制合成纤维的方法。5-8 由于蛛丝蛋白基因序列本身具有高度重复性、较长的物理长度（>15 kb）、高GC含量以及偏好使用丙氨酸和甘氨酸密码子等特性，全长重组蛛丝蛋白的表达在技术上一直存在较大困难。9-11 到目前为止，大多数实验室主要采用部分cDNA序列或人工合成基因，表达大壶状腺丝蛋白MaSp1或MaSp2的截短形式。12-15 合成蜘蛛丝的纺丝过程极具挑战性，需要掌握多个学科领域的知识，而该过程的复杂细节尚未通过视频形式向公众充分展示。事实上，全球仅有少数实验室具备表达蜘蛛丝cDNA、纯化丝蛋白、纺制合成纤维、进行纺后牵伸以及最终测试其生物材料性能的专业能力。8, 16,17 目前用于纺制合成纤维的不同方法包括湿法纺丝、干法纺丝以及静电纺丝技术。16,18,19 所有这些方法都具有一个共同目标——建立一种能够制备出力学性能接近天然蛛丝、适用于大规模商业化生产的合成蜘蛛丝的工艺流程。
本文描述了在实验室规模下采用湿法纺丝技术制备人工蜘蛛丝的流程。与其他纺丝方法相比，湿法纺丝在纤维分析中获得了最为一致的结果。我们首先介绍从在细菌中表达重组蜘蛛丝蛋白开始，继而进行蛋白纯化，随后详述纺丝前的蛋白制备步骤，包括对“初生纤维”实施后拉伸处理的方法，从而获得力学性能接近天然蜘蛛丝质量的纤维。本方法旨在高度模拟天然蜘蛛丝纤维的纺丝过程，并充分借鉴了我们对圆网蛛和穴居蛛类蜘蛛丝腺体结构与功能的研究经验20-22。此外，我们还介绍了利用拉伸仪绘制应力-应变曲线以测定合成纤维材料性能的必要步骤，研究者可据此计算纤维的极限强度、极限应变和韧性。最后但同样重要的是，纺丝、收丝和拉伸装置均可使用市售组件自行搭建，无需购买复杂且昂贵的定制设备。
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方案
图示概览：纺丝过程的仿生模拟
仿生天然蜘蛛丝生产途径：一种合成丝的制造方法。 本图展示了来自金 orb 织网蛛 Nephila clavipes 的主要壶腹腺及其用于天然丝生产的组成部分（白色文字）。尾部区域合成大量丝蛋白，并将其转运至壶腹部，即纺丝原液的储存区域。这种高浓度原液通过纺丝管被挤出，在此过程中发生离子交换和脱水，随后形成纤维。我们实验室所采用的仿生过程以红色文字标示：利用转基因细菌进行重组丝蛋白的生产，随后通过色谱法纯化蛋白质；接着，将纯化后的蛋白进行冻干以浓缩材料；最后，将蛋白重新溶解于 HFIP 中，并通过注射器针头挤入异丙醇浴中。
1. 质粒构建与细菌细胞培养准备
- 使用目标蜘蛛丝cDNA和特异性引物组进行PCR反应。将扩增后的cDNA从凝胶中回收，并连接至原核表达载体（例如pBAD/TOPO ThioFusion）（图1A）。该载体含有N端硫氧还蛋白标签以促进丝蛋白的可溶性表达，以及C端6x his标签用于蛋白纯化。将连接产物转化至感受态E. coli细胞中。
- 筛选含有重组克隆载体的菌落，并挑取单个菌落接种于200 mL含氨苄青霉素的无菌LB培养基中（图1B）。在37 °C恒温振荡培养箱中以200 rpm振荡培养过夜，直至达到饱和生长。
- 将200 mL饱和菌液与800 mL新鲜LB培养基混合，加入0.2%（w/v）阿拉伯糖诱导蜘蛛丝蛋白表达，持续4小时。确保培养过程中始终维持抗生素筛选压力。
- 在4 °C条件下以16,000×g离心10分钟收集菌体（图1C）。为简化操作，可将全部体积样品置于同一容器中离心。根据离心管的容量，可能需要多次离心。如有必要，离心后倾去上清液，再将剩余菌体重新离心，确保所有菌体沉淀集中于同一容器中。细胞沉淀可在-80 °C保存，待后续使用。
- 在处理废弃培养基前，需加入漂白剂或进行高压灭菌以实现彻底灭菌。
2. 细胞裂解
- 向1 L细胞沉淀中加入20 mL 1x裂解缓冲液（图2A）。确保完全重悬细胞沉淀。
- 加入溶菌酶至终浓度为1 mg/mL，以促进细胞进一步裂解。此步骤也可加入DNase以降解染色体DNA，降低溶液黏度。将样品置于摇床中，轻轻振荡20分钟。
- 将溶液超声处理，最长时间不超过1分钟。
- 为澄清溶液，在4 °C条件下以16,000×g离心10分钟（图2B）。
3. 蛋白质纯化：Ni-NTA 亲和柱层析
- 去除上清液，并将其转移至一个洁净的 25 mL 层析柱中。确保上清液无黏性且澄清透明。如果溶液黏稠或浑浊，可加入更多的 DNase 或进行超声处理，和/或重新离心上清液（重复步骤 2.3–2.4）。
- 向层析柱中加入 1 mL Ni-NTA 悬浮液（含 0.5 mL 树脂珠）。拧紧盖子和活塞，置于摇床上平衡 1 小时，使 6x his 标签与 Ni-NTA 树脂珠充分结合（图 3A）。
- 将层析柱垂直固定在支架上，静置约 2 分钟使 Ni-NTA 树脂珠完全沉降。当树脂珠完全沉降后，可在底部观察到一层浅蓝色。
- 取下盖子，打开活塞使溶液流过层析柱。收集该溶液用于后续分析（图 3B）。
- 加入 20 mL 1x 洗涤缓冲液，待树脂珠沉降后打开活塞使溶液流过。将流出液分为四份，每份 5 mL，分别收集用于后续分析。注意：可增加洗涤体积以减少杂质蛋白；但可能导致最终蛋白得率下降。
- 加入 20 mL 1x 洗脱缓冲液，待树脂沉降后打开活塞使溶液流过。将流出液分为四份，每份 5 mL，分别收集用于后续分析。注意：若洗脱未完全，可从 Ni-NTA 树脂中收集额外的洗脱体积。
- 样品可根据需要短期或长期保存于 4 °C 或 -80 °C。
- 采用 SDS-PAGE 分析对样品进行分子量分级分离，使用银染或考马斯亮蓝 R-250 染色显示蛋白条带（图 3C）。后续步骤仅使用纯度合格的组分。注意：可采用 Western 印迹分析确认纯化蛋白的身份。
4. 透析与冻干
- 将样品在至少100倍样品体积的去离子水中透析2天，每6小时更换一次水溶液，以彻底去除所有盐分。注意：透析袋的分子量截留范围取决于重组丝蛋白的大小。
- 称量六个1.5 mL的空微量离心管并记录其质量。为便于冻干，可在称量前于管盖上预先刺出小孔或切口（图4A）。
- 透析完成后，将1 mL透析后的样品转移至6个已称重的微量离心管中（图4B）。使用液氮速冻，并用冷冻干燥机干燥样品（图4C）。
- 干燥后，向每个离心管中再加入1 mL透析样品。重复此步骤，直至全部透析样品在微量离心管中完成干燥。
- 冻干后的样品可于-80 °C长期保存。
5. 纺丝液的制备
- 称量每个含有干燥蛋白质粉末的微量离心管。减去空管的初始质量，得到总干蛋白质量。注意：根据蛋白质得率，您可能需要纯化额外的材料用于纺丝过程。
- 计算向每根管中加入六氟异丙醇（HFIP）的体积，使其终浓度达到 200 mg/mL 至 500 mg/mL，或 20% 至 50%（质量/体积）。将适量 HFIP 加入每根管中（图 4D）。注意：HFIP 具有高挥发性和毒性，操作时应小心移液，并尽快盖紧管盖。HFIP 必须在通风橱内操作。
- 用封口膜封住管口，置于摇床上溶解蛋白质。期间可间歇性涡旋振荡并离心，以促进溶解。此过程可能需要长达 2 天时间。
6. 注射器准备和装置设置
- 将至少 25 μL 溶解后的纺丝液装入注射器中。确保无任何聚集体存在，以免堵塞注射器。注意：该样品黏度极高，移液时需格外小心。
- 将纺丝液垂直推至注射器前端，彻底排除所有气泡（图 5A）。注意：气泡会导致纤维结构不均一。
- 将注射器固定至泵上。将装有 95% 异丙醇的 400 mL 烧杯抬高，使注射器尖端刚好接触酒精液面（图 5B）。
- 设定注射泵流速为 15 μL/min 并启动程序。让初生纤维在异丙醇中静置 20 分钟，以充分达到平衡状态。注意：这些纤维仍可用于串联质谱（MS/MS）分析，以确认纤维中蛋白质的身份。
7. 离心后取样与样本收集
- 在卷绕装置的梳状部件两侧贴上双面胶带。卷绕装置由将金属梳状部件粘接到数字卡尺上制成（图 6A）。将卷绕装置固定到电机上（图 6B）。建议以 2 rpm 的速度进行卷绕。注意：过快的卷绕速度会导致纤维质量及可重复性出现较大差异。
- 使用镊子轻轻夹住纤维一端，缓慢将其从异丙醇中拉出，并固定到卷绕装置梳状臂的一侧边缘（图 6C）。接下来的步骤应连续进行，避免纤维干燥。
- 启动电机，轻柔地引导纤维缠绕至卷绕装置上。注意：卷绕过程中，避免纤维重叠或堆叠。
- 当整根纤维完成卷绕后，将卷绕装置从电机上取下，并在双面胶带上的每根丝纤维边缘处涂抹胶水（图 6D），以将蜘蛛丝牢固固定在装置上。注意：在后拉伸前于双面胶带上涂胶，可防止整根纤维滑动，从而实现对卡尺臂内部纤维段的选择性拉伸。
- 将卷绕装置连接至线性驱动器（图 7A）。使用卡尺记录纤维的初始长度。注意：此长度为纤维内部有效长度，不包括粘附并缠绕在卷绕装置上的部分。
- 将卷绕装置浸入 75% 异丙醇溶液中，静置 10 分钟使纤维达到平衡状态。注意：纺丝过程中也可使用其他脱水溶液，如甲醇、丙酮和硫酸铵溶液。
- 将线性驱动器的速度设定为 1.5 mm/sec。根据初始长度，计算目标后拉伸倍数对应的最终长度。拉伸量可根据速度或长度进行控制，具体取决于实验设置。例如，若初始长度为 15 mm，目标后拉伸倍数为 3 倍，则最终长度应为 45 mm。也可通过以 1.5 mm/sec 的速度驱动线性驱动器运行 20 秒来实现。
- 完成目标后拉伸后，缓慢将卷绕装置从异丙醇中提起。静置 1 分钟使残留的异丙醇液滴挥发，随后采集样品（图 7B）。样品应安装在卡片纸或金属箔框架上用于后续测试。
- 若需进行进一步的后拉伸处理，可将卷绕装置重新浸入 75% 异丙醇溶液中，静置 10 分钟使纤维重新平衡，然后继续下一次后拉伸处理。
8. 拉伸测试
- 将采集的样品置于标准实验室环境中静置至少1小时，使其达到平衡状态，再进行力学测试。应记录湿度和温度，因为它们可能影响纤维的力学性能。标准的湿度和温度条件应分别约为40%和25 °C。
- 使用胶水将卡纸或金属箔的边缘粘合，以将纤维固定在框架上。注意记录框架开口的尺寸，该尺寸即为待测纤维的初始长度。本实验中使用的是1英寸（25.4 mm）开口的框架（图8A）。
- 使用放大倍数为100倍或更高的光学显微镜，沿纤维的纵向轴线测量其直径，至少记录3个测量值。所用放大倍数越高，测量次数越多，结果的准确性越高。
- 将框架固定在拉伸试验机的机械加载架上（图8B）。从框架两侧将其剪开，使张力仅作用于纤维本身。对拉伸试验机进行归零校准后开始采集数据。推荐使用2%每秒的标准应变速率。
- 利用采集的数据和平均直径，可绘制出应力-应变曲线。
- 断裂后的纤维可安装在扫描电子显微镜（SEM）样品台中，用于形貌分析及断裂点处直径的测量。远离断裂点的纤维段可用于估算并验证光学显微镜测得的初始直径。
9. 代表性结果
从第3步开始，应通过SDS-PAGE分析不同组分，并使用银染或考马斯亮蓝R-250对蛋白质进行显色。在标准的Ni-NTA柱条件下，可获得纯度>90%的洗脱组分（图9）。微量的污染蛋白可通过充分透析进一步去除。使用20%（w/v）的25 μL纺丝液，可从卷绕轴上连续缠绕的纤维中收集至少30个独立的纤维样品（假设初始长度为13 mm）。机械性能可通过拉力计测试进行分析（图10）。根据用于纺丝过程的重组丝蛋白种类，最大后拉伸比需通过实验确定。通常，在不导致纤维断裂的情况下，可实现4.0x的后拉伸比（图10）。纺出的纤维无论在后拉伸前或后，均可通过扫描电子显微镜观察其超微结构（图11A,B）。纺出的纤维也可用于机械性能测试，同一后拉伸比组内的测试结果变异较小（图10）。
图 1. 蜘蛛丝cDNA在细菌中的表达。A) 将含有目标蜘蛛丝cDNA的pBAD TOPO/Thio载体转化至感受态E. coli细胞中。B) 挑取单菌落接种于200 mL LB培养基中，过夜培养至饱和。接种后加入800 mL新鲜LB培养基，并用阿拉伯糖诱导表达。C) 诱导结束后，通过离心收集菌体沉淀。 点击此处查看高清大图。
图 2. 诱导蜘蛛丝蛋白表达后细菌细胞的裂解。A) 向细胞沉淀中加入 20 mL 1× 裂解缓冲液和 DNase，置于摇床中振荡并进行超声处理以裂解细胞。B) 将细胞裂解物在离心机中离心，以去除细胞碎片，收集澄清的上清液。 点击此处查看大图。
图 3. 利用亲和层析纯化蜘蛛丝重组蛋白。A) 将细胞裂解上清液与 Ni-NTA 珠加入层析柱中，孵育 1 小时。B) 收集流穿液后，依次使用 20 mL 洗涤缓冲液和 20 mL 洗脱缓冲液，并以 5 mL 为一份收集各组分。C) 通过 SDS-PAGE 分析不同组分；含有目标蛋白的纯净样品被转移至透析袋中，并用去离子水透析至完全。 点击此处查看大图。
图4. 用于湿法纺丝的纯化蜘蛛丝蛋白的制备。A) 将透析后的产物以1 mL等分试样转移至预先称重的离心管中。B) 使用液氮对1 mL等分试样进行快速冷冻。C) 将冷冻样品冻干，并加入更多透析样品。D) 计算干燥质量，向干粉中加入HFIP，制备成20% (w/v) 的纺丝液。 点击此处查看大图。
图 5. 将纺丝液装入玻璃注射器以进行湿法纺丝。A) 将注射器垂直持握，推动纺丝液至注射器柱体顶部，以排除气泡。B) 将装有纺丝液的注射器安装至注射泵上，并浸入95%异丙醇浴中，使针尖刚好接触浴液表面。
图6. 将合成的蜘蛛丝纤维卷绕到定制收丝装置上。A) 收丝装置由带金属梳齿的数字卡尺构成。在梳齿两侧贴上双面胶带，用于固定纤维末端。B) 使用鳄鱼夹将卷轴连接到低速电机上。C) 将纤维从乙醇浴中缓慢拉出，并缠绕在卷轴上。D) 在每段纤维的边缘涂上胶水，以固定其位置。图中显示了由不同蛋白质纺成的两种不同纤维。
图 7. 使用自制装置对合成纤维进行纺丝后牵伸。A）卷绕装置通过鳄鱼夹连接至线性驱动器装置。B）完成纺丝后牵伸步骤后，将卷筒从浴槽中提起。待异丙醇液滴完全蒸发后，再收集纤维。
图8. 将合成蜘蛛丝纤维安装到厚纸板上以进行力学研究。A) 收集的纤维被安装在具有1英寸×1英寸开口的厚纸板框架上。纤维最初用双面胶带固定，然后用胶水进一步加固。B) 将厚纸板框架固定在拉力计上，随后剪开两侧，使张力仅作用于纤维上。
图9. 通过SDS-PAGE分析并结合银染显色，对纯化的重组MaSp1蛋白组分进行大小分级。蛋白ladder以kDa表示。两次洗涤样品显示出微球的非特异性结合，而洗脱样品表明需要进行6次收集才能确保完全回收目标蛋白。
图10. 由重组TuSp1蛋白纺丝得到的纤维的应力-应变曲线。8 不同颜色表示经过不同纺后拉伸比（范围从2.5倍至6倍）处理的纤维。同一拉伸比组内的纤维表现出较低的变异；随着纺后拉伸比的增加，纤维强度提高，而延展性降低。
图11. 由重组TuSp1蛋白纺成的纤维的扫描电子显微镜图像。A) 在500倍放大下，可见光滑的外表面。B) 在5000倍放大下，可通过纤维的自然断裂观察到致密的内部核心。
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讨论
采用该方法纺制的合成纤维在力学性能上与天然纤维处于同一数量级。通过将卷绕和纺后拉伸过程机械化，减少了人为误差，使样品间的实验变异得到更严格的控制并显著降低。
我们的方法有望用于研究由蜘蛛基因家族其他成员的cDNA编码的重组蛋白纺成的其他纤维的力学特性。该方法还可能确定纤维蛋白内不同蛋白模块之间或不同类型纤维蛋白之间的力学作用23。此外，该方法允许将丝纤维作为复合材料进行测试，因为可将多种丝蛋白或其他分子混合或添加后共同纺成蛋白质混合物。
这种纺丝方法为其他实验室提供了一个易于拓展的平台，因为相关装置可以简便地构建。该方法还允许在每一步骤中调整参数，以优化或定制具有独特机械性能的特定纤维设计。随着未来对绿色生物材料需求的不断增长，该方法可被改进用于制备适用于多种下一代应用的纤维。
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致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）RUI基金资助，项目编号分别为MCB-0950372和DMR-1105310，项目名称分别为“黑寡妇蜘蛛丝的分子表征”和“蜘蛛胶状丝的力学行为”。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pBAD/TOPO ThioFusion 表达试剂盒 | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak 细胞裂解试剂，10 倍浓度 | Promega | V857C | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | 包含缓冲液使用说明 |
| ProteoSilver 银染试剂盒 | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone 冷冻干燥机 | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| 六氟异丙醇（HFIP） | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| 注射器 | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| 针头 | Hamilton | 7780-01 | 26s 规格，钝端可拆卸针头 |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| 数显卡尺 | Carrera | CP5906 | 0–150 mm 量程 |
| 不锈钢镊子 | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 电机 | Nature Mill | 7090529 | 12VDC，转速 2 rpm |
| 直线执行器 | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC，行程 6 英寸 |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| 数码显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC320 | 软件：Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments | 500260 | |
| 微力张力计 | Aurora Scientific | 310C | 5N 双模式系统 |
参考文献
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