尽管蜘蛛丝具有优异的机械和生化特性，但无法通过传统方法大量采集这种材料。本文介绍了一种高效制备人造蜘蛛丝纤维的策略，这对于研究蜘蛛丝生成及其作为新一代生物材料应用的科研人员而言，是一项重要的工艺过程。
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本文内容
摘要
摘要
随着社会进步和资源日益稀缺，开发具有高性能特性的新一代生物材料工程技术变得愈发重要。这些新型结构材料的开发必须快速、经济高效，并采用环境友好且可持续的加工方法和产品。蜘蛛能够纺出多种具有不同力学性能的纤维，为仿生学提供了丰富的下一代工程材料来源，其性能可与最优质的人造和天然材料相媲美。由于大量采集天然蜘蛛丝不切实际，合成丝的生产能够为科学家提供无限的纤维供应。因此，如果纺丝过程能够被简化并完善，人造蜘蛛丝纤维将有望广泛应用于防弹衣、外科缝合线、绳索和电缆、轮胎、乐器弦线以及航空与航天技术中的复合材料。为了推进合成蜘蛛丝的生产过程，并获得在连续纺丝过程中材料性能变异较小的纤维，我们开发了一种湿法纺丝方案，该方案整合了在细菌中表达重组蜘蛛丝蛋白、蛋白的纯化与浓缩、纤维挤出以及机械后处理等步骤。这是首次以可视化方式展示在实验室规模下纺制和分析人造丝纤维的逐步过程，同时提供了详细操作要点，以最大限度减少由同一批纺丝液制备的纤维之间的性能差异。这些方法的综合应用将推动人造丝的生产进程，最终获得优于天然蜘蛛丝的高质量纤维。
引言
蜘蛛丝具有卓越的力学性能，优于多种人造材料，包括高强度钢、凯夫拉（Kevlar）和尼龙。1 蜘蛛至少能纺出6至7种不同类型的纤维，这些纤维具有各不相同的力学特性，每种纤维的抗拉强度和延展性均经过特定设计，以执行特定的生物学功能。2 由于蜘蛛丝具有优异的力学性能、良好的生物相容性以及无毒、绿色环保的材料特性，科研人员正积极致力于将其开发为下一代生物材料。3,4 然而，由于蛛形纲动物具有同类相食和毒性的特点，通过养殖方式获取蜘蛛丝难以满足工业化大规模生产的需求。因此，科学家转而采用在转基因生物中表达重组蛛丝蛋白，并结合体外（in vitro）从纯化蛋白中纺制合成纤维的方法。5-8 由于蛛丝蛋白基因序列本身具有高度重复性、较长的物理长度（>15 kb）、高GC含量以及偏好使用丙氨酸和甘氨酸密码子等特性，全长重组蛛丝蛋白的表达在技术上一直存在较大困难。9-11 到目前为止，大多数实验室主要采用部分cDNA序列或人工合成基因，表达大壶状腺丝蛋白MaSp1或MaSp2的截短形式。12-15 合成蜘蛛丝的纺丝过程极具挑战性，需要掌握多个学科领域的知识，而该过程的复杂细节尚未通过视频形式向公众充分展示。事实上，全球仅有少数实验室具备表达蜘蛛丝cDNA、纯化丝蛋白、纺制合成纤维、进行纺后牵伸以及最终测试其生物材料性能的专业能力。8, 16,17 目前用于纺制合成纤维的不同方法包括....
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方案
图示概览：纺丝过程的仿生模拟
仿生天然蜘蛛丝生产途径：一种合成丝的制造方法。 本图展示了来自金 orb 织网蛛 Nephila clavipes 的主要壶腹腺及其用于天然丝生产的组成部分（白色文字）。尾部区域合成大量丝蛋白，并将其转运至壶腹部，即纺丝原液的储存区域。这种高浓度原液通过纺丝管被挤出，在此过程中发生离子交换和脱水，随后形成纤维。我们实验室所采用的仿生过程以红色文字标示：利用转基因细菌进行重组丝蛋白的生产，随后通过色谱法纯化蛋白质；接着，将纯化后的蛋白进行冻干以浓缩材料；最后，将蛋白重新溶解于 HFIP 中，并通过注射器针头挤入异丙醇浴中。
1. 质粒构建与细菌细胞培养准备
- 使用目标蜘蛛丝cDNA和特异性引物组进行PCR反应。将扩增后的cDNA从凝胶中回收，并连接至原核表达载体（例如pBAD/TOPO ThioFusion）（图1A）。该载体含....
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讨论
采用该方法纺制的合成纤维在力学性能上与天然纤维处于同一数量级。通过将卷绕和纺后拉伸过程机械化，减少了人为误差，使样品间的实验变异得到更严格的控制并显著降低。
我们的方法有望用于研究由蜘蛛基因家族其他成员的cDNA编码的重组蛋白纺成的其他纤维的力学特性。该方法还可能确定纤维蛋白内不同蛋白模块之间或不同类型纤维蛋白之间的力学作用23。此外，该方法允许将丝纤维作为复合材料进行测试，因为可将多种丝蛋白或其他分子混合或添加后共同纺成蛋白质混合物。
这种纺丝方法为其他实验室提供了一个易于拓展的平台，因为相关装置可以简便地构建。该方法还允许在每一步骤中调整参数，以优化或定制具有独特机械性能的特定纤维设计。随着未来对绿色生物材料需求的不断增长，该方法可被改进用于制备适用于多种下一代应用的纤维。
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致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）RUI基金资助，项目编号分别为MCB-0950372和DMR-1105310，项目名称分别为“黑寡妇蜘蛛丝的分子表征”和“蜘蛛胶状丝的力学行为”。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| pBAD/TOPO ThioFusion 表达试剂盒 | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak 细胞裂解试剂，10 倍浓度 | Promega | V857C | |
| Ni-NTA 琼脂糖 | Qiagen | 30210 | 包含缓冲液使用说明 |
| ProteoSilver 银染试剂盒 | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone 冷冻干燥机 | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| 六氟异丙醇（HFIP） | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| 注射器 | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| 针头 | Hamilton | 7780-01 | 26s 规格，钝端可拆卸针头 |
| 注射泵 | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| 数显卡尺 | Carrera | CP5906 | 0–150 mm 量程 |
| 不锈钢镊子 | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 电机 | Nature Mill | 7090529 | 12VDC，转速 2 rpm |
| 直线执行器 | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC，行程 6 英寸 |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| 数码显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC320 | 软件：Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments | 500260 | |
| 微力张力计 | Aurora Scientific | 310C | 5N 双模式系统 |
参考文献
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P.
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重印与许可
