基于流式细胞术的酿酒酵母（S. cerevisiae）合子纯化

摘要

为了纯化酿酒酵母（S. cerevisiae）的合子，将具有相反交配型的单倍体细胞分别改造为表达红色或绿色荧光蛋白，共孵育以促进合子形成，随后采用基于流式细胞术的分选方案进行分离。所得高度富集的合子组分可用于后续的“组学”研究、初始子代的回收，以及合子形态发生的系统性分析。

摘要

合子是许多生物生命周期中单倍体与二倍体状态之间的重要中间阶段，包括酵母（图1）¹。S. cerevisiae 的合子由不同交配型（MATa、MATα）的单倍体细胞融合形成，并通过其显著不对称的有丝分裂，产生相应的稳定二倍体，继而可连续生成多达20个二倍体后代²。合子的形成由一系列复杂事件协调完成：在此过程中，可溶性交配因子与相应的受体结合，触发受体介导的信号级联反应，从而导致细胞周期中断，并最终实现细胞-细胞融合。合子可作为前体细胞或干细胞功能的模型。

尽管关于合子形成的研究已取得诸多进展，并且合子已被用于探讨具有普遍意义的细胞与分子生物学问题，但几乎所有的研究都使用了合子与大量单倍体细胞混合的交配体系^3-8。因此，合子形成及其后续生命过程中的许多生化特性仍尚未得到深入研究。

已有文献报道基于酵母合子沉降特性的纯化方法⁹；然而，我们在实验中采用该基于沉降的方案未能获得接近90%的纯度。此外，该方法存在细胞暴露于高渗山梨醇环境的缺点。因此，我们开发了一种通用的纯化流程。具体而言，将表达红色或绿色荧光蛋白的单倍体细胞配对共孵育，以诱导合子形成，在不同时间点收集细胞，并利用基于流式细胞术的分选方案对所获得的合子进行纯化。该技术可直观地评估合子纯度及成熟程度，所得组分的平均纯度约为90%。根据收获时间的不同，可获得不同成熟阶段的合子。纯化后的样品可作为开展“组学”研究、获取初始子代细胞以及系统分析此类前体细胞的理想起始材料。

方案

1. 单倍体细胞培养

1. 在标准条件下培养来自 S288C 背景（BY4741）的 S. cerevisiae 细胞¹⁰。
2. 转化单倍体细胞，使其表达两种明显荧光标记物中的任意一种¹⁰。所选标记物为在细胞质中表达的可溶性 GFP（pEG220，URA3/YIp，用 BglII 线性化¹¹），以及与 mCherry 融合的单个核糖体蛋白 RPL25（pAJ1661，URA3/CEN，来自 A. Johnston）。我们预计，等效的双色纯化方案也可使用其他由单倍体亲本细胞合成的强荧光蛋白。或者，可用荧光凝集素标记细胞壁。
3. 在纯化合子的前一天，分别接种 5 ml 的两种细胞类型培养物，并在 23 °C 下振荡培养过夜，使其 A600 不超过 1.0。将 GFP 转化子（ATY4442）培养于含 2% 葡萄糖的完全合成培养基（CSM-葡萄糖）中，RPL25-mCherry 转化子（ATY4552）培养于缺乏尿嘧啶的合成选择性培养基中¹⁰。同时在室温下振荡培养每种细胞类型的平行培养物。

2. 进行杂交

1. 用新鲜培养基将各样品的光密度（A600）调整至1.0。[1个光密度单位 ~ 3 × 10⁷ 个细胞/ml]
2. 取等体积的两种培养物混合，短暂涡旋振荡....

讨论

纯化合子的获得将有助于开展包括转录组学、蛋白质组学和脂质组学在内的生化研究，以及合子细胞周期重启、细胞壁重塑、出芽和遗传特性等机制的探究。此外，也可利用在单个或双亲中携带特征性突变的菌株来生成合子。同时，与单倍体或二倍体细胞类似，纯化的合子可在含15%甘油的培养基中冷冻保存，并在后续解冻以观察其重复出芽等特性。

使用其他适用于显微镜观察的荧光标记物进行的初步实验（例如 标记的组蛋白或线粒体蛋白）无法可靠地回收合子；然而，有可能通过将单倍体细胞的细胞壁偶联红色或绿色荧光染料来实现类似的纯化。我们已避免采用此类方法，因为它们可能施加额外的应激并影响合子形成的早期阶段。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pEG220，URA3/YIp，编码细胞质GFP 11)	E. Grote
pAJ1661，URA3/CEN，编码与mCherry融合的RPL25	A. Johnston
Fisher FB120超声波破碎仪	Fisher Scientific
带滤帽的聚丙烯管	BD Falcon	货号 352235
制冷型微量离心机	Tomy	MRX-150
流式细胞术鞘液	Biosure	1027
iCyt Reflection型流式细胞仪	Sony
DeltaVision去卷积显微镜	Applied Precision
正置落射荧光显微镜	Leica
UltraPure琼脂糖	Invitrogen	15510-07
CSM葡萄糖培养基 注：对于琼脂平板，只需添加2%琼脂（Difco）	10