离体 离体骨骼肌收缩力、疲劳性及交替性的评估

摘要

我们介绍一种直接测量离体骨骼肌肌肉力量、肌肉功率、收缩动力学及疲劳性的方法 体外 使用场刺激的系统。关于Ca²⁺ 通过不同的刺激方案，可获得肌肉的力学特性及其收缩机制的相关数据。

摘要

本文介绍了一种测量分离骨骼肌收缩力的方法。通过该方法可获得肌肉力量、肌肉功率、收缩动力学、疲劳性及疲劳后恢复等参数，用于评估兴奋-收缩耦联（ECC）过程的特定方面，如兴奋性、收缩装置和Ca²⁺ 操作能力。该方法去除了神经和血液供应，专注于分离的骨骼肌本身。我们常规使用此方法来鉴定通过调节Ca²⁺ 信号通路。在此，我们描述了一种新发现的骨骼肌表型， 即，机械交替，作为利用该方法可获得的各种丰富信息的一个示例 体外 肌肉收缩力测定。将该测定方法与单细胞测定、遗传学方法及生物化学测定相结合，可深入揭示骨骼肌兴奋-收缩耦联（ECC）的分子机制。

引言

骨骼肌附着在骨骼上，并在中枢神经系统的控制下产生收缩力。兴奋-收缩耦联（ECC）是指将电信号转化为机械反应的过程。Ca²⁺ 信号是骨骼肌收缩功能的关键组成部分。从肌浆网（SR）有效动员 Ca²⁺ 是肌肉细胞兴奋-收缩耦联的重要环节^{1, 2}，而多种肌肉疾病中相应的收缩功能障碍也与细胞内 Ca²⁺ 信号的变化密切相关^3-5。对肌肉收缩力的准确评估至关重要，且应与 Ca²⁺ 成像及其他检测方法相互补充，以深入理解骨骼肌功能，不仅在收缩层面，还包括动力学层面。此外，还可获取肌肉的收缩力和速度数据，从而评估肌肉功率这一重要特性，以及在不同生理和病理生理条件下兴奋-收缩耦联过程的状态。

这一富有成果的研究领域具有非常悠久的历史，两千多年来出现了许多关于肌肉收缩的理论⁶。现代肌肉研究可能始于1674年至1682年间，Leeuwenhoek通过显微镜观察到肌纤维中的横纹和肌原纤维⁶。近一个世纪后，Luigi Galvani发现，当青蛙肌肉的神经在远处电机产生电火花时被手术刀触碰，肌肉会剧烈收缩^7-9。通过金属导体将腿部神经与肌肉连接也可引发收缩。Galvani所提出的复杂电传导机制的细节，最终由Hodgkin、Huxley和Katz在其著名的方程中得以系统阐述^{10, 11}，该方程成为电生理学的基础。Ringer关于细胞外Ca²⁺对青蛙心脏和骨骼肌收缩力影响的卓越观察^12-15，标志着人们首次认识到Ca²⁺是调控肌肉收缩力的关键调节因子^{16, 17}。自1980年代至今，由于小鼠骨骼肌中肌肉收缩力和疲劳性实验方案的引入，肌肉收缩力研究领域取得了一系列突破性进展¹⁸。Jones和Edwards首次提出，低频间歇性疲劳（运动引起的力下降）¹⁹与兴奋-收缩耦联（ECC）机制的变化有关，而非收缩装置本身的问题。在1980年代末至1990年代初，Kolkeck et al²⁰、Kolbeck和Nosek²¹以及Reid²²利用啮齿类动物模型的膈肌研究茶碱、皮质酮和自由基对骨骼肌收缩力的影响，而Brooks和Faulkner则首次报道了对小鼠快肌和慢肌重复测力及功率测量的结果²²。此外，Lannegren、Westerblad、Lamb和Westerblad首次将离体（ex vivo）收缩力与细胞内Ca²⁺调控直接联系起来，并开始质疑酸中毒在肌肉疲劳中的作用^{23, 24}。

自21世纪初以来，我们的实验室通过结合完整小鼠肌肉收缩功能研究、完整及去膜肌纤维内细胞内Ca²⁺监测以及分子遗传学操作技术，深入研究了在肌肉兴奋-收缩耦联（ECC）中具有调节和调控作用的新基因，这些基因在肌肉收缩力、疲劳性及衰老过程中发挥关键作用^{3-5, 25-29}。

本文详细介绍了测量小鼠分离比目鱼肌和趾长伸肌（EDL）收缩力的实验方案。比目鱼肌主要由慢缩-氧化型肌纤维（I型和IIa型肌纤维）组成，而趾长伸肌主要由快缩-糖酵解型肌纤维（IIb型和IIx型肌纤维）构成，二者具有不同的收缩特性。在本方案中，完整肌肉-肌腱复合体被分离后置于由纯氧或95%氧气与5% CO₂混合气体供氧的ADI PowerLab Radnotti浴槽系统中。通过Grass刺激器施加电刺激诱发肌肉收缩力，并利用与ADI PowerLab/400系统集成的力传感器检测收缩力，该系统支持自定义宏程序，以控制数据的采集、记录、数字化及存储。该实验装置可测定肌肉力量、肌肉功率、力-频率关系、肌肉疲劳程度、疲劳后恢复能力，以及肌肉收缩的速度和整体动力学特性。此外，还可通过此类实验监测药物对肌肉收缩的影响。

该方法的优势在于可去除骨骼肌中的神经和血管成分，从而直接评估肌肉收缩的内在特性。此外 离体 收缩力测定实验允许对分离肌肉周围细胞外环境进行操控，从而可通过药理学手段干预各种离子通透通道和转运蛋白，以明确其在骨骼肌功能中的生理作用。

这 离体 该系统使我们最近发现某些突变型肌肉标本中存在一种独特的交替行为，这种行为与细胞内 Ca 水平的改变相关²⁺ 操作性能⁴交替现象定义为在疲劳过程的衰减阶段出现的收缩力波动性爆发事件。在这些事件中，收缩力在疲劳性刺激期间短暂地超过此前的力水平，这可能是因为胞内钙离子浓度瞬时升高或肌丝对钙离子的敏感性增加所致。²⁺ 正在释放，或收缩装置对Ca的敏感性增加^2+  30环己哌啶酸（CPA，一种可逆性肌浆网-内质网钙离子ATP酶（SERCA）阻断剂）、咖啡因（兰诺定受体（RyR）激动剂）以及重复性疲劳刺激均可诱导机械交替现象。⁴，表明交替现象与兴奋-收缩耦联过程的调节直接相关。本方法用于诱导和记录机械交替现象的演示 体外 收缩力检测装置可作为示例，展示基于不同研究兴趣，利用该系统或类似系统所能获得的多样化实验参数。

该方法可能对研究肌肉生理学的研究人员具有重要意义。类似的装置也可用于其他解剖部位的分离骨骼肌-肌腱/韧带复合体，以及单根肌纤维和肌肉条。

方案

溶液成分：

2.5 mM Ca²⁺ 台氏液：140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2.5 mM CaCl₂、2 mM MgCl₂ 和 10 mM 葡萄糖

0 mM Ca²⁺ Tyrode 溶液：140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、2 mM MgCl₂、0.1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）和 10 mM 葡萄糖

注意：如果使用上述溶液，灌流液应以100% O₂饱和；如果使用碳酸氢盐缓冲液以维持pH恒定，则应以95% O₂和5% CO₂饱和。在灌流缓冲液中加入2.5 mM Ca²⁺，以模拟细胞外空间中的Ca²⁺水平；同时添加10 mM葡萄糖非常重要，因为在线粒体仍发挥功能的肌肉中，葡萄糖的存在可支持ATP的持续生成。

1. 设置 离体 使用 ADI PowerLab 系统进行收缩力实验

1. 4通道示意图 离体 收缩系统如图所示 图1计算机控制刺激器产生方波脉冲，脉冲经隔离单元滤波后传递至环绕每个分离肌肉-肌腱复合体的一对铂丝电极，该过程亦称为场刺激。肌肉对刺激产生的收缩反应由力传感器检测，传感器输出的信号经放大、滤波后，通过模数转换器（信号调理）传回计算机，信号随后被数字化，可供后续分析保存使用。
2. 为准备 离体 收缩性实验，首先打开场刺激器、A/D 转换器（此处为 ADI Power Lab）或类似软件例如，LabView），随后连接计算机。
3. 打开 Chart4 软件（或其他与系统兼容的软件版本），启动四通道任务；当软件与硬件通信正常时，硬件将开始配置，软件上的“START”按钮变为可操作状态（激活）；四通道功能可同时测量一对来自野生型和突变型小鼠的肌肉，或同一只小鼠的两条 EDL 肌和两条比目鱼肌，也可用于其他肌肉，如膈肌（完整膈肌、半膈肌或膈肌肌条）以及胫骨前肌；该功能还可用于心脏肌肉标本及肌肉束，尤其是使用大鼠肌肉时。在此情况下，肌肉尺寸可能限制氧气扩散，因此肌肉束是更合适的选择。然而，肌肉束制备需要熟练的解剖技术。
4. 力传感器的校准：此步骤旨在确保在不同通道和不同时间生成的数据集具有可比性。首先开始记录，依次在力传感器的样品槽上悬挂1-g、2-g和5-g的砝码，每次悬挂后停止记录，通过Chart4软件计算各通道显示的mV变化值，绘制ΔmV与砝码重量的关系图以检验线性关系，并确定mV与克力之间的转换系数。建议在每次实验开始前或结束时进行校准，以确保每项具体实验均获得对应的特定校准参数。
5. 检查聚四氟乙烯管连接是否正确，排空组织浴槽管路中残留的液体，用ddH₂O反复冲洗 chamber 三遍或更多次₂O，并加入 20~25 ml 2.5 mM Ca²⁺ Tyrode 溶液。Ca²⁺ 以及葡萄糖在灌流液中提供，以帮助维持膜完整性，最佳 Ca²⁺ 肌浆网（SR）的加载，以及肌肉自身通过线粒体生成ATP所需的 readily available 能量来源，因为在线粒体保持完全功能的这些制备物中。
6. 检查氧气供应连接是否正确，打开氧气罐，并调节氧气流量，使灌流 chamber 内产生弥散且均匀的气泡。可通过收缩力随时间变化的函数关系轻松确定氧气水平。也可安装流量计，特别是当研究者希望研究缺氧或高氧效应时。若肌肉发生缺氧，其收缩力会自然下降。而高氧也可能对肌肉造成损伤，但其效应较难被察觉，因为大多数实验均在人工高氧条件下进行，以补偿肌肉缺乏正常血液供应的情况。在大多数系统中，只需将各 chamber 的氧气流量控制为恒定，即可实现各 chamber 氧气供应量的一致。
7. 调整所有通道的灵敏度，以确保在不使通道饱和的前提下获得最大的力分辨率。通道灵敏度可能因动物的功能与年龄、实验温度、基因操作、肌肉大小、小鼠品系以及实验人员能否正确分离出无损伤的肌肉而有显著差异。根据我们的经验，在测量比目鱼肌收缩力时，灵敏度范围为0.5至10 mV/cm，而在测量趾长伸肌时，灵敏度范围可达1至20 mV/cm。
8. 建立疲劳刺激方案的协议。在Chart4软件中可使用宏命令。编程新宏的方法如下：在Chart4软件中，点击开始测量，然后依次点击宏（Macro）、宏命令（Macro Command）、开始记录（start recording）、开始重复（begin repeat），选择所需的刺激频率，然后结束重复（end repeat）。对于平衡协议，每分钟重复一次刺激，持续30分钟；对于疲劳协议，每2秒重复一次刺激，持续5分钟。刺激周期性的这些变化直接影响占空比，而占空比也与刺激持续时间相关。可通过调整这些参数来测试收缩功能和疲劳性的不同方面。

2. 准备完整肌肉束

1. EDL 解剖：按照美国国立卫生研究院（NIH）指南和机构动物护理与使用委员会（IACUC）的动物实验规程处死小鼠。通过颈椎脱位法处死小鼠，然后将小鼠置于侧卧位。趾长伸肌（EDL）是一种快缩-糖酵解型肌肉，呈淡粉白色。在野生型 C57BL/6 小鼠中，其长度约为 10–13 mm，重量为 8–11 mg。EDL 的功能是伸展第 2 至第 5 趾，并在踝关节处使足背屈。该肌肉由腓神经支配。解剖 EDL 时，先做浅表皮肤切口，切开胫前肌与后群肌肉之间的筋膜，定位其起点（近端），即韧带连接于胫骨外侧髁以及腓骨前表面外侧 3/4 处（骨间缘）。使用精细眼科剪尽可能远离肌肉处切断韧带，此操作可释放 EDL 肌肉的近端起点。用钝头镊夹住韧带并缓慢牵拉，以游离 EDL 肌肉。在此过程中，可能需要剪开部分包绕 EDL 及周围其他肌肉的肌束膜，此步骤至关重要，因为在这一精细操作中 EDL 肌肉容易受损。接下来，转向止点区域，即四条远端肌腱插入第 2 至第 5 趾中节和远节指骨的位置。应尽可能远离肌肉处切断这些肌腱。
2. 将分离的 EDL 肌肉转移至含有等渗台氏液的解剖皿中。某些突变体、转基因和基因敲除动物模型的肌肉非常脆弱，在进行收缩力测量前，有必要使用无 Ca²⁺ 台氏液以防止 Ca²⁺ 诱导的肌肉损伤。接下来，使用手术结在 EDL 肌肉两端尽可能远离肌肉的位置牢固结扎。合适的结扎位置略高于韧带或肌腱纵向中点处。本步骤使用 6-0 规格缝合线，随后将 EDL 肌肉转移至 O₂ 饱和的组织浴槽室中，将其一端固定在力传感器的样品槽上，另一端固定在浴槽底部的固定钩上。对另一条腿重复上述过程。我们目前也开始采用一种新方法，即使用夹具而非缝合线固定肌肉。如果主要研究目标是分析动力学特性 和/或 获取肌肉功率，则建议尽可能缩短缝合线长度，或使用金属杆替代缝合线。
3. 比目鱼肌解剖：比目鱼肌主要为慢缩-氧化型肌肉，颜色呈深红色。其长度比 EDL 约短 1 mm，但重量略重于 EDL。该肌肉由胫神经支配，主要功能为足跖屈。解剖比目鱼肌时，从腿部后外侧进入，推开通常覆盖在其上方的腓肠肌，识别出呈深红色的比目鱼肌。在起点（近端），切断连接于胫骨后方近端半段沿比目鱼肌线以及腓骨后方近端 1/3 处的韧带；接着在止点（远端），切断插入跟骨后部的跟腱。小心地完全游离比目鱼肌，并参照 EDL 肌肉的方法将其正确安装于浴槽室中。

3. 测量分离的骨骼肌的收缩性

1. 将肌肉安装到独立的组织浴槽中后，开始记录。大多数类似系统允许对力记录的基线进行归零。此功能通常与放大器相关，在 PowerLab 系统的特定情况下，属于桥式放大器的功能。该操作有助于观察基线变化，并为所有肌肉收缩提供一个从零开始分析的便捷方式。随后使用方波脉冲刺激分离的肌肉，刺激参数可根据浴槽尺寸、铂金丝粗细、电极丝间距，甚至实验溶液的组成而广泛调整。我们采用的电流为 60 mA（我们注意到，超过 350 mA 的电流似乎对肌肉制备有害），刺激串长度为 350、500 和 1000 ms，具体取决于特定实验方案的目标。单个方波脉冲的持续时间应在 0.3–1 ms 范围内。
2. 下一步是选择一个能够产生完全融合性强直收缩的刺激频率（例如：约 100 Hz 可使 EDL 肌肉产生最大力，约 60 Hz 用于腓肠肌），同时缓慢而小心地拉伸肌肉，以确定这些肌肉的最适长度。在小心拉伸肌肉后，等待 30 秒，以 100 Hz 刺激；再等待 30 秒，再次拉伸，然后重复刺激，直到肌肉产生的力不再增加为止。
3. 这些肌肉经历了显著的环境变化。建议让肌肉适应新环境，我们方案中将此步骤称为“平衡”。在拉伸阶段所用的相同刺激频率下（100 Hz）对肌肉进行 20–30 分钟的平衡，直到至少连续 5 次强直收缩完全稳定（既不减小也不增大，基线稳定）。平衡期间刺激串的周期（100 Hz，持续 500 ms，单脉冲 1 ms）为 1 分钟，相当于 1.66% 的占空比，属于非疲劳性刺激。在此背景下，1.66% 的占空比意味着在总时间中，肌肉仅工作 1.66%，通过提高占空比可最终诱导肌肉疲劳。如果健康野生型小鼠的肌肉在此平衡期间表现出疲劳特征，则可能是在解剖过程中受损，或浴槽/肌肉中发生缺氧，或刺激电极中过度电解产生自由基所致。Westerblad 早前曾指出，大于 400 mA 的电流会诱导自由基的形成²³。显然，应使用最高品质的铂金材料，因为其他金属必然会导致自由基生成和肌肉毒性。
4. 通过以下刺激频率刺激肌肉以获得力-频率关系（FF）：1–140 Hz（以 5–10 Hz 为增量），在 25 °C 下进行实验时，刺激间隔为 30–60 秒。在 37 °C 下进行实验时，将 FF 扩展至更高频率：膈肌可达 300 Hz，腓肠肌为 180–200 Hz，EDL 肌肉为 220–250 Hz。接下来，确定产生最大强直力（T_max）和约一半最大强直力（1/2 T_max）的刺激频率；由于 EDL 和腓肠肌之间的内在差异，若仅使用一个刺激源，有时难以精确获得 1/2 T_max。一种可行的解决方案是确定一个产生 T_max 的 30–70% 的频率。选择这些刺激频率的理由是：T_max 提供了有关收缩装置事件/调节的重要信息，而 1/2 T_max 则更侧重于 Ca²⁺ 调节和兴奋-收缩耦联（ECC）过程的信息。为确认是否已达到最大力，可在刺激肌肉的同时向浴槽溶液中加入 10–20 mM 咖啡因。若已达到最大力，则在咖啡因存在下力不会进一步增加。FF 曲线在较高实验温度下向右偏移，且力值通常略高。使用该系统时，可根据需要执行其他任何刺激频率。快速糖酵解型 EDL 肌肉与慢速氧化型腓肠肌肌肉的不同收缩特征如 图 2 所示。
5. 平衡后，在 1/2 T_max 条件下对肌肉进行 5 分钟疲劳刺激，刺激间隔为 2 秒，占空比为 25%（图 3）。该特定疲劳方案被认为能更好地反映肌浆网 Ca²⁺ 释放对肌肉收缩能力的贡献³¹。
6. 在 1/2 T_max 条件下恢复肌肉 30 分钟，或直至力值稳定，恢复刺激间隔为 1 分钟。此时可进一步采用 T_max 刺激进行额外的疲劳方案，该方案被认为可反映收缩装置的状态³¹。另一种选择是延长疲劳方案，交替使用产生 T_max 和 1/2 T_max 的刺激串进行疲劳，并以相同类型的刺激恢复肌肉。
7. 重复第 3.4 步所述的 FF 测试；其原理在于，通过分析疲劳前后 FF 的变化，可观察到不同品系、疾病模型或药物处理之间的表型差异。例如，我们此前曾报道，疲劳后年轻野生型肌肉的 FF 向左偏移，而老年肌肉的 FF 则向右偏移，提示骨骼肌疲劳的调节作用随年龄变化而存在差异。
8. 为探究细胞外 Ca²⁺ 进入对肌肉收缩能力的贡献，可将浴槽溶液更换为不含 Ca²⁺ 但含 0.1 mM EGTA 的溶液（0 mM Ca²⁺ Tyrode 溶液）³²。或者，可在浴槽溶液中加入不同的储存操作通道阻断剂。例如：2-氨基乙基二苯基硼酸酯（2-APB）、SKF96365、3,5-双（三氟甲基）吡唑 2（BTP-2）和阿唑莫林等^33,34。咖啡因可用于检测雷诺丁受体功能，KCl 可用于评估这些制备物的整体去极化特性。其他药物也可用于研究 Na⁺、K⁺ 及 Na⁺-K⁺ 泵在疲劳期间对力的重要调节作用³⁵。这些药物大多分子量较小，似乎能快速扩散进入肌肉制备物，表现为即时效应。某一药物未产生效应，并不一定意味着该药物无效，有时需使用远高于单肌纤维实验剂量的浓度进行额外测试。
9. 该离体（ex vivo）系统的一个独特应用促成了近期在 tric-a^-/- 肌肉中发现机械交替现象^4,30。交替现象定义为在疲劳过程的力下降阶段出现的收缩力波动性爆发事件。在此类事件中，由于释放了更多的 Ca²⁺ 或收缩装置对 Ca²⁺ 的敏感性增强，收缩力可能暂时超过疲劳刺激期间的先前水平。收缩力的爆发必须比其先前水平高出 50%，且在 5 分钟疲劳刺激过程中至少出现 10 次。机械交替现象在野生型小鼠骨骼肌中并不常见，但在某些细胞内 Ca²⁺ 信号通路受扰动的突变肌肉中可见，例如三聚体内细胞阳离子通道 A 型（tric-a^-/-）肌肉⁴。机械交替可通过疲劳刺激、咖啡因和环吡唑酸（CPA）处理诱导产生，图 3 展示了此类机械交替的代表性记录。该现象的本质十分引人关注，因为一个正在疲劳的肌肉似乎能够短暂地产生更大的力。在我们此前的发表文章中，结合单细胞 Ca²⁺ 分析揭示，交替现象的出现是肌浆网 Ca²⁺ 超载和不稳定的体现。我们认为，对交替现象的深入理解可能有助于更好地认识 ECC 过程。
10. 实验结束后，使用校准的游标卡尺和分析天平测量各肌肉的长度和重量，将肌肉在液氮中速冻后保存于 -80 °C，以便后续进行生化分析。这些肌肉还可用于机械去膜以深入探究 ECC 过程，或化学去膜以在无 ECC 调节机制的情况下测定基本的收缩特性。
11. 记录的肌肉力（mV）首先根据校准结果转换为克力（g），然后使用以下公式归一化为生理横截面积（PCSA）：肌肉力（N/cm²）=（力（g）× 肌肉长度（cm）× 1.06）/（肌肉重量（g）× 0.00981）^5,36。或者，肌肉力也可根据各肌肉的总蛋白或总肌动蛋白含量进行归一化，通过 Bradford 蛋白测定法或考马斯亮蓝染色定量法测定。在某些肌肉质量因疾病、衰老或药物处理而严重受影响的条件下，基于肌肉质量、蛋白和/或肌动蛋白含量的力归一化可提供更稳定的读数。

4. 代表性结果

在低、中、高频率刺激下，趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌在常温下的典型收缩力如图2所示。5 Hz刺激诱导的EDL收缩仍表现为单个的抽搐，这是由于肌浆网钙泵（SERCA Ca²⁺ ATPase）作用迅速以及收缩装置本身对Ca²⁺的敏感性较低；而比目鱼肌在5 Hz刺激下收缩已开始融合（因其ATP酶活性较慢且收缩装置对Ca²⁺的敏感性较高），但其峰值力仍相互分离。在20 Hz刺激时，EDL的收缩呈部分融合状态，而比目鱼肌则已形成完全融合的强直收缩力。在产生T_max刺激的频率下（室温下EDL为80–110 Hz，比目鱼肌为60–90 Hz），EDL的强直收缩力上升迅速且舒张快速，与比目鱼肌的缓慢特性形成鲜明对比。图2B显示，EDL肌肉的力-频率曲线相较于比目鱼肌向右偏移，表明由于比目鱼肌含有慢型肌球蛋白和肌钙蛋白亚型，其在任一给定刺激频率下对Ca²⁺释放更为敏感。此外，在较低刺激频率下，比目鱼肌的收缩装置能产生相对更强的收缩力。图3展示了EDL（上图）和比目鱼肌（中图）的正常疲劳曲线。注意EDL肌肉在疲劳性刺激过程中收缩力下降更快，且在5分钟疲劳实验结束时力值降低更为显著。最后，图3（下图）展示了一种突变肌肉典型的机械交替现象，定义为肌肉疲劳过程中下降阶段出现的短暂性收缩力爆发。该收缩力爆发必须比前一次收缩力高出50%以上，并且在5分钟疲劳刺激过程中至少出现10次。

图1. 四通道示意图 离体 收缩系统 方波脉冲由计算机控制 Grass 刺激器产生。两个刺激隔离单元对来自电刺激单元的刺激信号进行过滤，以消除电信号中的任何波动，并建立稳定的方波信号。该过滤后的电信号被传送至4个浴槽室，每个浴槽室内含有围绕分离肌肉的铂丝电极。最终，跨两个电极的电流（称为场刺激）引发动作电位，从而诱导肌肉收缩。该收缩由特定的力传感器检测，信号经桥式放大器传输、滤波、平均（信号调理）后，通过 A/D 转换器由计算机软件记录。

图 2. EDL 和比目鱼肌的代表性收缩力。（A）由 5 Hz（上图）、20 Hz（中图）和最大强直收缩力（T_max，下图）诱导的收缩力；插图显示受损肌肉收缩力的一段记录；（B）一组代表性数据，显示 EDL 肌肉在收缩力-频率关系中的单次收缩（FF，上图）以及由此生成的曲线图（下图）。 点击此处查看高清大图。

图 3. 典型的疲劳曲线及机械交替现象。 EDL 肌肉典型的快速衰减型疲劳曲线（上图）和比目鱼肌的缓慢衰减型疲劳曲线（中图）。在钙离子（Ca²⁺）处理功能受损的 tric-a^-/- 肌肉中，疲劳刺激可导致机械交替现象的出现（下图）。

讨论

测量收缩力和疲劳性对于整体评估骨骼肌功能至关重要。本实验的主要目的是在某些病理条件下（如肌肉减少症和肌肉疲劳）识别肌肉力量及疲劳特性的变化，并检验药物/试剂对肌肉收缩功能的影响。由于肌肉收缩力与细胞内 Ca²⁺ 水平密切相关，因此可通过同步记录 Ca²⁺ 信号与机械收缩来深入探究其机制。²⁺ 释放，细胞外钙²⁺ 进入以及两者之间的串扰，我们还可以收集有关 Ca 的信息²⁺ 使用该方法检测骨骼肌中的信号状态。本文展示了一种独特表型，称为“机械交替”（mechanic alternans），即在疲劳过程中衰减阶段出现收缩力波动性爆发，且伴有过载且不稳定的肌浆网（SR）。可以预期，利用该方法能够检测多种骨骼肌表型，包括改变的收缩力、疲劳频率（FF）、疲劳性、收缩动力学特征以及疲劳后的恢复能力。 体外 不同病理条件下的收缩力检测

该实验最关键的步骤是分离出完整无损的整块肌肉（或肌束和肌条），避免任何损伤。这一目标在整肌制备中更容易实现。本文表明，在整块肌肉两端保留足够的韧带和肌腱用于固定，对于防止直接结扎...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-APB	Tocris	1224	多种Ca2+内流通道的阻断剂，包括SOC和TRP等。
SKF96365	Sigma	SKF-96365	多种Ca2+内流通道的阻断剂，包括SOC和受体介导的Ca2+内流等。
BTP-2	Millipore	203890-5MG	相对特异的SOC阻断剂
CPA	Sigma	C1530	可逆性SERCA阻断剂
咖啡因	Sigma	C0750	快速作用的RyR激动剂
Radnoti 四单元组织浴系统	Radnoti	159920
组合式组织支撑/刺激电极	Radnoti	160151	带组织支撑的垂直锯齿型电极
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		该产品已不再供应。请选择其他版本的数据采集系统。
力传感器（5 mg - 25 g）	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 是 Chart 软件的最新版本。
S8800 双脉冲数字刺激器	GRASS TECHNOLOGIES		该产品已不再供应。S88X 双输出方波脉冲刺激器为更新型号的刺激器。
RF 变压器隔离单元	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5