我们描述了建立 体外 包含卵巢成纤维细胞与正常卵巢表面上皮细胞或卵巢癌上皮细胞的异质性三维模型。我们探讨了利用这些模型研究卵巢癌发展过程中发生的间质-上皮相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
上皮性卵巢癌（EOC）是西方社会中导致妇科恶性肿瘤死亡的首要原因。尽管外科治疗不断进步，基于铂类的化疗方案也有所改善，但过去四十多年中，EOC的生存率几乎没有提高1,2。虽然I期肿瘤的5年生存率>85%，但III/IV期疾病的生存率却<40%。因此，若能在更早期、更具可治疗性的阶段发现肿瘤，EOC的高死亡率将可显著降低3-5。目前，早期疾病发展的分子遗传学和生物学基础仍知之甚少。更具体而言，关于肿瘤起始过程中微环境的作用了解甚少；但EOC的已知风险因素（例如年龄和生育史）提示微环境在EOC的早期发生中起着关键作用。因此，我们建立了正常卵巢和早期卵巢癌的三维异质性模型。对于正常卵巢模型，我们将经逆转录病毒转导人端粒酶全酶催化亚基（hTERT）而永生化的正常卵巢表面上皮细胞（IOSE）与正常间质成纤维细胞（INOF） 进行共培养，以延长这些细胞在体外的生命周期。为了模拟卵巢上皮细胞转化的最早阶段，在IOSE细胞中过表达CMYC癌基因，并再次与INOF细胞共培养。这些异质性模型被用于研究衰老和细胞衰老对上皮细胞转化和侵袭的影响。本文描述了构建这些三维模型的方法学步骤；这些方法不仅适用于正常卵巢和卵巢癌组织的建模，也可用于研究其他依赖间质细胞与上皮细胞相互作用来维持组织稳态及疾病发展的组织类型。
方案
图1 展示了下文所述工作流程的概览。
1. 正常卵巢成纤维细胞的分离与扩增 体外 通过过表达催化亚基延长寿命 hTERT 全酶
- 卵巢组织可在获得患者知情同意并经机构审查委员会批准（针对美国机构）后采集。正常卵巢组织可在全腹腔子宫切除术或腹腔镜全子宫切除术联合双侧输卵管卵巢切除术后获取。本研究中，组织经病理学家检查，并取部分卵巢间质进行活检以用于细胞培养。组织样本大小约为2-5 mm2 从卵巢中心区域采集样本，以尽量减少同时采集到卵巢上皮组织的可能性。
- 将新鲜的卵巢组织置于添加了额外抗生素和抗真菌剂的永生化正常卵巢成纤维细胞（INOF）生长培养基中，运送至细胞培养实验室。INOF生长培养基（INOF-GM）的成分为：Medium 199与MCDB105按1:1比例混合，添加15%胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺， 50 μg/ml 庆大霉素和250 ng/ml 两性霉素B。
- 在生物安全柜内操作：用 5 ml PBS 清洗样本，去除仍松散附着在组织上的上皮细胞。吸除液体，重复此步骤两次。
- 将样本连同 PBS 转移至一个洁净的 10 cm 直径（P100）培养皿中。使用无菌镊子操作组织，将其放入第二个洁净的无菌 P100 培养皿（干燥）中。使用无菌手术刀将组织切成 0.5 cm 大小2 ....
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讨论
早期上皮性卵巢癌（EOC）的生物学特性尚不明确。多年来，该领域的主要障碍之一可能是对疾病组织特异性起源以及微环境在EOC发生中作用的重要性的认识不足。近年来，人们逐渐认识到EOC是一种具有多种不同组织病理学亚型的异质性疾病，不同亚型可能起源于不同的细胞来源。例如，现有数据表明，高级别浆液性EOC可能起源于输卵管分泌性上皮细胞和卵巢表面上皮细胞；至少部分子宫内膜样和透明细胞EOC被认为起源于卵巢子宫内膜异位症（子宫内膜异位囊肿）；而黏液性EOC可能起源于卵巢旁或输卵管旁的移行型上皮15,16。然而，针对这些组织学亚型中的任何一种，目前可用于研究疾病进展的体外和体内模型都非常有限。体外构建EOC异质性模型以研究肿瘤间质-上皮相互作用及其相关卵巢癌发展过程中的微环境，更是尚处于初步探索阶段的研究领域。肿瘤间质可能不仅是肿瘤生物标志物的来源，也是潜在的新型治疗靶点。因此，建立并应用EOC异质性模型，可能对于识别与早期疾病相关的新型生物标志物至关重要，这些标志物可被用于筛查和早期诊断项目；同时也可能有助于发现新的可靶向治疗靶点，从而改善EOC患者的治疗方案。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究在美国加利福尼亚大学凯克医学院和英国伦敦大学学院进行。KL 获得美国国立卫生研究院资助项目 5 U19 CA148112-02 的支持。BG 获得英国伊芙基金会（Eve Appeal）妇科肿瘤慈善项目资助。在伦敦大学学院医院/伦敦大学学院（UCLH/UCL）开展的部分工作获得了英国卫生部国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心资助计划的部分资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚羟基乙酸，适用于细胞培养 | Sigma Aldrich | P3932 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma Aldrich | E7023 | |
| 细胞培养用无菌水 | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | SH30088.03 | |
| 庆大霉素 | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 两性霉素 B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| 细胞筛（40 或 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 | |
| 抗成纤维细胞表面蛋白抗体，克隆 1B10 | Sigma | F4771 | |
| 广谱细胞角蛋白抗体（C11） | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene（六亚甲基溴化铵） | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG 端粒酶 PCR ELISAPLUS | 罗氏 | 12013789001 | |
| TeloTAGGG 端粒长度检测 | 罗氏 | 12209136001 | |
表1. 本研究中提及的试剂与设备 |
参考文献
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L.
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