我们描述了建立 体外 包含卵巢成纤维细胞与正常卵巢表面上皮细胞或卵巢癌上皮细胞的异质性三维模型。我们探讨了利用这些模型研究卵巢癌发展过程中发生的间质-上皮相互作用。
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摘要
摘要
上皮性卵巢癌（EOC）是西方社会中导致妇科恶性肿瘤死亡的首要原因。尽管外科治疗不断进步，基于铂类的化疗方案也有所改善，但过去四十多年中，EOC的生存率几乎没有提高1,2。虽然I期肿瘤的5年生存率>85%，但III/IV期疾病的生存率却<40%。因此，若能在更早期、更具可治疗性的阶段发现肿瘤，EOC的高死亡率将可显著降低3-5。目前，早期疾病发展的分子遗传学和生物学基础仍知之甚少。更具体而言，关于肿瘤起始过程中微环境的作用了解甚少；但EOC的已知风险因素（例如年龄和生育史）提示微环境在EOC的早期发生中起着关键作用。因此，我们建立了正常卵巢和早期卵巢癌的三维异质性模型。对于正常卵巢模型，我们将经逆转录病毒转导人端粒酶全酶催化亚基（hTERT）而永生化的正常卵巢表面上皮细胞（IOSE）与正常间质成纤维细胞（INOF） 进行共培养，以延长这些细胞在体外的生命周期。为了模拟卵巢上皮细胞转化的最早阶段，在IOSE细胞中过表达CMYC癌基因，并再次与INOF细胞共培养。这些异质性模型被用于研究衰老和细胞衰老对上皮细胞转化和侵袭的影响。本文描述了构建这些三维模型的方法学步骤；这些方法不仅适用于正常卵巢和卵巢癌组织的建模，也可用于研究其他依赖间质细胞与上皮细胞相互作用来维持组织稳态及疾病发展的组织类型。
方案
图1 展示了下文所述工作流程的概览。
1. 正常卵巢成纤维细胞的分离与扩增 体外 通过过表达催化亚基延长寿命 hTERT 全酶
- 卵巢组织可在获得患者知情同意并经机构审查委员会批准（针对美国机构）后采集。正常卵巢组织可在全腹腔子宫切除术或腹腔镜全子宫切除术联合双侧输卵管卵巢切除术后获取。本研究中，组织经病理学家检查，并取部分卵巢间质进行活检以用于细胞培养。组织样本大小约为2-5 mm2 从卵巢中心区域采集样本，以尽量减少同时采集到卵巢上皮组织的可能性。
- 将新鲜的卵巢组织置于添加了额外抗生素和抗真菌剂的永生化正常卵巢成纤维细胞（INOF）生长培养基中，运送至细胞培养实验室。INOF生长培养基（INOF-GM）的成分为：Medium 199与MCDB105按1:1比例混合，添加15%胎牛血清和2 mM L-谷氨酰胺， 50 μg/ml 庆大霉素和250 ng/ml 两性霉素B。
- 在生物安全柜内操作：用 5 ml PBS 清洗样本，去除仍松散附着在组织上的上皮细胞。吸除液体，重复此步骤两次。
- 将样本连同 PBS 转移至一个洁净的 10 cm 直径（P100）培养皿中。使用无菌镊子操作组织，将其放入第二个洁净的无菌 P100 培养皿（干燥）中。使用无菌手术刀将组织切成 0.5 cm 大小2 组织块。将每块组织放入一个独立的 P100 培养皿中，并进一步切割成小块 <1 mm2 大小。加入20 ml INOF-GM（含抗生素和抗真菌剂），并在 37 °C，5% CO₂2使用相差显微镜监测细胞生长。细胞可在24小时内贴附于培养皿上。
- 一周后换液，通过吸除去除任何非贴壁组织。此后，每周换液两次。细胞将形成克隆，通常在1–3周内出现。当这些克隆生长至足够大可进行传代时（即达到约 500 μm)，使用胰蛋白酶包被的克隆环分离克隆。
通过将细胞系样品接种于玻璃盖玻片上，并对成纤维细胞标志物（FSP）、上皮细胞标志物（pan-cytokeratin）和内皮细胞标志物（von Willenbrand Factor VIII）进行免疫荧光染色，确认细胞为100%成纤维细胞且无其他细胞污染。 - 将原代正常卵巢成纤维细胞（NOF）从一个P100培养皿传代至3个P100培养皿，于逆转录病毒转导前一天进行 hTERT预制成的病毒上清液可直接购买，或通过标准共转染HEK293T细胞的方法在实验室自行制备（参见 www.stanford.edu/group/nolan/).
使用 pBABE-hygro-hTERT 载体（Addgene）可制备逆转录病毒上清液。将正常成纤维细胞（NOFs）从培养箱中取出，吸除细胞培养基。每皿加入 3 ml 病毒上清液：一皿加入 hTERT 逆转录病毒，另一皿加入对照病毒nd 第一皿加入GFP逆转录病毒，第三皿不加病毒。用含有polybrene的INOF-GM覆盖病毒上清，使其终浓度为 8 μg/ml次日用新鲜培养基更换培养液。感染后两天，开始使用低剂量（10 U/ml）潮霉素B进行筛选。七天后可将剂量增至20 U/ml；筛选应在10至14天内完成。 - 表达 hTERT 或 GFP 的克隆可通过环状克隆法在细胞生长至约 500 μm细胞系需要进一步的鉴定以确认目的基因或蛋白的成功表达 hTERT 以及原代细胞系特征的维持。包括：(a) 通过PCR-ELISA检测端粒酶活性，并通过Southern印迹法或PCR检测端粒长度 6,7；（b）验证关键标志物的表达例如 使用抗全角蛋白抗体对上皮细胞进行免疫染色，以及使用抗成纤维细胞表面蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫染色）在原代和 hTERT-永生化细胞；(c) 确认细胞不表现出肿瘤性转化特性（例如使用锚定非依赖性生长实验）；(d) 确认延长的 体外 表达该基因的细胞中观察到的寿命 hTERT 但不包括GFP。 hTERT表达永生化正常卵巢成纤维细胞（INOFs）应绕过复制性衰老，但不发生新生物性转化；此外，INOF细胞应维持成纤维细胞表面蛋白的表达，而不表达上皮标志物如细胞角蛋白（cytokeratin）图2).
2. 使用聚HEMA包被组织培养皿以进行非贴壁细胞培养
- 配制聚羟基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）溶液时，称取 1.5 g polyHEMA，放入无菌瓶中。加入 95 ml 分子生物学级无水乙醇和 5 ml 细胞培养级蒸馏水。polyHEMA 水凝胶将溶解于溶液中的水相成分，而乙醇可对制剂起到灭菌作用。
- 将 polyHEMA 溶液置于 65 °C 水浴中，直至完全溶解，可能需要长达 8 小时。请注意，polyHEMA 溶液不能长期保存，应现用现配。
故障排除：polyHEMA 溶液在 65 °C 下需要长时间孵育。应定期倒置混匀溶液。若在玻璃瓶底部观察到黏稠物，表明 polyHEMA 尚未完全溶解，需继续在 65 °C 下孵育。 - 在超净工作台内，用 polyHEMA 溶液包被组织培养皿。任何规格的组织培养皿、培养瓶或多孔板均可进行 polyHEMA 包被。每种容器所需的推荐 polyHEMA 溶液体积见表 2。
- 将细胞培养皿置于超净工作台内自然干燥，可能需要 2–3 天。对于较大尺寸的培养皿或培养瓶，可在摇床上轻轻摇动，以确保包被均匀。若 polyHEMA 溶液干燥过快，表面可能不平整。为避免此问题，干燥过程中应始终保持培养皿或培养瓶的盖子盖紧。
- 进行第二次 polyHEMA 包被，并按上述方法干燥。
故障排除：polyHEMA 包被层中可能出现孔洞，尤其在板过快干燥时。对板进行双层包被有助于在使用前覆盖包被层中的缝隙或裂纹。每层 polyHEMA 包被通常需要 2–3 天干燥，因此应在细胞培养使用前至少一周开始制备。 - polyHEMA 包被的培养板可在室温下保存，直至使用。
注意：1% 琼脂糖溶液用 1X PBS 溶解后经高压灭菌，也可用于包被细胞培养皿，以制备短期三维培养（少于一周）所需的非黏附表面。多孔板经琼脂糖包被后可形成凹形表面，有助于多种细胞系在每孔中形成单个球状体。然而，对于较长时间的三维培养，建议使用聚HEMA包被，因为琼脂糖包被在长期培养后常发生解体。
3. 生成三维（3D）异质类球体及3D培养物的换液
- 复苏并扩增内皮细胞和上皮细胞培养物 体外 以准备足够数量的细胞用于建立三维异质类球体。对于“大规模培养”，我们通常接种 2-4x106 每 P100 培养皿的 INOFs 数量为 0.5–1×106 上皮细胞，以获得4:1的间质:上皮比例。INOF细胞在不含庆大霉素和两性霉素B的INOF生长培养基（INOF-GM）中培养。如需要，成纤维细胞在进行三维培养前可进行预处理（例如 为诱导细胞衰老，可用亚致死剂量的过氧化氢处理细胞。
- 用 5 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一块干燥的聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）培养板，持续 5 分钟。吸除 PBS，加入 15 ml INOF-GM。
- 同时，用胰蛋白酶消化永生化正常卵巢成纤维细胞，使其从培养皿上脱落，3-5 分钟后加入等体积培养基中和胰蛋白酶，随后在 450 × g 离心 5 分钟以收集细胞。
- 弃去上清液。加入5 ml INOF-GM重悬细胞沉淀，通过反复吹打或轻轻涡旋振荡制备单细胞悬液，充分混匀。通过混匀后取样测定细胞浓度 10 μl 细胞悬液和 10 μl 台盼蓝染色并使用血细胞计数板进行计数。台盼蓝排斥法可用于鉴定活细胞。
- 加入 4x106 将INOF细胞加入已接种于聚HEMA包被板中的培养基中。使用适量的新鲜INOF-GM补足培养基体积至20 ml，并在 37 °C，5% CO₂2细胞在24小时内开始聚集形成多细胞球体。可通过相差显微镜观察球体的形成过程。
在大规模培养条件下，准确计数球状体数量较为困难，但我们估计在接种 4x10⁵ 个细胞时可获得 50–100 个球状体。6 基质细胞被接种。类球体的大小通常在80-250 μm. - 每2-3天更换一次类球体培养液：将培养板置于超净台内放置的移液管上，使其倾斜静置，让类球体充分沉降，此过程可能需要长达20分钟。随后用5 ml移液管小心吸除废液，保留约4 ml培养基，注意避免吸走类球体。加入16 ml新鲜INOF-GM培养基，重新放回培养箱中继续培养。
- 第7天，将上皮细胞加入成纤维细胞球体中，以建立异质共培养体系，具体步骤如下。通过胰蛋白酶消化法（如3.4–3.5节所述）制备卵巢上皮细胞（表型正常或已转化）悬液。使用血细胞计数板测定细胞浓度。用INOF-GM洗涤一次，以避免上皮细胞生长培养基中的任何生长因子被带入后续体系。
在本实验室中，通过经患者知情同意，收集因全腹式子宫切除术或全腹腔镜下子宫切除术联合双侧输卵管卵巢切除术而切除的卵巢组织，获取正常的卵巢表面上皮细胞（OSEC）系。使用无菌细胞刷刷取卵巢表面以收集上皮细胞。建立原代细胞系后，进行转导处理 hTERT 采用上述方法。有关OSEC在二维、三维条件下的培养以及OSEC永生化的详细步骤可参见文献10和11。 - 为形成异质类球体，首先单独对成纤维细胞类球体培养物进行换液培养。随后将1×10⁶个肿瘤细胞接种至成纤维细胞类球体培养物中。6 成纤维细胞与上皮细胞以4:1的比例混合，将异质性球体培养于INOF-GM培养基中。
- 每2-3天更换一次培养基，继续共培养异型细胞14天。
4. 成像与分子分析的处理
- 可采用多种不同技术对异质性类球体进行分析。进行成像时，建议使用 25 ml 移液管从培养皿中收获类球体。缓慢移液可最大程度减少剪切力对类球体结构的破坏。随后可用 PBS 清洗类球体，并在 100 × g 条件下轻柔离心 10 分钟进行沉淀；较高的离心力可能损伤类球体。或者，也可将培养物转移至 50 ml 离心管中静置沉降，然后移除生长培养基。
- 对于免疫组织化学分析，使用中性缓冲福尔马林在室温下固定类球体 30 分钟。将类球体离心沉淀后，用 70% 乙醇替换福尔马林。采用与人类组织相同的标准流程将其处理并包埋于石蜡中。石蜡包埋的类球体可切片，并使用苏木精-伊红染色或标准免疫组织化学方法对特定分子标志物进行染色（图 3）。
- 或者，将 PBS 清洗后的类球体用 4% 多聚甲醛（溶于 PBS 中）固定，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并迅速冷冻以进行冰冻切片和免疫荧光染色。
- 对于分子分析，可收获类球体，离心沉淀并在 PBS 中洗涤两次，随后裂解细胞以提取 DNA、RNA 或蛋白质。
- 对于流式细胞术分析，可将类球体用 PBS 清洗，并在 37 °C 条件下通过胰蛋白酶或 Accutase 消化将其解离。操作时，将含有类球体的 Falcon 管浸入水浴中以促进胰蛋白酶消化。使用 1 ml 移液枪头反复吹打溶液可促进类球体完全解离为单细胞悬液。注意避免过度消化细胞。
用等体积的培养基中和反应，并将细胞悬液通过40-70 μm细胞筛以去除细胞团块。离心收集细胞，用PBS洗涤，计数后将所需数量的细胞重悬于FACS缓冲液中。根据生产商说明书对细胞进行染色。
5. 代表性结果
该方法可广泛应用于多种研究领域，既可用于正常卵巢生物学的研究，也可用于卵巢癌起始过程的研究。与使用商业化细胞外基质凝胶构建的三维培养体系相比，该方法的一个主要优势在于，正常卵巢成纤维细胞能够产生构成类球体核心的细胞外基质。根据我们的经验，由正常卵巢成纤维细胞所产生的基质成分具有异质性，且比任何商业化基质凝胶更接近卵巢组织天然的细胞外基质。在本实验室中，我们已使用部分转化的上皮细胞 体外 使用明确的遗传元件（例如 CMYC 过表达）并将这些细胞与正常及衰老的卵巢成纤维细胞共培养，以模拟绝经后卵巢中早期卵巢癌的微环境。我们的数据表明，衰老的微环境可促进肿瘤样特征（例如 增殖）部分转化的上皮细胞（图3），而正常的微环境则抑制肿瘤发生发展 8我们的实验室及其他研究团队也采用过类似方法来构建正常卵巢上皮细胞模型 9，输卵管上皮细胞，肿瘤发生进展的逐步模型10以及卵巢癌和子宫内膜癌细胞系 11-13 作为同型类球体培养物。我们观察到，当细胞以单层形式培养时，正常细胞和恶性细胞的某些组织学特征无法被检测到，而当细胞转为类球体培养时，这些组织学特征得以恢复。例如，在透明细胞卵巢癌细胞系的三维培养中，可以检测到透明细胞卵巢癌的组织学特征（图4，但在相同细胞的单层培养中则不表现出此特性。此外，与传统二维单层培养的相同细胞相比，三维培养的细胞更能准确反映原代组织中组织特异性的蛋白质表达模式。 9-11这些用于构建正常及恶性卵巢组织模型的方法，也为发现和功能分析新的候选卵巢癌肿瘤抑制基因、癌基因以及其他可能与疾病发生相关的分子生物标志物提供了有价值的工具。 10,14.
图1. 三维异质共培养方案的示意图。 组织培养烧瓶使用1%聚羟基乙基甲基丙烯酸酯（polyHEMA）溶液包被两次，并静置干燥。使用前，将包被有polyHEMA的塑料表面用1×PBS洗涤。将永生化正常卵巢成纤维细胞（4×106个细胞）以20 ml生长培养基接种至烧瓶中。连续培养7天，观察类球体的形成与生长情况。随后，向成纤维细胞类球体培养物中接种1×106个上皮细胞，两种细胞类型共同培养14天，之后收获多细胞类球体并进行后续应用（分子分析、成像等）。
图2. hTERT 永生化正常卵巢成纤维细胞的免疫荧光染色。 原代正常卵巢成纤维细胞（Pr NOFs）和永生化正常卵巢成纤维细胞（INOFs）均表达成纤维细胞特异性蛋白（FSP），不表达细胞角蛋白-7（Ck-7），并表达波形蛋白（VIM）。目标标记物显示为绿色，DNA经DAPI染色显示为蓝色，细胞质经伊文思蓝复染显示为红色。
图3. 间质细胞与上皮细胞共培养的免疫组织化学检测。 左图：正常卵巢成纤维细胞球体单培养，经苏木精和伊红染色。正常卵巢成纤维细胞在三维培养条件下单独培养时，形成由梭形细胞和丰富细胞外基质构成的球体。右图：正常卵巢成纤维细胞经过氧化氢处理以诱导衰老。部分转化的卵巢上皮细胞（IOSEcmyc向7天大的衰老成纤维细胞球体中加入细胞。经过额外14天的共培养后，将球体固定、石蜡包埋、切片，并进行双重染色，分别标记增殖标志物（MIB1，粉红色）和用于区分两种细胞类型的上皮标志物（广谱细胞角蛋白，棕褐色）。以伊红作为复染剂，球体核心未染色的成纤维细胞清晰可见（星号标记）。下图：双染共培养体系中上皮细胞增殖的定量分析。本研究使用了来自三位不同患者的永生化卵巢表面上皮（IOSE）细胞系（IOSE4、IOSE11 和 IOSE19）。衰老成纤维细胞（SEN）促进共培养的IOSE细胞增殖cmyc 细胞在衰老诱导后（衰老期，SN）显著多于衰老诱导前的相同细胞（前衰老期，PSN）。未进行衰老诱导的亲本IOSE细胞 CMYC 过表达在与PSN或SEN成纤维细胞共培养时，增殖无显著差异。这些数据表明，在我们的实验条件下 体外 共培养模型，卵巢间质中的衰老过程可能促进卵巢癌的发展 11*P≤0.05，双尾配对T检验。
图4. 三维培养细胞的组织学特征反映原发组织特征。(A) 透明细胞型卵巢癌显示出典型的透明细胞结构，当透明细胞型上皮性卵巢癌（EOC）细胞系在塑料培养皿上生长时，这些结构消失；但当相同细胞以三维球体形式培养时，可观察到类似结构（B）。(C) 正常卵巢上皮细胞在球体培养14天后的扫描电子显微照片。表面微绒毛可见（箭头）。(D) 浆液性卵巢癌细胞系球体，处于培养状态。(A,B) 对石蜡包埋肿瘤组织或三维球体切片进行苏木精和伊红染色；(C) 扫描电子显微镜；(D) 相差显微镜。球体可呈圆形（虚线圆）或不规则形状，如图像左侧所示结构。
| 培养皿/板规格 | 聚HEMA体积（需涂布两次） | 培养基终体积 |
| 6孔板 | 3 ml | 5-7 ml |
| 12孔板 | 1.5 ml | 2 ml |
| 24孔板 | 500 μl | 1.5 ml |
| 48孔板 | 250 μl | 500 μl |
| 96孔板 | 50 μl | 200 μl |
| P100培养皿 | 4-5 ml | 20 ml |
| P60培养皿 | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25培养瓶 | 2-3 ml | 7 ml |
| F75培养瓶 | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175培养瓶 | 15 ml | 30-50 ml |
表2. 聚HEMA包被和3D培养的推荐体积。
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讨论
早期上皮性卵巢癌（EOC）的生物学特性尚不明确。多年来，该领域的主要障碍之一可能是对疾病组织特异性起源以及微环境在EOC发生中作用的重要性的认识不足。近年来，人们逐渐认识到EOC是一种具有多种不同组织病理学亚型的异质性疾病，不同亚型可能起源于不同的细胞来源。例如，现有数据表明，高级别浆液性EOC可能起源于输卵管分泌性上皮细胞和卵巢表面上皮细胞；至少部分子宫内膜样和透明细胞EOC被认为起源于卵巢子宫内膜异位症（子宫内膜异位囊肿）；而黏液性EOC可能起源于卵巢旁或输卵管旁的移行型上皮15,16。然而，针对这些组织学亚型中的任何一种，目前可用于研究疾病进展的体外和体内模型都非常有限。体外构建EOC异质性模型以研究肿瘤间质-上皮相互作用及其相关卵巢癌发展过程中的微环境，更是尚处于初步探索阶段的研究领域。肿瘤间质可能不仅是肿瘤生物标志物的来源，也是潜在的新型治疗靶点。因此，建立并应用EOC异质性模型，可能对于识别与早期疾病相关的新型生物标志物至关重要，这些标志物可被用于筛查和早期诊断项目；同时也可能有助于发现新的可靶向治疗靶点，从而改善EOC患者的治疗方案。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究在美国加利福尼亚大学凯克医学院和英国伦敦大学学院进行。KL 获得美国国立卫生研究院资助项目 5 U19 CA148112-02 的支持。BG 获得英国伊芙基金会（Eve Appeal）妇科肿瘤慈善项目资助。在伦敦大学学院医院/伦敦大学学院（UCLH/UCL）开展的部分工作获得了英国卫生部国家健康研究所（NIHR）生物医学研究中心资助计划的部分资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚羟基乙酸，适用于细胞培养 | Sigma Aldrich | P3932 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma Aldrich | E7023 | |
| 细胞培养用无菌水 | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone 胎牛血清 | 赛默飞世尔科技 | SH30088.03 | |
| 庆大霉素 | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 两性霉素 B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| 细胞筛（40 或 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 | |
| 抗成纤维细胞表面蛋白抗体，克隆 1B10 | Sigma | F4771 | |
| 广谱细胞角蛋白抗体（C11） | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene（六亚甲基溴化铵） | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG 端粒酶 PCR ELISAPLUS | 罗氏 | 12013789001 | |
| TeloTAGGG 端粒长度检测 | 罗氏 | 12209136001 | |
表1. 本研究中提及的试剂与设备 |
参考文献
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