一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射saRNA治疗的评价

摘要

建立原位膀胱肿瘤模型，以评估经膀胱内递送的saRNA的抗肿瘤效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。

摘要

我们介绍一种在原位异种移植小鼠膀胱肿瘤模型中通过膀胱内给药小激活RNA（saRNA）治疗膀胱癌的新方法。该小鼠模型通过在吸入全身麻醉下经尿道插管建立。随后使用膀胱内灌注硝酸银溶液对膀胱黏膜造成化学灼伤，以破坏膀胱糖胺聚糖层，促进细胞黏附。经无菌水多次冲洗后，将人膀胱癌KU-7-luc2-GFP细胞通过导管注入膀胱内，留置2小时。随后通过 体内 膀胱超声与生物发光成像。随后通过膀胱内灌注方式给予装载于脂质纳米颗粒（LNPs）中的saRNA进行治疗。肿瘤生长情况通过超声和生物发光进行监测。本视频中展示了该操作流程的全部步骤。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 细胞制备

1. 人膀胱癌细胞系 KU-7-luc2-GFP（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）在添加了10%胎牛血清和50 μg/ml 庆大霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。
2. 细胞培养条件为 37 °C、5% CO₂，每两到三天更换一次培养基。
3. 通过胰蛋白酶消化收集细胞，并使用血细胞计数板进行计数。将 2 × 10⁶ 个细胞重悬于 50 μl 磷酸盐缓冲液中，制成单细胞悬液，并置于冰上保存。

2. 原位膀胱肿瘤模型

1. 使用8-10周龄的雌性裸鼠（nu/nu）（Simonsen Laboratory，Gilory，CA）。
2. 在加热垫上覆盖无菌手术巾作为手术平台。准备无菌润滑胶、带针芯的24号导管、硝酸银溶液和无菌水。
3. 通过吸入异氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1-2%）对小鼠实施全身麻醉，并通过鼻罩持续维持麻醉。将无菌眼膏涂抹于动物眼部，并使用加热垫维持体温。
4. 将小鼠置于仰卧位。
5. 用镊子轻轻夹住动物的外阴部以固定。
6. 使用已移除针芯的24号静脉导管插入小鼠尿道。应充分使用润滑剂。小鼠仰卧时，尿道位于阴唇皱襞后方、阴道前方。初始插入角度为45度，以便进入尿道并穿过耻骨下缘；随后改为较平缓的角度，继续推进进入膀胱。轻柔地施加骨盆压力以拉直尿道常有助于插管。操作时需注意避免在遇到阻力时过度推进，以防造成尿道或膀胱穿孔。当导管内观察到尿液时，可确认导管已位于膀胱腔内。
7. 使用针芯从导管及膀胱腔内抽吸尿液。后续所有抽吸和注射操作均使用同一针芯，保留导管在原位。此方法可通过消除导管内部的死腔来确保注入体积的准确性，并避免重复插管。
8. 为破坏膀胱尿路上皮的糖胺聚糖层，注入10 μL 0.5 M硝酸银溶液，并保留10秒。该溶液可能与残留尿液形成白色沉淀。
9. 使用针芯抽吸并弃去沉淀物及膀胱内容物。
10. 注入100 μL无菌水冲洗膀胱，随后抽吸并弃去冲洗液。重复此无菌水冲洗共3次，总计完成4次冲洗。
11. 在尿道口周围结扎一道4-0丝线，以闭塞尿道，为拔除导管做准备。
12. 使用针芯注入预先配制的50 μL含2 × 10⁶ KU-7-luc2-GFP细胞的悬液。
13. 同时拔出导管和针芯，使尿道保持被丝线闭塞状态。
14. 小鼠将在全身麻醉下维持2小时，之后移除丝线并让动物苏醒。

3. 超声

1. 使用异氟烷蒸汽诱导全身麻醉，并通过鼻罩维持麻醉状态。
2. 采用 VisualSonics Vevo 770 In Vivo 高分辨率微成像系统（VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Canada），配备 RMV-704 40 MHz 探头。
3. 将小鼠仰卧位固定于超声平台。
4. 用胶带固定动物的后肢，以避免操作超声探头过程中产生过多移动。
5. 在小鼠骨盆区域涂抹超声耦合凝胶。
6. 将 RMV-704（40 MHz）超声探头置于小鼠骨盆部位，获取横断面或纵切面图像。
7. 若发现肿瘤，可保存图像用于测量肿瘤尺寸。

4. 生物发光成像

1. 腹腔注射 200 μL（150 mg/kg）荧光素底物。
2. 使用气化异氟烷诱导全身麻醉，并通过鼻罩维持麻醉状态。
3. 将小鼠仰卧放置于生物发光成像仪中。
4. 在注射荧光素后 5 分钟，以每秒光子数为单位测量动物的生物发光信号。

5. saRNA 制备

1. 以 50-100 μmol 的规模合成 RNA 寡核苷酸。
2. 将互补的单链寡核苷酸退火形成双链 saRNA。
3. 采用之前所述的自发囊泡形成制剂方法¹，使用可电离脂质 1,2-二油酰基-4-(2-二甲氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环（DLinKC2-DMA）、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、胆固醇和 PEG–DMG 制备脂质纳米颗粒（LNP）-saRNA。

6. 膀胱内灌注给药配方化的saRNA

1. 建立原位膀胱肿瘤模型后，小鼠通过膀胱内灌注方式接受脂质纳米颗粒（LNP）配制的小激活RNA（saRNA）治疗（表1）。
2. 使用气化异氟烷建立并维持全身麻醉，并涂抹无菌眼用润滑剂。
3. 将动物置于仰卧位。
4. 按先前所述方法进行尿道插管。
5. 在尿道和导管周围放置一根4-0丝线结扎线。
6. 使用空注射器和芯针抽吸导管及膀胱内的全部尿液。
7. 膀胱内注射LNP-saRNA，总体积为50 μL（3 mg/kg）。同时移除导管和芯针，保留丝线结扎以闭塞尿道。
8. 小鼠将在尿道闭塞状态下持续麻醉2小时。
9. 膀胱内注射LNP-saRNA治疗于肿瘤植入后第4天开始，每隔3天连续给药，共进行14次治疗。

7. 代表性结果

源自 KU-7-luc2-GFP 细胞的膀胱肿瘤可通过荧光素酶生物发光成像（图 1A 和 C）和膀胱超声（图 1B 和 D）进行监测。肿瘤通常在细胞接种后 3–5 天内即可被检测到。我们发现，超过 90% 的小鼠成功建立了膀胱肿瘤模型。随着膀胱内给予双链 RNA（dsRNA）治疗的进行，可利用上述方法监测肿瘤的进展。动物处死后，还可通过 GFP 荧光确认肿瘤生长情况。总体而言，膀胱肿瘤的平均生物发光信号与平均超声测量尺寸呈良好相关性，如 图 1C 和 1D 所示。然而，在动物处死后通过 GFP 确认肿瘤存在的情况下，我们发现生物发光信号与存活肿瘤的存在相关性优于超声测量结果。这一差异在接受 saRNA 治疗的小鼠（相对于对照组）中尤为明显，因为治疗后小鼠体内的残余瘢痕组织常可在超声中被观察到，但无法与存活肿瘤区分开来。

图1. 膀胱肿瘤的生长动力学。（A）生物发光成像通过检测膀胱肿瘤内荧光素酶活性，以确认肿瘤的位置和生长情况。（B） 在体 使用40 MHz探头进行膀胱超声成像可获得可准确测量尺寸的肿瘤图像。（C）显示肿瘤生物发光信号及超声测量尺寸逐步增加的图表。数据表示6只动物的平均值（±标准差）。 单击此处查看大图.

讨论

我们介绍一种建立小鼠原位异种移植膀胱肿瘤模型的方案，随后通过膀胱内给予靶向p21^CIP1/WAF1（p21）启动子以实现转录激活的LNP配制saRNA对肿瘤进行治疗^{2, 3}。所形成的肿瘤可通过生物发光成像和膀胱超声进行确认与监测。相较于腹腔内、皮下或静脉内模型，原位模型可提供更接近内源性膀胱癌的尿液环境与尿路上皮微环境，因而更具优势。已有多种小鼠原位膀胱肿瘤模型被建立，方法包括直接膀胱壁注射以及膀胱内灌注^4-8。如本研究所示，采用膀胱内灌注接种肿瘤细胞的方法更贴近人类膀胱肿瘤的发生过程——肿瘤起始于黏膜上皮表层，并随进展逐渐向深层浸润。我们采用硝酸银处理膀胱以促进肿瘤接种的方法成本低廉且技术简便。

Hadaschik 等 描述了小鼠膀胱内灌注膀胱肿瘤的方法，并报道了可靠的生物发光肿瘤评估技术。⁵ 我们同样发现，通过导管插入和细胞灌注，肿瘤移植成功率较高。我们的肿瘤不仅通过生物发光得以确认，还通过 体内 膀胱超声，为量化肿瘤进展提供了一种额外方法。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KU-7-luc-GFP 细胞	Caliper Life Sciences	128091
胸腺裸鼠（nu/nu）	Simonsen Laboratories	6-7 周龄	Sim:(NCr) nu/nu fisol
超声成像仪	VisualSonics, inc.	Vevo 770	RMV-704 探头
生物发光成像仪	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum
Exel safelet 导管	Fisher Scientific	14-841-21	24G X ¾"
硝酸银	Sigma-Aldrich	S8157
Hamilton 注射器	Hamilton Co	80301
LNP-saRNA	Alnylam Pharmaceuticals
表 1. 特异性试剂与仪器设备。