一种膀胱原位肿瘤模型及膀胱内注射saRNA治疗的评价

摘要

建立原位膀胱肿瘤模型，以评估经膀胱内递送的saRNA的抗肿瘤效果，并通过超声和生物发光成像监测肿瘤生长。

摘要

我们介绍一种在原位异种移植小鼠膀胱肿瘤模型中通过膀胱内给药小激活RNA（saRNA）治疗膀胱癌的新方法。该小鼠模型通过在吸入全身麻醉下经尿道插管建立。随后使用膀胱内灌注硝酸银溶液对膀胱黏膜造成化学灼伤，以破坏膀胱糖胺聚糖层，促进细胞黏附。经无菌水多次冲洗后，将人膀胱癌KU-7-luc2-GFP细胞通过导管注入膀胱内，留置2小时。随后通过 体内 膀胱超声与生物发光成像。随后通过膀胱内灌注方式给予装载于脂质纳米颗粒（LNPs）中的saRNA进行治疗。肿瘤生长情况通过超声和生物发光进行监测。本视频中展示了该操作流程的全部步骤。

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得加利福尼亚大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 细胞制备

1. 人膀胱癌细胞系 KU-7-luc2-GFP（Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA）在添加了10%胎牛血清和50 μg/ml 庆大霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。
2. 细胞培养条件为 37 °C、5% CO₂，每两到三天更换一次培养基。
3. 通过胰蛋白酶消化收集细胞，并使用血细胞计数板进行计数。将 2 × 10⁶ 个细胞重悬于 50 μl 磷酸盐缓冲液中，制成单细胞悬液，并置于冰上保存。

2. 原位膀胱肿瘤模型

1. 使用8-10周龄的雌性裸鼠（nu/nu）（Simonsen Laboratory，Gilory，CA）。
2. 在加热垫上覆盖无菌手术巾作为手术平台。准备无菌润滑胶、带针芯的24号导管、硝酸银溶液和无菌水。
3. 通过吸入异氟烷（诱导浓度3%，维持浓度1-2%）对小鼠实施全身麻醉，并通过鼻罩持续维持麻醉。将无菌眼膏涂抹于动物眼部，并使用加热垫维持体温。
4. 将小鼠置于仰卧位。
5. 用镊子轻轻夹住动物的外阴部以固定。
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讨论

我们介绍一种建立小鼠原位异种移植膀胱肿瘤模型的方案，随后通过膀胱内给予靶向p21^CIP1/WAF1（p21）启动子以实现转录激活的LNP配制saRNA对肿瘤进行治疗^{2, 3}。所形成的肿瘤可通过生物发光成像和膀胱超声进行确认与监测。相较于腹腔内、皮下或静脉内模型，原位模型可提供更接近内源性膀胱癌的尿液环境与尿路上皮微环境，因而更具优势。已有多种小鼠原位膀胱肿瘤模型被建立，方法包括直接膀胱壁注射以及膀胱内灌注^4-8。如本研究所示，采用膀胱内灌注接种肿瘤细胞的方法更贴近人类膀胱肿瘤的发生过程——肿瘤起始于黏膜上皮表层，并随进展逐渐向深层浸润。我们采用硝酸银处理膀胱以促进肿瘤接种的方法成本低廉且技术简便。

Hadaschik 等 描述了小鼠膀胱内灌注膀胱肿瘤的方法，并报道了可靠的生物发光肿瘤评估技术。⁵ 我们同样发现，通过导管插入和细胞灌注，肿瘤移植成功率较高。我们的肿瘤不仅通过生物发光得以确认，还通过 体内 膀胱超声，为量化肿瘤进展提供了一种额外方法。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
KU-7-luc-GFP 细胞	Caliper Life Sciences	128091
胸腺裸鼠（nu/nu）	Simonsen Laboratories	6-7 周龄	Sim:(NCr) nu/nu fisol
超声成像仪	VisualSonics, inc.	Vevo 770	RMV-704 探头
生物发光成像仪	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum
Exel safelet 导管	Fisher Scientific	14-841-21	24G X ¾"
硝酸银	Sigma-Aldrich	S8157
Hamilton 注射器	Hamilton Co	80301
LNP-saRNA	Alnylam Pharmaceuticals
表 1. 特异性试剂与仪器设备。