骨髓移植提供了一种改变骨髓来源细胞基因型的方法。如果目的基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，骨髓移植可以在不改变非骨髓来源细胞基因型的情况下，将骨髓来源细胞的基因型转变为另一种基因型。
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本文内容
摘要
摘要
为了理解某个基因在结肠炎发展中的作用，我们比较了野生型小鼠和该目的基因敲除小鼠在结肠炎中的反应。如果该目的基因在宿主的骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，则可通过骨髓移植技术来区分该基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中的不同作用。为了改变小鼠骨髓来源细胞的基因型，首先通过照射破坏受体小鼠原有的骨髓，然后用不同基因型的供体骨髓进行替代。当将野生型小鼠的骨髓移植到基因敲除小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中表达野生型基因的敲除小鼠。反之，当将基因敲除小鼠的骨髓移植到野生型受体小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中不表达该目的基因的野生型小鼠。然而，骨髓移植可能无法达到100%完全替换。因此，我们利用分化簇（CD）分子（CD45.1 和 CD45.2）作为供体和受体细胞的标记，以追踪受体小鼠体内供体骨髓来源细胞的比例，评估骨髓移植的成功程度。实验中使用CD45.1基因型的野生型小鼠和CD45.2基因型的基因敲除小鼠。在对受体小鼠进行照射后，将不同基因型的供体骨髓细胞输注至受体小鼠体内。待新的骨髓再生并重建免疫系统后，通过化学试剂（葡聚糖硫酸钠，DSS 5%）处理小鼠以诱导结肠炎。本文同时展示了在小鼠中诱导结肠炎的方法，并评估由骨髓来源细胞表达的目的基因在疾病中的作用。如果来自骨髓来源细胞的目的基因在疾病（如结肠炎）的发展中起重要作用，则接受骨髓移植的受体小鼠的表型可能发生显著改变。在结肠炎实验结束时，采集小鼠外周血和骨髓中的细胞，用抗CD45.1和CD45.2抗体标记，通过流式细胞术定量分析两种细胞的比例，以评估骨髓移植的成功程度。成功的骨髓移植应在受体小鼠的骨髓和血液中均显示供体基因型（以CD分子标记为准）占绝对优势。
方案
1. 开始前的技术注意事项
- 我们建议在实验中同时使用 C57/BL6 野生型小鼠和基因敲除小鼠，因为带有相应 CD 分子的小鼠可从主要的小鼠供应商处购买获得。
- 由于在骨髓移植后难以追踪野生型小鼠和基因敲除小鼠来源的供体细胞，因此有必要使用 CD45.1 小鼠来代表野生型小鼠（CD45.1 C57/SJL WT 小鼠，Jackson Laboratories 货号 #002014）。
- 大多数小鼠品系为 CD45.2 型。我们的基因敲除小鼠属于 CD45.2 基因型（也可选用 CD45.2 野生型小鼠，Jackson Laboratories 货号 #000664）。CD45.1 或 CD45.2 基因型的鉴定可通过本方案第 7 节所述的骨髓和外周血流式细胞术进行。
- 经照射后的小鼠免疫功能受损，应将小鼠饲养于无病原体设施中。
- 照射设备的操作需要特殊的安保许可和培训。为节省培训和审批所需时间，最好与拥有合格技术人员且能够操作照射设备的实验室合作。
- 许多机构设有配备经验丰富的技术人员的流式细胞术实验室。为尽量减少流式细胞术操作中的问题，建议在开始实验前先与经验丰富的技术人员讨论您的流式细胞术实验方案。
- 小鼠按如下方式分组（每组 10 只小鼠）：
| 组别 |
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结果
如果目的基因在结肠炎发展过程中对免疫细胞具有重要作用，那么通过骨髓移植接受不同基因型骨髓的小鼠（野生型至基因敲除型或基因敲除型至野生型）应对DSS诱导的结肠炎表现出不同的反应。评估结肠炎严重程度最重要的参数之一是结肠组织的苏木精-伊红（H&E）染色。结肠组织结构的变化和炎症迹象可通过H&E组织学评分系统进行定量评估。DSS结肠炎模型的H&E组织学评分标准可参见此处2。此外，化学性结肠炎也可由三硝基苯磺酸（TNBS）诱导。TNBS诱导结肠炎的方法及H&E组织学评分标准见于先前发表的研究3。组间组织学评分差异可采用学生t检验（student's t-test）进行分析。
与假骨髓移植小鼠（WT 到 WT 或 KO 到 KO）相比，这些小鼠的结肠炎可能显著改善或加重。如果目的基因通过骨髓来源的细胞在结肠炎中发挥重要作用，那么骨髓移植小鼠的反应应显著不同于假骨髓移植小鼠。
对于DSS结肠炎模型，可通过组织学评分来评估组织学变化（见
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讨论
这种骨髓移植方法适用于结肠炎、感染、癌症、肥胖及其他疾病的免疫学研究。当目的基因在骨髓来源和非骨髓来源的细胞中均有表达，且怀疑该基因通过其中任一群体的细胞介导疾病时，需要进行骨髓移植实验。例如，抗菌肽 cathelicidin 被证明可调节急性结肠炎，但它在上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞）中均有表达。因此，我们利用骨髓移植来确定哪一群细胞在小鼠中调节急性结肠炎。通过骨髓移植改变骨髓中 cathelicidin 的基因型后，结肠炎的严重程度发生了显著变化。由此可以得出结论：在骨髓来源细胞中表达的 cathelicidin 在响应 DSS 诱导的急性结肠炎过程中发挥着重要作用。
骨髓来源的细胞通常包括红细胞、白细胞和血小板。骨髓移植可改变这些细胞的基因型，但不影响其他细胞。从广义上讲，该实验仅能区分目的基因在骨髓来源细胞与非骨髓来源细胞中的作用。然而，该实验无法进一步明确是哪一类骨髓来源细胞介导了结肠炎，因为所有红细胞、白细胞和血小板均起源于骨髓。在结肠炎期间迁移至结肠的骨髓来源细胞的命运，是当前活跃且存在争议的研究领域。在骨髓移植并诱导小鼠结肠炎后，部分骨髓来源细胞可能在结肠中表现.......
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致谢
本工作由加州大学洛杉矶分校CURE中心的试点与可行性研究资助、美国克罗恩病和结肠炎基金会职业发展奖（#2691）以及美国国立卫生研究院国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所K01基金（DK084256）资助，资助对象为Hon Wai Koon。
骨髓照射操作由加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心人/鼠嵌合体核心设施的Bernard Levin和Scott Kitchen协助完成。流式细胞术操作由加州大学洛杉矶分校病毒载体核心设施协助完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞染色缓冲液 | Biolegend | #420201 | |
| 10X 红细胞裂解缓冲液 | Biolegend | #420301 | |
| FITC 小鼠同型对照 | Biolegend | #400207 | |
| PE小鼠同型对照 | Biolegend | #400211 | |
| PE 抗小鼠 CD45.2 | Biolegend | #109807 | |
| FITC抗小鼠CD45.1 | Biolegend | #110705 | |
| 抗小鼠 CD16/32 封闭 | Biolegend | #101301 | |
| 40 μm细胞滤器 | Fisherbrand | #22363547 | |
| PBS 1× | MP Biomedicals | #1860454 | |
| 肝素 | Fisherbrand | #BP2425 | |
| 复方新诺明（SMZ） | Qualitest | NC9242720（fisher） | |
| Lysol IC | 安德温科学公司 | NC9745686（fisher） | |
| Vaccutainer | BD | #8000813 | |
| 小鼠固定器 | 布雷因特里科学公司 | #TV-150 | |
| 辐照仪 | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A | |
| 流式细胞仪 | BD | BD FACSCanto II | |
| 流式细胞仪测试管 | Falcon | #352052 | |
| 数字卡尺 | Fisherbrand | 14-648-17 | |
| Hemoccult ICT | 贝克曼库尔特 | G0328QW |
参考文献
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....
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