通过骨髓移植区分免疫细胞与非免疫细胞中基因表达在小鼠结肠炎中的功能作用

摘要

骨髓移植提供了一种改变骨髓来源细胞基因型的方法。如果目的基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，骨髓移植可以在不改变非骨髓来源细胞基因型的情况下，将骨髓来源细胞的基因型转变为另一种基因型。

摘要

为了理解某个基因在结肠炎发展中的作用，我们比较了野生型小鼠和该目的基因敲除小鼠在结肠炎中的反应。如果该目的基因在宿主的骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中均有表达，则可通过骨髓移植技术来区分该基因在骨髓来源细胞和非骨髓来源细胞中的不同作用。为了改变小鼠骨髓来源细胞的基因型，首先通过照射破坏受体小鼠原有的骨髓，然后用不同基因型的供体骨髓进行替代。当将野生型小鼠的骨髓移植到基因敲除小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中表达野生型基因的敲除小鼠。反之，当将基因敲除小鼠的骨髓移植到野生型受体小鼠体内时，可获得在骨髓来源细胞中不表达该目的基因的野生型小鼠。然而，骨髓移植可能无法达到100%完全替换。因此，我们利用分化簇（CD）分子（CD45.1 和 CD45.2）作为供体和受体细胞的标记，以追踪受体小鼠体内供体骨髓来源细胞的比例，评估骨髓移植的成功程度。实验中使用CD45.1基因型的野生型小鼠和CD45.2基因型的基因敲除小鼠。在对受体小鼠进行照射后，将不同基因型的供体骨髓细胞输注至受体小鼠体内。待新的骨髓再生并重建免疫系统后，通过化学试剂（葡聚糖硫酸钠，DSS 5%）处理小鼠以诱导结肠炎。本文同时展示了在小鼠中诱导结肠炎的方法，并评估由骨髓来源细胞表达的目的基因在疾病中的作用。如果来自骨髓来源细胞的目的基因在疾病（如结肠炎）的发展中起重要作用，则接受骨髓移植的受体小鼠的表型可能发生显著改变。在结肠炎实验结束时，采集小鼠外周血和骨髓中的细胞，用抗CD45.1和CD45.2抗体标记，通过流式细胞术定量分析两种细胞的比例，以评估骨髓移植的成功程度。成功的骨髓移植应在受体小鼠的骨髓和血液中均显示供体基因型（以CD分子标记为准）占绝对优势。

方案

1. 开始前的技术注意事项

1. 我们建议在实验中同时使用 C57/BL6 野生型小鼠和基因敲除小鼠，因为带有相应 CD 分子的小鼠可从主要的小鼠供应商处购买获得。
2. 由于在骨髓移植后难以追踪野生型小鼠和基因敲除小鼠来源的供体细胞，因此有必要使用 CD45.1 小鼠来代表野生型小鼠（CD45.1 C57/SJL WT 小鼠，Jackson Laboratories 货号 #002014）。
3. 大多数小鼠品系为 CD45.2 型。我们的基因敲除小鼠属于 CD45.2 基因型（也可选用 CD45.2 野生型小鼠，Jackson Laboratories 货号 #000664）。CD45.1 或 CD45.2 基因型的鉴定可通过本方案第 7 节所述的骨髓和外周血流式细胞术进行。
4. 经照射后的小鼠免疫功能受损，应将小鼠饲养于无病原体设施中。
5. 照射设备的操作需要特殊的安保许可和培训。为节省培训和审批所需时间，最好与拥有合格技术人员且能够操作照射设备的实验室合作。
6. 许多机构设有配备经验丰富的技术人员的流式细胞术实验室。为尽量减少流式细胞术操作中的问题，建议在开始实验前先与经验丰富的技术人员讨论您的流式细胞术实验方案。
7. 小鼠按如下方式分组（每组 10 只小鼠）：

组别		骨髓供体至受体	处理方式
A	骨髓移植	CD45.1 WT 至 CD45.2 KO	DSS 结肠炎
B			饮水正常对照
C	骨髓移植	CD45.2 KO 至 CD45.1 WT	DSS 结肠炎
D			饮水正常对照
E	假手术	CD45.1 WT 至 CD45.1 WT	DSS 结肠炎
F			饮水正常对照
G	假手术	CD45.2 KO 至 CD45.2 KO	DSS 结肠炎
H			饮水正常对照

* 实验方案的简要示意图见图1。

2. 受体小鼠照射

1. 小鼠在无病原体环境中繁育和饲养。将小鼠放入经高压灭菌的辐照转盘中，每个转盘孔放置一只小鼠。将转盘放入辐照仪中，并确保转盘及其自身处于旋转状态。
2. 开启空气泵以进行通风。关闭辐照仪门并上锁。
3. 以1,000 rad（相当于10 Gy）剂量对小鼠进行约10分钟的辐照（具体时间取决于辐射源及其半衰期）。自此时间点起，辐照后的小鼠免疫功能受损，对感染的抵抗力减弱。辐照完成后，取出转盘并放入无菌容器中，转运至动物设施的生物安全柜内。应避免让小鼠暴露于外界环境，以最大限度降低感染风险。
4. 在生物安全柜中，将小鼠转移至经高压灭菌的小鼠笼具中，并铺有高压灭菌的垫料（每笼4只小鼠）。加入含磺胺甲噁唑-三甲氧苄啶（sulfatrim）悬浮液的新鲜无菌水——每100 ml水中加入3.12 ml。
5. 用水瓶外包裹铝箔，因为抗生素对光敏感。在将sulfatrim溶液加入笼具前，需充分摇匀溶液瓶。

3. 供体骨髓提取

1. 使用二氧化碳或异氟烷处死小鼠，随后将其浸入1:200的来苏尔溶液中。用70%乙醇喷洒小鼠以润湿皮肤，并解剖暴露骨骼。
2. 将解剖器械浸泡于70%乙醇中以进行消毒。
3. 在生物安全柜中进行解剖操作。使用无菌解剖器械暴露肱骨、股骨、胫骨和腓骨，去除附着的肌肉和韧带。
4. 剪开骨骼两端以暴露红色骨髓。用镊子夹持骨骼，使用装有25G针头的3 ml注射器吸取冷PBS冲洗骨髓至培养皿中。从骨骼两端分别冲洗，以获得更多的骨髓细胞。
5. 使用6 ml注射器和18G1/2针头，通过反复抽吸和推出的方式破碎骨髓团块。将骨髓转移至50 ml Falcon管中。
6. 在4 °C条件下以1,800 rpm离心5分钟，沉淀骨髓细胞。弃去上清液，通过涡旋振荡5–10秒重悬细胞沉淀。
7. 用无菌水将10X红细胞裂解缓冲液稀释为1X工作液。每只供体小鼠加入5 ml 1X红细胞裂解缓冲液，再次涡旋振荡5秒，并在室温下准确孵育3分钟。
8. 3分钟后，向管中加入20 ml冷PBS以终止裂解反应，并混匀。将悬液直接通过40 μm细胞筛过滤至新的50 ml Falcon管中。
9. 用5 ml PBS冲洗原管，并将冲洗液也转移至细胞筛中。最后用PBS补总体积至50 ml并混匀。

4. 计数骨髓供体细胞

1. 取100 μl台盼蓝加入离心管中，再取100 μl骨髓悬液加入另一离心管中，混匀。用移液器将染色后的细胞混合液转移至血细胞计数板。
2. 细胞数量计算方法：Falcon管中总的活骨髓细胞数 = 16个方格内未染色细胞数 × 2（因台盼蓝稀释倍数）× 10,000 × 50 ml
3. 将Falcon管中的骨髓细胞在4 °C条件下以2,000 rpm离心5分钟。
4. 弃去上清液。根据总细胞数，用PBS重悬细胞沉淀，调整浓度至每毫升含1 × 10⁸个细胞。

5. 输注至受体小鼠

1. 将受体小鼠置于加热垫上并在保温灯下预热。将受体小鼠放入固定器中，每只小鼠通过静脉注射 100–200 μl 含 1 × 10⁷ 个细胞的细胞悬液。
2. 供体骨髓的注射必须在照射后 4–24 小时内完成。
3. 每笼饲养不超过 4 只已注射的小鼠。将注射后的受体小鼠置于高压灭菌的笼盒中，在无病原动物设施中饲养，给予抗生素处理的饮水，持续 4 周，以恢复免疫功能。每 4 天更换一次笼盒、抗生素处理的饮水和饲料，以维持卫生条件。

6. 结肠炎的诱导与评估

1. 照射及骨髓移植4周后，更换为普通饮水，不再添加抗生素，并继续饲养小鼠2周，以恢复其正常的肠道菌群。
2. 骨髓注射6周后，测量初始体重。部分小鼠给予含5%葡聚糖硫酸钠的饮用水 随意摄取 以诱导结肠炎。部分小鼠仅给予普通饮用水作为正常对照组。
3. 5 天后，采集外周血，转移至肝素包被的试管（Vacutainer）中，并置于冰上保存。将 4 只小鼠的血液合并至 1 支试管中。取 300 μl 血液与 300 μl 细胞染色缓冲液混合，共 600 μl。将混合后的血液分装至 5 个 Eppendorf 管中，每管 100 μl。
4. 用二氧化碳或异氟烷处死小鼠。评估大体损伤评分（详情请参见另一篇 JoVE 视频出版物） ¹）。测量体重变化。使用数显卡尺测量肠道长度和厚度。观察粪便质地（硬、软或带血）。采用Hemooccult试剂检测粪便隐血。解剖结肠组织并用福尔马林固定，用于后续组织学分析。&E染色。
5. 每只小鼠解剖一条股骨，提取骨髓，使用25G针头和1 ml注射器以预冷的PBS冲洗骨髓。将4个骨髓组织块汇集至同一离心管中，置于冰上保存。
6. 将骨髓倒入培养皿中，使用18G针头和5 ml注射器反复剪切骨髓团块数次，直至无骨髓团块存在。
7. 在 4 °C 条件下以 1,500 rpm 离心 5 分钟。弃上清，加入 600 μl 细胞染色缓冲液重悬细胞。将重悬的骨髓细胞分装至 5 个 Eppendorf 管中，每管 100 μl。

7. 通过流式细胞术对骨髓移植进行质量检测

1. 将每管血液或骨髓样本标记为1-5号：
2. 在避光条件下，为每管分别配制相应的抗体混合液。

#1 无抗体
#2 30 μl FITC 同型对照 + 30 μl PE 同型对照 + 15 μl CD16/32 封闭抗体
#3 30 μl FITC CD45.1 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体
#4 30 μl PE CD45.2 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体
#5 30 μl FITC CD45.1 抗体 + 30 μl PE CD45.2 抗体 + 15 μl CD16/32 封闭抗体

向血液或骨髓样本 #1 中不添加任何物质

向每份血液或骨髓样本 #2 中加入 5 μl 抗体混合物 #2

向每份血液或骨髓样本 #3 中加入 3 μl 抗体混合物 #3

向每份血液或骨髓样本 #4 中加入 3 μl 抗体混合物 #4

向每份血液或骨髓样本 #5 中加入 5 μl 抗体混合物 #5

3. 避光冰上孵育 30 分钟。
4. 每管加入 2 ml 1X 红细胞裂解缓冲液，避光冰上孵育 15 分钟。
5. 在 4 °C 条件下以 1,500 rpm 离心 5 分钟（GH 3.8 转子，1,500 rpm = 350 × g），弃上清。用 500 μl 细胞染色缓冲液重悬沉淀，避光条件下短暂涡旋振荡。
6. 通过流式细胞术检测免疫染色后的血液和骨髓样本中的 CD45.1（代表野生型）和 CD45.2（代表基因敲除型）。选择 FITC 标记野生型 CD45.1，PE 标记基因敲除型 CD45.2。
7. 使用 FlowJo 软件分析流式细胞术结果，计算 FITC:PE 比值或 PE:FITC 比值，以确定供体基因型是否在血液和骨髓中占主导地位。

结果

如果目的基因在结肠炎发展过程中对免疫细胞具有重要作用，那么通过骨髓移植接受不同基因型骨髓的小鼠（野生型至基因敲除型或基因敲除型至野生型）应对DSS诱导的结肠炎表现出不同的反应。评估结肠炎严重程度最重要的参数之一是结肠组织的苏木精-伊红（H&E）染色。结肠组织结构的变化和炎症迹象可通过H&E组织学评分系统进行定量评估。DSS结肠炎模型的H&E组织学评分标准可参见此处²。此外，化学性结肠炎也可由三硝基苯磺酸（TNBS）诱导。TNBS诱导结肠炎的方法及H&E组织学评分标准见于先前发表的研究³。组间组织学评分差异可采用学生t检验（student's t-test）进行分析。

与假骨髓移植小鼠（WT 到 WT 或 KO 到 KO）相比，这些小鼠的结肠炎可能显著改善或加重。如果目的基因通过骨髓来源的细胞在结肠炎中发挥重要作用，那么骨髓移植小鼠的反应应显著不同于假骨髓移植小鼠。

对于DSS结肠炎模型，可通过组织学评分来评估组织学变化（见

讨论

这种骨髓移植方法适用于结肠炎、感染、癌症、肥胖及其他疾病的免疫学研究。当目的基因在骨髓来源和非骨髓来源的细胞中均有表达，且怀疑该基因通过其中任一群体的细胞介导疾病时，需要进行骨髓移植实验。例如，抗菌肽 cathelicidin 被证明可调节急性结肠炎，但它在上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞）中均有表达。因此，我们利用骨髓移植来确定哪一群细胞在小鼠中调节急性结肠炎。通过骨髓移植改变骨髓中 cathelicidin 的基因型后，结肠炎的严重程度发生了显著变化。由此可以得出结论：在骨髓来源细胞中表达的 cathelicidin 在响应 DSS 诱导的急性结肠炎过程中发挥着重要作用。

骨髓来源的细胞通常包括红细胞、白细胞和血小板。骨髓移植可改变这些细胞的基因型，但不影响其他细胞。从广义上讲，该实验仅能区分目的基因在骨髓来源细胞与非骨髓来源细胞中的作用。然而，该实验无法进一步明确是哪一类骨髓来源细胞介导了结肠炎，因为所有红细胞、白细胞和血小板均起源于骨髓。在结肠炎期间迁移至结肠的骨髓来源细胞的命运，是当前活跃且存在争议的研究领域。在骨髓移植并诱导小鼠结肠炎后，部分骨髓来源细胞可能在结肠中表现...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞染色缓冲液	Biolegend	#420201
10X 红细胞裂解缓冲液	Biolegend	#420301
FITC 小鼠同型对照	Biolegend	#400207
PE小鼠同型对照	Biolegend	#400211
PE 抗小鼠 CD45.2	Biolegend	#109807
FITC抗小鼠CD45.1	Biolegend	#110705
抗小鼠 CD16/32 封闭	Biolegend	#101301
40 μm细胞滤器	Fisherbrand	#22363547
PBS 1×	MP Biomedicals	#1860454
肝素	Fisherbrand	#BP2425
复方新诺明（SMZ）	Qualitest	NC9242720（fisher）
Lysol IC	安德温科学公司	NC9745686（fisher）
Vaccutainer	BD	#8000813
小鼠固定器	布雷因特里科学公司	#TV-150
辐照仪	J.L. Shepherd and Associates	Mark I 68A
流式细胞仪	BD	BD FACSCanto II
流式细胞仪测试管	Falcon	#352052
数字卡尺	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	贝克曼库尔特	G0328QW