我们开发了一种新型手术方法，用于将生物活性物质直接注入小鼠胎儿的气管。与常用的羊膜内注射相比，该递送途径在靶向胎儿小鼠肺组织方面效率更高。迄今为止，该操作程序尚未在小鼠模型中报道过。
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方法文章
一种在胎鼠模型中进行气管内给予生物活性物质的新型外科手术方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
产前肺部递送细胞、基因或药理学制剂可能为多种遗传性和获得性疾病的治疗提供新策略。除需要外源基因长期表达的先天性或遗传性疾病外，一些非遗传性的围产期疾病仅需短期基因表达或药物干预即可达到治疗效果，因此也被视为此类方法潜在的未来适应证。适合短期产前治疗的候选疾病包括由表面活性蛋白B transient缺乏引起的新生儿呼吸窘迫综合征1,2，以及新生儿肺部的高氧损伤3。适合永久性治疗纠正的疾病则包括囊性纤维化（CF）4、表面活性物质缺乏的遗传变异型5以及α1-抗胰蛋白酶缺乏症6。
通常，产前基因治疗的一个重要优势是能够在个体发育的早期，甚至在临床症状出现之前就启动治疗干预，从而防止对个体造成不可逆的损伤。此外，与成体器官相比，胎儿器官的细胞增殖速率更高，这可能有助于更高效地将基因或干细胞导入胎儿体内。 Furthermore，in utero 基因递送是在个体的免疫系统尚未完全成熟时进行的。因此，移植异源细胞或用正常版本补充功能缺陷或缺失的蛋白质，应不会引起针对细胞、载体或转基因产物的免疫致敏，这一点最近已在细胞治疗和基因治疗中得到证实7。
在本研究中，我们探讨了在小鼠模型中直接靶向胎儿气管的可能性。该操作已在较大的动物模型（如兔和羊）8以及临床环境中9得到应用，但迄今为止尚未在小鼠模型中实施过。在研究囊性纤维化（CF）等遗传性疾病的胎儿基因治疗潜力时，小鼠模型作为概念验证的首选工具具有重要价值，原因在于其拥有多种可获得的转基因小鼠品系、胚胎发生与胎儿发育过程记录详尽、伦理限制较宽松、妊娠周期短且每胎产仔数量多。
已有多种不同的介入途径用于靶向胎儿啮齿类动物的肺部，包括羊膜内注射10-12、（超声引导下的）肺内注射13,14，以及向卵黄囊血管15,16或脐静脉17进行静脉给药。我们提出的新型外科手术方法可使研究人员将目标物质直接注射至胎鼠气管内，相较于现有技术，该方法可更高效地将物质递送至气道18。
方案
1. 交配小鼠以获得所需妊娠阶段
通过合笼定时使NMRI小鼠怀孕，确保在手术时小鼠处于妊娠18天（E18）（总妊娠期为E19.5）。手术前后，将小鼠饲养在滤帽笼中，环境为正常室温与正常昼夜光照，可自由获取饮水和饲料。
2. 胎儿气管内（I.T.）注射（图1）
- 首先将怀孕的NMRI小鼠置于含1.5%异氟烷的氧气混合气体中进行全身麻醉2 以1.5 L/min的流速输送。异氟烷的浓度取决于小鼠的年龄和品系，但通常应调整至使动物处于麻醉状态的水平。然后将怀孕小鼠置于加热垫上（37 °C以维持手术期间的体温。
- 整个手术过程由两名外科医生共同完成。一名外科医生负责对怀孕小鼠进行解剖，并暴露胎儿以进行气管内注射。另一名外科医生负责实施胎儿气管内注射操作。手术过程中使用无菌器械并遵循无菌技术。
- 用聚维酮碘对腹部进行消毒，行正中剖腹术以暴露妊娠子宫。逐次将一侧子宫角移出腹腔，计数妊娠囊的数量。每侧子宫角选择一个胎儿进行手术操作，选择依据为 最佳位置 用于后续步骤中将胎儿头部牵出体外。通过子宫壁观察，选择最合适的胎儿。胎儿头部的鼻尖应朝向术者，以便在暴露胎儿头部并将其向后固定后（如后续步骤2.5所述），进行气管注射。
- 首先使用6-0聚丙烯（Prolene）缝线 荷包缝合 在子宫壁及覆盖未来胎儿头部将要露出区域的胎膜（羊膜和壁层卵黄囊）上，做一个直径约1 cm的切口。此荷包缝合线可使胎儿从肩部开始向内的部分固定于子宫内。接着，用锐利的剪刀在荷包缝合线内侧的子宫壁上做长约0.8 cm的切口。
- 通过子宫切口轻柔地挤压胎儿的头部和颈部。轻轻拉紧颈部周围的荷包缝合线，并用2把微型蚊式钳固定其位置。 胎儿头部保持过伸位 使用带5-0聚乳酸-羟基乙酸共聚物910（Vicryl）缝线的两把镊子置于口腔上颌周围进行缝合。
- 在体视变倍显微镜下（×10 放大倍数） 胎儿气管被可视化 通过锐性与钝性分离法做颈部垂直切口。颈部切口长约5 mm，为浅表切口，其下方组织进一步采用钝性分离法解剖，以暴露气管。
- 在体视变倍显微镜直视下 注射 总体积 30 μl 物质例如 荧光微球或病毒载体 进入气管 使用一个 50 μl Hamilton 玻璃注射器配 30 G 锐利针头。拔除针头后，仅产生极少的注入液体外流，从而确保注射量准确。注射后切口不进行缝合。
- 为了 将头部重新置入子宫轻轻按压胎儿鼻部，使颈部首先进入子宫，随后是头部，鼻部最后进入。接着，收紧荷包缝合线以关闭子宫切口。然后，向羊膜腔内注射总共约0.5 ml生理盐水，以预防羊水过少。操作时，将针头插入荷包缝合线内的切口处，随后在针周收紧缝线，再注入生理盐水。最后一步，拔出针头，随后完全收紧荷包缝合线。
- 关闭 用5-0 Vicryl缝线连续缝合母鼠腹壁（腹膜及内外肌层）和皮肤，分两层进行。随后，用0.2%利多卡因浸润切口以缓解术后疼痛。建议使用布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，皮下或腹腔注射）进行术后镇痛。不使用预防性宫缩抑制剂或抗生素。将小鼠置于加热垫上37 °C直至其完全恢复（约1小时）。
3. 胎儿宫内羊膜腔（I.A.）注射
- 参见 2.1
- 用聚维酮碘对腹部进行消毒，并行正中剖腹术以暴露妊娠子宫。一次将一个子宫角移出体外，并计数妊娠囊的数量。
- 宫内注射可应用于所有胎儿，因其操作耗时较短。此外，与气管内注射相比，胎儿体位的重要性较低。由于子宫壁呈半透明状，胎儿的头部、四肢、尾部以及胎盘的位置均清晰可见。
- 使用与上述相同的针头和注射器（2.7），在胎儿口腔附近注射 30 μl 的物质。此操作最简便的位置为胎儿头部与前肢之间，或后肢与尾部之间。注射仅在仔细检查针头位置后进行，以确保注射时针尖未接触任何胎儿结构。
- 将子宫重新放回腹腔，并按上述方法（2.9）缝合腹壁和皮肤。
4. 注射后胎儿的评估与交叉哺育
- 在胎儿干预后36小时（E19.5）采用批准的安乐死方法处死母鼠。首选方法为颈椎脱位且无需额外麻醉，因为所有包含麻醉剂的其他安乐死方法（例如异氟烷、戊巴比妥）均可能使胎儿麻醉甚至死亡，应始终避免。通过剖宫产取出已手术的胎儿。在子宫内通过位置识别已手术的胎儿。从双角子宫的卵巢端开始，对羊膜囊依次编号。
- 出生后，根据以下标准评估胎儿的存活能力：（1）存在心跳，（2）皮肤呈粉红色（而非发绀），以及（3）有自主活动。仅将符合上述标准的仔鼠放入含有出生一天仔鼠的代孕母鼠窝中。根据经验，心跳微弱、皮肤发绀和/或自主活动极少的仔鼠常因被代孕母鼠排斥或母性食仔行为而无法存活。
- 通过气管内（I.T.）或动脉内（I.A.）注射可见染料（例如红色荧光分子）后，可通过观察染料的存在（注射红色荧光微球后呈现的粉红色）来确认正确注射：染料出现在胸腔（气管注射后直接进入肺部，或动脉注射后经吸入进入肺部）或腹腔（经吞咽摄入）。此方法可行的原因在于新生小鼠身体半透明，允许对肺和胃进行体内评估。
- 标记正确注射的仔鼠：在尾基部皮下注射中国墨水。将所有符合4.2节所述条件的仔鼠放入代孕母鼠的窝中。
- 为确保手术仔鼠获得最大程度的接受与存活，代孕母鼠窝中总仔鼠数不超过10只（包括其自身出生一天的仔鼠及交叉寄养的仔鼠）。在将手术仔鼠放入代孕母鼠窝前，应用来自代孕母鼠笼内的垫料（含其粪便和尿液）覆盖仔鼠，以掩盖非熟悉的气味。
- 将鼠笼置于安静环境中，至少12小时内（过夜）不要打扰仔鼠窝。
- 次日，通过计数所有仔鼠仔细评估寄养的存活率，区分代孕母鼠的仔鼠与手术仔鼠（以中国墨水标记且通常体型小于其他仔鼠）。应尽量减少对仔鼠的操作时间，以避免母鼠排斥及低体温。通常情况下，若仔鼠胃内无乳汁（因新生仔鼠身体半透明而可见），其后续存活的预后极差。
5. 代表性结果
实验的整体方案如图2所示。
确定气管内注射的最佳体积
为了确定鞘内注射（I.T.注射）的最佳体积，我们通过实验经验性地选择了10、20和30 μl三种不同体积（每种体积n=3）。为了便于检测，我们选用直径为100 nm的红色荧光分子（fluospheres，Molecular Probes，Leiden，荷兰）进行注射。在E18天龄的胎鼠中进行鞘内注射后24小时取肺组织，于4 °C条件下用4%多聚甲醛固定过夜，制备6 μm厚的冷冻切片。细胞核和肌动蛋白纤维分别使用Hoechst 33258（Sigma-Aldrich，Bornem，比利时）和Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽（Invitrogen，Merelbeke，比利时）在室温下染色20分钟。共聚焦图像使用Carl Zeiss的LaserSharp2000.6软件配合Biorad Radiance 2100共聚焦显微镜采集。相对荧光强度（代表fluospheres的红色荧光与代表细胞核染色的蓝色荧光的比值）通过ImageJ在线软件进行定量分析（图3）。尽管在胎儿手术时仅在注射30 μl后观察到回流现象，提示注入液体过量，但定量结果显示30 μl在肺实质中产生的荧光信号最强（方差分析，采用Student t检验进行两两比较，*p < 0.05，***p < 0.001）。
肺组织中荧光微球的定量评估及其在胃肠道的生物分布
接下来，我们希望比较经气管（I.T.）与经动脉（I.A.）注射后靶向胎鼠肺组织的效率。为此，在E18孕龄NMRI小鼠中，分别通过I.T.或I.A.途径向胎鼠肺部递送30 μl的荧光微球（每组n=5）。结果显示，与I.A.途径相比，I.T.注射显著提高了荧光微球向胎鼠肺部的递送效率（相对荧光强度分别为1.43 ± 0.56和0.05 ± 0.02，即荧光微球信号与Hoechst信号的比值，方差分析，Student's t检验，*** p<0.001）（图4 a-c）。未处理的对照胎鼠用于校正荧光背景信号。胃肠道在I.T.和I.A.注射的动物中均呈阳性信号（图4 d）。在其他组织或阴性对照动物中均未观察到红色荧光信号（数据未显示）。
胎儿肺部经rAAV2/6.2介导的基因递送后，气管内注射与羊膜腔内注射的比较
在通过注射荧光分子比较两种递送方法后，我们希望评估使用rAAV载体进行气管内（I.T.）和动脉内（I.A.）注射后病毒转导效率及后续的基因表达情况。在E18阶段的NMRI胎鼠中，分别通过气管内注射（n=8）或动脉内注射（n=6）给予受鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子调控的携带萤火虫荧光素酶（fLuc）基因的rAAV2/6.2病毒（3×1010 GC/胎鼠）。经剖宫产出生并寄养后，对存活的仔鼠在出生后1周龄时通过无创生物发光成像（BLI）监测fLuc活性（光子数/秒，p/s）（图5）。气管内注射组的总光子通量显著高于动脉内注射组和阴性对照组（采用方差分析，两两比较使用Student t检验，*p<0.05）。而动脉内注射组的平均BLI信号与阴性对照组相比无显著升高。
正确与错误的胎儿气管内注射之间的区别
正确与错误的气管内注射（I.T.注射）可在多个层面进行区分。在手术过程中，向胎儿气管注射时，若针头位置正确位于气管内，则注射时无明显阻力；而若针头位于气管旁组织，则注射时可感受到较高阻力。其次，在剖宫产时，由于胎儿组织具有半透明特性，可直接观察肺部，从而判断可见染料是否存在于肺内。例如 中国墨水，荧光分子）。另一种评估注射是否准确的方法是光学成像，尤其是生物发光成像（bioluminescence imaging, BLI）。BLI 是一种优雅的非侵入性系统，可用于追踪报告基因——萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）的基因表达，但其空间分辨率和解剖学信息有限。磁共振成像（Magnetic resonance imaging, MRI）则能提供高分辨率的断层图像，包含详细的解剖结构信息。因此，我们研究了将 BLI 与 MRI 结合，以获得叠加图像，将 BLI 的表面信号与深层解剖结构（如内脏器官）的可视化结果进行融合。我们的目标是获取更详细的 体内 基因表达定位信息，以区分正确的与错误的 I.T. 注射。
在多只经尾静脉注射 rAAV2/6.2 CBA-fLuc 和 CBA-LacZnls（3x10⁹）的动物中获取了联合 BL-MR 图像10 每种载体的GC/胎儿数量，n=10）在出生后一周龄时（图6）。生物发光成像显示信号来自颈部及胸腔区域。将磁共振成像与生物发光成像共定位，证实经正确注射后，荧光素酶基因在肺部区域表达。图6 a），但若注射位置错误，则会出现在颈部和腹部区域图6 b）。通过X-gal染色进行的组织学分析证实了 体内 共配准
气管内与羊膜腔内注射后的存活情况
- 荧光微球
通过尾静脉（I.T.）或动脉（I.A.）向 E18 天龄 NMRI 胎鼠注射 30 μl 100 nm 红色荧光分子后，两组胎鼠在出生时的存活率均为 100%，该存活率定义为在胎儿手术后 24 小时收获时仍存活的注射胎鼠数量（表 1）。 - rAAV 载体
通过尾静脉（I.T.）或动脉（I.A.）向胎鼠注射 rAAV2/6.2 后，其出生时的存活率分别为 85.3% 和 86.3%，该存活率定义为胎儿注射后 36 小时剖宫产时仍存活的胎鼠数量（表 1）。早期新生鼠存活率分别为 53.3%（I.T.）和 74.5%（I.A.），该数值通过将寄养后 1 天仍存活的仔鼠数量与最初注射的胎鼠总数进行比较计算得出。为获得上述最终存活率，我们通过以下措施优化了手术的围手术期操作流程：（1）使用吸入式异氟烷作为麻醉剂，替代腹腔注射（I.P.）氯胺酮（75 mg/kg）与美托咪定（1 mg/kg）的混合制剂；（2）术中使用加热垫以防止低体温；（3）使用体视变倍显微镜；（4）操作者对手术流程的经验不断积累与提升。
图1. E18胎鼠的气管内注射。 本图展示了胎鼠气管内（I.T.）注射手术操作的主要步骤。第一步，将一侧子宫角暴露于体外。下一步，在子宫壁及覆盖于其上的胎膜（羊膜和壁层卵黄囊）上缝合一圈荷包缝线，以便后续暴露胎鼠头部。随后，通过子宫切口将胎鼠头部和颈部拉出体外，并使用带两把镊子的5-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线固定于下颌之间，使胎鼠头部保持过伸状态。在体视变焦显微镜（×10放大倍数）下，通过锐性与钝性分离行垂直颈部切口，以暴露胎鼠气管。最后一步，在体视变焦显微镜直视下，将总共30 μl的物质注入气管内。
图2. 实验总体概述。
图 3. 确定气管内注射的最佳体积。 为确定气管内（I.T.）注射的最佳体积，向 E18 期旧胎鼠分别给予 10、20 或 30 μl（n=3/体积）的 100 nm 红色荧光微球，24 小时后取肺组织。细胞核和肌动蛋白纤维分别用 Hoechst 33258 和 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽染色。使用 ImageJ 在线软件定量分析相对荧光强度（代表荧光微球和细胞核染色的红/蓝荧光比值）。数据以均值 ± 标准差表示，采用方差分析，两两比较采用 Student t 检验，*p<0.05，***p<0.001。
图4. 肺组织中荧光微球的定量评估及其在胃肠道中的生物分布。
在E18孕龄NMRI小鼠中，通过(a) 气管内（I.T.）或(b) 羊膜内（I.A.）注射将30 μl红色荧光微球递送至胎鼠肺部，以比较靶向胎鼠肺组织的效率。未处理的对照组胎鼠用于校正荧光背景信号。细胞核和肌动蛋白纤维分别用Hoechst 33258和Alexa Fluor 488标记的鬼笔环肽进行染色。(c) 使用ImageJ在线软件对相对荧光强度（代表荧光微球的红色荧光与代表细胞核染色的蓝色荧光的比值）进行定量分析。(d) 胃肠道在I.T.和I.A.注射的动物中均呈阳性。数据以均值±标准差表示，采用方差分析和Student's t检验，***p<0.001。 点击此处查看高清大图。
图 5. 胎儿肺部经 rAAV2/6.2 介导的基因递送后，气管内注射与羊膜内注射的比较。 注射 rAAV2/6.2（3 × 1010 GC/胎儿，CBA-fLuc）后 1 周的生物发光成像（BLI）信号，以及相应的总光子通量定量分析。所有动物均被黑色隔板分隔扫描，以避免光子散射至邻近动物。伪彩色标尺表示每秒每平方厘米每球面度的光子通量（p/s/cm2/sr）。测量值取自面积为 4.3 cm2 的矩形感兴趣区域。数据以均值 ± 标准差表示，采用方差分析，每组间比较使用 Student t 检验，*p<0.05。本图改编自 Carlon et al., 2010。经 Macmillan Publishers Ltd 授权转载：[Molecular Therapy]（doi:10.1038/mt.2010.153），版权所有 (2010)。 点击此处查看高清大图。
图 6. 胎儿肺部经rAAV2/6.2介导基因递送后，正确与错误胎儿气管内注射的区分。 对出生一周龄时通过气管内注射给予rAAV2/6.2 CBA-fLuc和CBA-LacZnls（每种载体为3×1010 GC/胎儿）的多个动物进行了联合生物发光-磁共振（BL-MR）成像。生物发光成像显示信号来源于颈部和胸腔区域。将磁共振成像（MRI）与生物发光成像（BLI）进行共定位分析后发现，在正确注射情况下，荧光素酶基因表达位于肺部区域 (a)，而在错误注射后则位于颈部和腹部区域 (b)。组织学分析证实了体内的共定位结果。比例尺 = 100 μm。该图改编自 Carlon et al., 2010。 点击此处查看高清大图。
| 注射物质 | 注射方法 | 存活至分娩率 a | 寄养存活率 b | 早期新生儿存活率 c |
| fluospheres | I.T. | 100 (8/8) | n.a. | n.a. |
| I.A. | 100 (5/5) | n.a. | n.a. | |
| rAAV2/6.2 | I.T. | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| I.A. | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
表1. 胎儿经气管及羊膜腔内注射后的存活情况 a 存活至分娩， 即 胎儿手术后及剖宫产前，寄养前。 b 仅当幼崽呈粉红色、活动且呼吸正常时，才会进行寄养。 c 早期新生存活率表示为初始注射幼崽数量的函数。缩写：I.T. 气管内注射；I.A. 羊膜腔内注射；n.a. 不适用。
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讨论
关键步骤
- 我们选择使用的实验小鼠品系为NMRI小鼠，因为其产仔数较多（平均每窝14.4 ± 1.8只，本实验室数据），对干预操作耐受性良好，且具有优良的母性特征。
- 将荷包缝线穿过子宫壁和胎膜是关键步骤，因为仅需暴露胎儿头部而不能暴露肩部，否则在不造成创伤的情况下几乎无法重新调整位置。
- 胎儿头部充分后仰至理想位置至关重要，以便在气管正上方准确进行切口，从而避开与气管平行走行的大血管（颈静脉）。
- 在手术显微镜下直观地观察针头插入胎儿气管的过程非常重要，以避免注射位置错误。
- 将胎儿头部无创地复位回子宫囊内十分关键，因为必须避免损伤胎儿头部，否则会增加宫内或出生后的死亡率。
- 母鼠仅在剖宫产时间点通过颈椎脱位处死，而非最初使用CO2窒息法，因为后者会对胎儿的存活能力产生不利影响。
- 交叉哺育可显著提高经处理胎儿的存活率；据我们观察，手术操作后的胎儿若经自然阴道分娩，其存活率仅为18.6±16.9%，而未注射的对照组仔鼠存活率为62±14...
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致谢
M.C. 和 A.V.d.P. 是由佛兰德斯科学与技术发展创新促进研究所（IWT-Vlaanderen）资助的博士研究员。J.T. 持有鲁汶大学医院（UZ Leuven）的兼职临床研究奖学金（KOOR）。D.V. 是由鲁汶大学（KU Leuven）资助的博士研究员，项目编号 DBOF/10/062。M.M.d.C. 是由巴西国家研究与发展委员会（Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento，CNPq）和伊拉斯谟世界计划（Erasmus Mundus）资助的博士研究员。本研究由佛兰德斯科学与技术发展创新促进研究所（IWT-Vlaanderen）、欧盟 DIMI 项目资助（EC grant DIMI，LSHB-CT-2005-512146）以及鲁汶大学（KU Leuven）的活体分子影像研究组（In vivo Molecular Imaging Research group，IMIR）资助。我们谨向由 James M. Wilson 创立的宾夕法尼亚大学病毒载体核心实验室（UPenn Vector Core）致谢，感谢他们慷慨提供用于重组腺相关病毒载体（rAAV）生产的 AAV6.2 包装质粒。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NMRI 小鼠 | Janvier，法国勒热内圣伊勒 | ||
| 异氟烷 | Isoba，Intervet / Schering-Plough Animal Health，英国米尔顿凯恩斯 | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon，比利时格罗特比哈尔登 | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon，比利时格罗特比哈尔登 | ||
| 50 μl 汉密尔顿玻璃注射器，型号 1710.5 TLLX SYR | Hamilton，美国内华达州里诺 | 5495-20 | |
| 30G 锐利针头 | Hamilton，美国内华达州里诺 | 7762-03 | |
| 2% 利多卡因 | AstraZeneca，荷兰佐特梅尔 |
参考文献
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