基于结构的药物设计在药物研发中发挥着重要作用。并行追求多个靶点可显著提高先导化合物发现的成功率。以下文章重点介绍了西雅图传染病结构基因组学中心如何采用多靶点策略，实现流感病毒A型PB2亚基从基因到结构的测定。
方法文章
流感病毒聚合酶PB2亚基基因至结构解析的多靶点并行处理方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
高致病性流感病毒株的大流行可能在全球范围内导致人类群体中广泛的发病和死亡。仅在美国，每年平均就有41,400人因感染流感病毒而死亡，186万人因此住院1。聚合酶基本蛋白2亚基（PB2）的点突变已被证实与病毒在人类中的适应性有关2。这些研究结果揭示了PB2作为毒力因子的生物学意义，从而凸显其作为抗病毒药物靶点的潜力。
美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）提出的功能基因组学项目为Emerald Bio及美国西北太平洋地区的其他三家机构提供资金支持，这些机构共同组成了传染病结构基因组学西雅图中心（SSGCID）。SSGCID致力于向科学界提供NIAID A至C类病原体的蛋白质三维结构。将此类结构信息向科学界公开，有助于加快基于结构的药物设计进程。
基于结构的药物设计在药物开发中发挥着重要作用。通过靶向一个通路或整个蛋白质家族，并行追求多个靶点，可显著提高新先导化合物发现的成功几率。Emerald Bio 开发了一条高通量、多靶点并行处理流程（MTPP），用于从基因到结构的测定，以支持该合作项目。本文描述了用于测定四种不同甲型流感病毒株 PB2 亚基结构的实验方案。
方案
方案的概述见图1。
分子生物学
1. 构建设计
使用 Gene Composer 软件设计蛋白构建体及密码子优化的合成基因序列。Gene Composer 软件的使用方法已在其他文献中详细阐述3。
- 使用比对查看模块和构建设计模块比较蛋白质序列比对结果，并定义蛋白质构建体。若条件允许，将目标氨基酸序列与蛋白质数据库（PDB）中同源蛋白的初级结构和三维结构元素进行比对（图2）。
- 利用比对信息，基于同源蛋白初级结构和三维结构的保守性，选择新的末端以进行结构指导的构建体设计。
- 设计插入片段PCR（iPCR）和载体PCR（vPCR）的扩增引物（末端引物）。
- 利用Gene Composer的蛋白质到DNA算法，将构建体的氨基酸序列反向翻译为密码子优化的核酸序列。
- 使用合适的密码子使用表（CUT），对序列进行优化，以实现在E. coli中的高效表达。
- 在虚拟环境中将插入片段克隆至经修饰的pET28载体中，该载体包含N端6×组氨酸标签以及Smt3/SUMO融合蛋白，便于后续纯化。
- 通过DNA 2.0平台订购合成基因，并从Integrated DNA Technologies公司订购引物。
2. 聚合酶不完全引物延伸（PIPE）克隆
- 准备引物和基因
- 将供应商提供的含有引物的板在 1,000 rpm 下离心 1 分钟。
- 用 TE 缓冲液将引物浓度调整至 100 μM，并加入 50 μl TE 缓冲液。
- 在 96 孔 V 型底板中，用去离子水（DI 水）将引物稀释至 10 μM。
- 将供应商提供的基因在 1.5 ml 离心管中以 1,300 rpm 离心 1 分钟。
- 使用 TE 缓冲液，将每管 DNA 浓度调整至 50 ng/μl。
- 在 1.5 ml 离心管中，将每种引物稀释至 10 ng/μl。
- 不使用时，将引物和基因储存于 -20 °C。
- 准备插入片段 PCR（iPCR）
- 将一管 Pfu Master Mix 冰上解冻；引物和基因保持室温。
- 创建板图，为每组引物和构建体分配相应的孔位。
- 向 96 孔 PCR 板的每个孔中加入 13 μl 去离子水（DI 水）。
- 根据板图，向 96 孔板中每个反应孔加入 5 μl 正向引物和 5 μl 反向引物，确保每加一个孔都更换吸头。
- 根据板图，向相应孔中加入 2 μl 完整长度的基因。
- 向每个孔中加入 25 μl Pfu 预混液，确保每加一个孔都更换吸头。
- 使用以下 PCR 条件进行扩增循环：
- 95 °C 2 分钟
- 95 °C 30 秒
- 50 °C 45 秒
- 68 °C 3 分钟
- 4 °C ∞
- 重复步骤 b-d 共 25 个循环。
- 将每个 iPCR 反应的 10 μl 转移至新的 96 孔 PCR 板中。
- 向每个样品中加入 3 μl 6X 上样染料。
- 在 1% TAE 含溴化乙锭（EtBr）琼脂糖凝胶上，以 110 V 电泳分离各样品，并与 100–500 bps DNA Marker 一同运行，以确认片段扩增。
- 不使用时，将 iPCR 产物储存于 -20 °C（尽量避免反复冻融）。
3. 准备载体PCR（vPCR）
- 接种含有 pET28 载体质粒的转化大肠杆菌（E. coli）进行过夜培养。
- 用含 50 μg/ml 卡那霉素的 2-YT 培养基分别接种两管 5 ml。
- 在 37 °C、220 rpm 摇床中过夜培养。
- 过夜培养后，以 3,000 rpm 离心 15 分钟沉淀菌体。
- 使用 Qiagen QIAprep Spin Miniprep 试剂盒，按照制造商说明书从细菌沉淀中提取 pET28 载体质粒。
- 对提取的 pET28 质粒进行限制性内切酶消化。
- 向 20 μl pET28 载体中加入 2.2 μl 10X BamHI 缓冲液以及 1 μl BamHI 和 HindIII 酶。
- 在 37 °C 下孵育反应体系 1 小时。
- 通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。
- 参见步骤 2.2.10。
- 从凝胶中切下载体条带，并使用 QIAquick Gel Extraction Kit 按照说明书进行纯化。
- 使用 NanoDrop 测定 DNA 浓度。
- 将酶切后的载体稀释至 10 ng/μl。不使用时储存于 -20 °C。
- 准备 vPCR 引物。
- 将 IDT 提供的寡核苷酸以 1,300 rpm 离心 1 分钟。
- 用去离子水（DI 水）将浓度调整至 100 μM。
- 在 1.5 ml 离心管中分别配制正向和反向引物的 10 μM 稀释液。
- 将引物原液及稀释液储存于 -20 °C。
- 将 Pfu Master Mix 冰上融化，模板和引物室温解冻。
- 在 96 孔 PCR 板中设置 vPCR 反应体系：
- 在 96 孔板的第一行中加入 60 μl 正向和反向 vPCR 引物以及 24 μl 消化后的 pET28 模板（10 ng/μl）。
- 使用 12 道多通道移液器，将 12 μl 引物与模板混合液转移至板中其余各孔。每孔最终含有 12 μl 引物与模板混合液。
- 向每孔加入 13 μl 去离子水。
- 向每孔加入 25 μl Pfu Master Mix。
- 按照步骤 2.2.7 中的 PCR 条件进行扩增循环。
- 将所有 vPCR 反应产物汇集至一个 15 ml Falcon 管中。
- 取 10 μl 混合后的 PCR 产物进行凝胶电泳，验证片段扩增情况（预期消化后 pET28 载体长度约为 6 kb）。
- 参见步骤 2.2.10。
- 准备合并板。
- 将 3 μl vPCR 产物分装至 96 孔 V 底板的每一孔中。
- 合并板储存于 -20 °C，待与 iPCR 产物合并使用。
4. 合并 iPCR 和 vPCR 产物
- 将iPCR产物和预先分装的vPCR 96孔合并板在室温下解冻。
- 向合并板的每个相应孔中加入3 μl的iPCR产物。
- 将合并板转化至Top Ten化学感受态细胞中。
- 将每份合并反应液2 μl加入一个50 μl的商用化学感受态细胞管中，并按照制造商提供的操作步骤进行后续处理。
- 从转化平板中为每个构建体准备过夜培养物。
- 用无菌技术从25 ml无菌储液瓶中向深孔块的每个孔分装5 ml TB培养基（含50 μg/ml卡那霉素）。
- 采用无菌操作，从每个转化平板上挑取单个孤立菌落，接种至深孔块相应的孔中。
- 用Airpore膜密封深孔块。
- 在37 °C、220 rpm条件下振荡培养过夜。
- 将深孔块以4,000 rpm离心30分钟，沉淀细胞。
- 倒去上清液，并用纸巾轻拍深孔块顶部使其干燥。
- 根据制造商说明书，使用Qiagen 96孔真空装置进行质粒小提。
5. 准备成功克隆构建体的甘油菌种
- 根据制造商说明书，将经验证的已成功克隆的DNA序列转化至BL21(DE3)化学感受态细胞中。
- 针对每个构建体，从BL21(DE3)转化产物中挑取单个孤立菌落，接种至1 ml含50 μg/ml卡那霉素的2-YT液体培养基中。
- 在37 °C条件下，以220 rpm振荡培养3–4小时。
- 用唯一的构建体编号、菌株名称和日期标记一个1.5 ml螺口管，加入500 μl 50%甘油和500 μl菌液，颠倒混匀数次。立即将甘油菌保存于干冰或-80 °C冰箱中。
6. 表达检测
| 裂解缓冲液r | 洗涤缓冲液 | 洗脱缓冲液 |
| 50 mM NaH2PO4，pH 8.0 300 mM NaCl 10 mM 咪唑 1% 吐温-20 2 mM MgCl2 0.1 μl/ml 苯并酸 1 mg/ml 溶菌酶 | 50 mM NaH2PO4，pH 8.0 300 mM NaCl 20 mM 咪唑 0.05% Tween 20 | 25 mM Tris，pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑 0.05% Tween 20 |
* 裂解前立即加入Benzonase、溶菌酶和蛋白酶抑制剂。
- 从甘油菌种中取样，在含卡那霉素的筛选琼脂平板上划线，并于37 °C过夜培养。
- 在96孔圆底培养板中启动非诱导性预培养；用新鲜培养的 E. coli 单菌落接种1.2 ml TB液体培养基（含50 mg/ml卡那霉素）并补充0.5%葡萄糖。于37 °C、220 rpm振荡培养过夜。
- 过夜培养后，取40 μl预培养物接种至1.2 ml TB液体培养基（含50 mg/ml卡那霉素）中，并添加Novagen Overnight Express System 1（按照生产商说明书），启动诱导培养。
- 将小规模诱导培养物于20 °C、220 rpm振荡培养48小时。
- 以4,000 rpm离心15分钟收集细胞，弃去上清液，将细胞沉淀于-20 °C保存至少1小时后再进行后续处理。
- 在96孔板中，将细胞沉淀重悬于300 μl裂解缓冲液中。
- 室温下在裂解缓冲液中孵育细胞30分钟，随后在室温下剧烈振荡30分钟进行机械裂解。
- 于4 °C、4,000 rpm离心30分钟，澄清粗裂解液。
- 使用多通道移液器将200 μl澄清裂解液（可溶性组分）转移至96孔平底板（Qiagen）。对每孔样品加入40 μl Ni-NTA磁珠（Qiagen）。
- 在16 °C下，将板置于摇床上轻柔振荡1小时。
- 将板置于磁力架（Qiagen）上，移除未结合的可溶性组分。注意避免吸出Ni-NTA磁珠。
- 将板从磁力架上取下，用200 μl洗涤缓冲液轻柔重悬磁珠，上下吹打30秒，然后将板重新放回磁力架上。
- 移除洗涤缓冲液，并重复步骤6.12。
- 将板从磁力架上取下，加入50 μl洗脱缓冲液，洗涤5分钟，以洗脱Ni-NTA结合的目标蛋白。
- 将平底板放回磁力架，将洗脱液转移至新的96孔V型底板中。
- 取20 μl洗脱液转移至新的96孔V型底板中，加入1 μl ULP1蛋白酶进行反应。
- 按照生产商说明书，使用LabChip 90通过毛细管电泳分析洗脱组分及洗脱+Ulp1处理组分。
- 或者，可通过SDS-PAGE分析表达测试中的所有组分。
7. 大规模发酵
- 使用无菌移液器吸头从甘油菌种中取刮菌，接种于100 ml TB培养基（含50 mg/ml 卡那霉素）中，37 °C、220 rpm 振荡培养过夜。
- 过夜培养后，取10 ml预培养物（1:100稀释）接种于含EMD自诱导溶液（参见生产商说明书）的1 L TB培养基（含50 mg/ml 卡那霉素）中，置于2 L挡板摇瓶中扩大培养。
- 在37 °C下振荡培养扩大后的1 L培养物；当光密度达到0.6（OD600）时，将摇床培养箱温度调至20 °C。
- 过夜培养后，从每种构建体中取10 ml代表性等分试样用于表达检测。
- 在5,000 rpm下离心15 min收集菌体沉淀，弃去上清液。
- 将菌体沉淀于-80 °C冷冻保存。
蛋白质纯化
缓冲液：
| 裂解缓冲液 | 缓冲液 A（平衡） | 缓冲液 B（洗脱） | 分子筛柱缓冲液 |
| 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCl 0.5 % Glycerol 0.02 % CHAPS 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginine 5 μl Benzonase 100 mg Lysozyme 3 Protease Inhibitor Tablets (EDTA-free) | 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCl 10 mM Imidazole 1 mM TCEP 50 mM Arginine 0.25% Glycerol | 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCl 200 mM Imidazole 1 mM TCEP | 25 mM Tris, pH 8.0 200 mM NaCl 1% Glycerol 1 mM TCEP |
* 裂解前立即向每份150 ml样品中加入Benzonase、溶菌酶和蛋白酶抑制剂片剂。
8. 细胞裂解
- 配制 2 L 裂解缓冲液；不要加入溶菌酶、蛋白酶抑制剂片剂或苯并核酸酶（每个样品将分别在 150 ml 裂解缓冲液中进行裂解）。
- 在 4 °C 条件下，按照 1:5 的质量体积比，将细胞沉淀在裂解缓冲液中充分重悬，并剧烈搅拌 30 分钟。使用洁净的刮勺将烧杯壁上的团块刮下。在此期间，配制镍柱缓冲液和透析缓冲液。
- 在冰上使用 Misonix 超声破碎仪裂解细胞（70% 功率，2 秒开启/1 秒关闭，持续 3 分钟），并轻轻旋转容器以防止过热。保留少量（200 μl）粗裂解液用于后续分析。
- 将粗裂解液在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 35 分钟，澄清后收集上清液，并保留少量（200 μl）用于后续分析。将沉淀在 4 °C 保存，直至确认目标蛋白已溶于可溶性组分中。
9. 预运行蛋白质标准品设置
- 打开蛋白纯化仪并启动软件，初始化仪器。
- 初始化完成后，为每个样品在支架的不同管线上连接一个 5.0 ml GE Healthcare HisTrap FF 镍螯合柱（Ni 柱）。
- 用 3–4 柱体积（CV）的平衡缓冲液冲洗每个柱子。
- 对平衡缓冲液和洗脱缓冲液管线进行预灌注。
- 通过柱子吸取一次缓冲液 A，以平衡柱子。
10. 镍1 (Ni1) 柱
- 用 20 ml Milli-Q 水洗涤每个层析柱，以去除保存缓冲液。依次上样 5 ml 缓冲液 B 和 25 ml 缓冲液 A 进行平衡。
- 以 2 ml/min 的流速将含有可溶性蛋白的澄清裂解液上样至层析柱，随后用 15 ml 缓冲液 A 洗涤。
- 使用缓冲液 A 和缓冲液 B 以梯度洗脱方式分步洗脱结合的蛋白，洗脱比例依次为：5 ml 95:5、5 ml 60:40、10 ml 0:100。分别收集各洗脱组分。
- 分析：通过 SDS-PAGE 检测洗脱组分、粗裂解液、澄清裂解液及穿流组分。合并含有目标蛋白的组分，并使用 Nanodrop 测定 A280，以粗略确定蛋白含量。
11. ULP1 切割
- 保留少量（250 μl）Ni1 柱流出液用于后续凝胶分析。将剩余的 Ni1 流出液补至 10 ml，并按每 5 mg 总蛋白加入 1 μl 泛素样蛋白酶 1（ULP1），以切除 His-Smt 亲和标签。
- 将Ni1洗脱组分与ULP1一起在4 °C下，于10 kDa截留分子量（MWCO）透析袋中，置于2 L缓冲液A中，在4 °C的搅拌平台上透析4小时。
- 透析后，对Ni1上清液及Ni1上清液+ULP1进行SDS-PAGE分析，以确定ULP1切割是否成功。
12. 镍2 (Ni2) 柱
- 将切割后的蛋白质加载到同一镍柱上，并以1 ml/min的较低流速重复步骤9.3。切割下来的标签会结合到柱子上，而无标签的目标蛋白则会穿透流出。用新的容器收集穿透液。
- 用3 ml缓冲液A洗涤镍柱，随后用5 ml缓冲液B洗脱所有带His标签及非特异性结合的蛋白质。分别收集各洗脱组分。
- 对镍柱第二次穿透液、洗涤液和镍柱第二次洗脱组分进行SDS-PAGE分析，以验证ULP1是否完成切割，并确认目标蛋白存在于穿透液中。使用Nanodrop测定A280值，粗略判断蛋白质的存在。
13. 浓缩
- 使用 Amicon Ultra 10 kDa 截留分子量离心管，在 4 °C、4,000 rpm 条件下分次离心（每次 10 分钟），将 Ni2 穿流液（以及含蛋白时的 Ni2 洗脱液）浓缩至 5 ml。每次离心后用移液器混匀，以防止蛋白质在膜上过度浓缩。
14. 尺寸排阻色谱法（SEC）
- 在AKTApurifier系统（GE Healthcare）上，以0.5 ml/min的流速用200 ml SEC缓冲液平衡Sephacryl S-100 10/30 GL柱（GE Healthcare），完成柱子的准备。
- 根据制造商说明书，准备用于SEC柱的10 ml超大进样环（superloops）。
- 使用5 ml注射器将样品加载至超大进样环，并开始进行SEC运行。
- 在收集小体积组分的同时，监测280 nm处的紫外吸收信号。
- 通过SDS-PAGE分析SEC各组分。
- 合并显示最强条带的SEC组分。
- 浓缩合并后的SEC组分。参见步骤13.1。
- 将蛋白分装为每份100 μl，液氮中速冻后于-80 °C保存。
结晶
15. 蛋白质结晶
- 在96孔Compact Jr结晶板（Emerald Bio）的每个储液槽中预先加入80 μl所选的结晶筛选溶液（Emerald Bio）。
- 用尺寸排阻缓冲液将蛋白质稀释至2–20 mg/ml，并置于冰上保存。
- 向96个孔中的每一个孔加入0.4 μl蛋白质溶液和0.4 μl结晶筛选溶液，然后用透明晶体密封膜（Manco）密封。
- 将该板置于16 °C下保存，并在接下来的几周内定期在解剖显微镜下检查蛋白质结晶情况。
16. 晶体收获
- 利用母液和乙二醇配制冷冻保护剂。用剪刀剪开覆盖在含有目标蛋白晶体的孔上的透明胶带。向一个空孔中加入1.6 μl相应的结晶条件溶液，并加入0.4 μl乙二醇，最终得到含20%乙二醇和80%结晶条件溶液的混合液。注意：为优化晶体衍射质量，可尝试使用不同的冷冻保护剂，例如甘油、油类、低分子量聚乙二醇，或不同浓度的冷冻保护剂。
- 在捞取晶体前，将一个ALS型样品托盘置于装有液氮的杜瓦瓶中冷却，并盖上盖子。
- 选择内径与晶体尺寸相匹配的冷冻环，将其安装在磁性晶体捞取棒（Hampton Research）上，从孔中溶液直接捞取晶体。
- 立即将捞取到晶体的冷冻环浸入冷冻保护剂中，随后迅速放入ALS型样品托盘中进行速冻。根据需要重复此步骤以处理多个晶体。
17. 晶体筛选/数据收集
- 完成收获后，使用样品托盘棒将磁性冷冻样品托盖放置在ALS样品托上。用弯曲的镊子将样品托翻转至倒置状态。
- 将样品托转移至Rigaku ACTOR杜瓦瓶中，将样品托推杆拧在样品托上，然后冲掉盖子，使其留在杜瓦瓶内，且销钉朝上。
- 使用JDirector软件，在以下参数下对每个晶体进行筛选：光束狭缝设为0.5度，探测器距离设为50 mm，图像步进设为70度，曝光时间设为30秒。
- 对使用JDirector拍摄的测试图像运行Mosflm程序，以确定最佳晶体及数据收集策略。
- 根据Mosflm的分析结果，收集完整的数据集。
18. 数据处理/结构测定
- 使用 XDS/XSCALE4 处理数据集。
- 打开 CCP4 软件套装。
- 若有高同源性搜索模型，运行 Phaser5 进行分子置换求解。本例中使用 PDBID 3CW4 作为搜索模型6。
- 运行 Refmac7，利用数据集中收集的观测反射数据对分子模型进行精修。最终分辨率应基于最高分辨率壳层，并依据以下参数确定：R 因子 > 50%，I/sigma > 2，以及数据完整度 > 90%。
- 使用分子图形软件 COOT8 构建三维电子密度模型。
- 在将结构提交至 PDB 之前，使用 MolProbity9 软件进行验证，以确认结构质量符合提交要求。
结果
以下结果展示了所述实验方案的预期结果，以及PB2的实测结果。
利用 Gene Composer 设计了流感病毒聚合酶亚基 PB2 的五个全长目标氨基酸序列（图2）。这些 PB2 序列经过反向翻译并经历多种工程化步骤3，最终获得密码子协调优化的序列，适用于在 E. coli. 中表达。从 iPCR 产物（图3b）中，共成功将三十四种构建体通过 PIPE 克隆技术3插入至一种经修饰的 pET28 载体系统10中，并带有 N 端 6x His-Smt 融合标签，如图3a所示。克隆工作流程的概要见图4。
成功克隆后，在BL21(DE3) E. coli 细胞中对每个构建体进行小规模蛋白表达检测。细胞在添加Novagen Overnight Express 1培养基的TB培养基中，于220 rpm振荡培养箱中20 °C培养48小时。培养完成后，收集细胞，并使用Caliper LabChip 90进行毛细管电泳检测可溶性蛋白的表达情况。在34个PB2构建体中，有14个能够表达可溶性目标蛋白，进入大规模发酵阶段。每个构建体的大规模培养均按照生产商说明书，在TB培养基中添加Novagen Overnight Express 1培养基进行。培养完成后，通过离心收集细胞，并在-80 °C保存。在进行大规模纯化之前，通过SDS-PAGE分析确认每种培养物的大规模蛋白表达情况（图5）。
使用Protein Maker对14种PB2构建体进行了并行纯化。将这14种构建体的澄清裂解液依次通过镍螯合柱。通过SDS-PAGE确定含有目标蛋白的洗脱组分后，分别合并各样本对应的组分，并通过A280读数测定其浓度。通过加入ULP1酶并进行过夜透析，随后再经第二次镍柱处理，以切除6x His-Smt标签。通过SDS-PAGE确认His-Smt标签的切除效果（图6），然后使用10 kDa Amicon Ultra离心管对各样本进行浓缩。使用Amicon Ultra离心管浓缩后，各样本再经分子筛柱层析以获得可用于晶体生长的纯度。随后进行第二次浓缩，以将蛋白浓度提高至适合结晶的水平。所有14种构建体均成功纯化，并进入结晶试验阶段。
通过解冻先前冷冻的蛋白质来启动结晶。结晶在温湿度受控的房间内进行 16 °C 使用特别设计的板（Emerald Bio）进行悬滴蒸汽扩散（图7）。初步筛选采用四种稀疏矩阵筛选试剂盒进行：JCSG+、Pact、Wizard Full 和 CryoFull（Emerald Bio），遵循扩展的纽曼策略。 0.4 μl 蛋白溶液随后与 0.4 μl 从相应的储液池中使用96孔Compact Jr结晶板（Emerald Bio）吸取结晶液（或储液溶液）。在十四种纯化样品中，有九种获得了适合衍射研究的晶体（图8). 使用配备Osmic VariMax HF光学系统和Saturn 944+ CCD探测器的Rigaku SuperBright FR-E+旋转靶X射线发生器，在Cu Kα波长下对九个结晶构建体中的五个收集了实验室内部的衍射数据集（图9）。每个数据集均使用 XDS/XSCALE 进行处理4 并缩放至最终分辨率。使用分子置换法尝试求解结构 Phaser 5 来自 CCP4 套件 7最终模型经 REFMAC 精修后获得 7 以及通过手动重建 Coot 11. 采用几何形状和适配度评估并校正结构MolProbity 9. 共确定了四种PB2亚基的结构（图10）并存入PDB。 图11 展示了MTPP流程中每个阶段的整体结果。
图 1. 在 Emerald Bio 实现多靶标并行处理的 SSGCID 基因到结构通路概览。
图2. Gene Composer软件中的比对查看器与蛋白质构建设计模块。目标蛋白的氨基酸基础构建显示为绿色（中间窗口），基于结构指导的替代构建截短形式显示为金色（底部窗口）。 多个流感病毒PB2序列的比对结果与PDBID 3CW4的C端结构域序列及其二级结构元件进行比较。了解该结构域及其二级结构元件后，可在Gene Composer设计模块中通过右键点击目标氨基酸残基来选择N端截短方案。 点击此处查看高清图像。
图3a. PIPE克隆示意图，其中合成基因插入片段（橙色）通过设计的正向（红橙色线条）和反向（橙蓝色线条）引物扩增，生成插入片段PCR产物。 表达载体则使用反向（红黑色线条）和正向（蓝黑色线条）引物扩增，生成载体PCR产物。插入片段PCR产物（iPCR）的末端序列与载体PCR产物（vPCR）的末端序列互补（iPCR的红色部分与vPCR的红色部分互补，iPCR的蓝色部分与vPCR的蓝色部分互补）。这种互补性使得iPCR和vPCR产物能够退火形成质粒，并在转入宿主BL21(DE3)化学感受态E. coli细胞后进行复制。
图3b. PB2亚基iPCR产物的琼脂糖凝胶分析。 iPCR失败表现为微弱或弥散的条带，而成功的iPCR产物则呈现清晰、强健的条带。iPCR产物的质量通常与克隆成功率相关。分子量标记物单位为千道尔顿（kDa）。该图引自Raymond et al., 201112。
图 4. 使用 Gene Composer 软件进行靶标 PB2 蛋白的基因工程步骤。 在为每个靶标建立优化的核酸序列后，分别为其设计了 6–7 种不同的蛋白构建体。在基因设计与克隆的初始阶段对多个靶标进行并行处理，共获得 34 种构建体，其中 14 种为可表达可溶性蛋白的有效靶标，在 E. coli 中成功表达。
图5. 大规模发酵的代表性SDS-PAGE分析，显示强烈的蛋白质表达（预期大小为25.76 kDa），约50%为可溶性（第4泳道），洗脱蛋白中约50%的6x His-Smt标签被切割（第7泳道）。
图6. 聚合酶PB2亚基三种构建体的SDS-PAGE结果。 第1泳道：分子量标记物（左侧标注，单位为kDa）；第2、6、10泳道：来自镍柱1的合并蛋白；第3、7、11泳道：镍柱2中在缓冲液A中洗脱的切割后蛋白的穿流组分；第4、8、12泳道：在缓冲液B中从镍柱2去除6x His-Smt标签后的蛋白。
图7. 采用悬滴法进行蒸汽扩散的示意图。 蛋白质结晶的悬滴法属于蒸汽扩散法的一种。该方法将纯化的蛋白质样品与沉淀剂混合后，置于与含有较高浓度相同条件溶液的较大储液池相对平衡的环境中。随着水分从蛋白质样品中蒸发并转移至储液池，沉淀剂浓度逐渐升高，达到适合蛋白质结晶的最佳水平。
图8. 来自一种流感病毒株的聚合酶PB2亚基蛋白晶体。
图9. 来自一种流感病毒株的聚合酶PB2亚基的X射线衍射图像。
图 10. 4 个 PB2 结构晶体学不对称单元中分子的带状图。 二级结构以彩虹色模式着色，并标注相应的 PDB 编号。(a) 3K2V (A/Yokohama/2017/2003/H3N2) (b) 3KHW (A/Mexico/InDRE4487/2009/H1N1) (c) 3KC6 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1) (d) 3L56 (A/Vietnam/1203/2004/H5N1)。
图 11. 采用所述方法对流感病毒 PB2 靶标进行结果分析。 结构解析流程分为五个步骤进行说明：克隆、溶解性分析、纯化、结晶及结构解析。
讨论
多靶点并行处理
基于结构的药物设计在药物发现中起着重要作用。SSGCID 致力于向科学界提供来自 NIAID A-C 类病原体的三维蛋白质结构。广泛提供此类结构信息，最终将促进基于结构的药物设计的加速发展。
MTPP 方法的第一个关键步骤是构建体设计。针对每个靶蛋白设计多个构建体，可提高成功解析结构的概率，并加快周转速度。在流程的各个阶段，部分蛋白构建体失败是不可避免的。采用 PIPE 克隆方法可支持 MTPP 方法，能够在 96 孔板中快速生成大量构建体，而无需耗时的纯化步骤。将 PIPE 克隆与在相同 96 孔板格式中分析蛋白表达的能力（Caliper LabChip 90）相结合，可进一步加快整体流程。这些方法的结合使得能够快速鉴定出可产生可溶性蛋白的构建体，从而确保大规模蛋白表达与纯化的成功。
MTPP高通量技术成功的关键要素之一是Protein Maker（美国专利号6818060，Emerald Bio）仪器。Protein Maker是一种24通道并行液相色谱系统，专为提高高通量蛋白质生产和相关结构基因组学研究流程的效率而开发。与传统的单通道FPLC系统相比，采用前述Protein Maker操作方案时，其优势显而易见。单名操作人员可在八小时内并行纯化多达48个目标蛋白。相比之下，使用单通道FPLC系统的单名操作人员在同一时间段内最多只能纯化四个目标蛋白。利用Protein Maker获得的每个目标蛋白均能达到高水平的纯度，这对于后续蛋白质晶体生长以进行结构分析的成功至关重要。
局限性与故障排除
通过X射线晶体学解析三维结构是一项多阶段的工作，面临诸多挑战，其中之一是难以获得大量可溶性的目标蛋白。为克服溶解度问题，可采用的一种策略是使用替代表达宿主，因为E. coli细胞无法完成多种重要的真核生物翻译后修饰。在能够完成这些翻译后修饰的酵母、昆虫和哺乳动物细胞系中进行表达，通常是合适的替代方案。有时目标蛋白虽能表达，但在标准裂解条件下完全不溶。如Smith et al. 201113所述，Protein Maker可用于快速测试替代的细胞裂解条件，是一种宝贵的资源。这一策略通常对于保持目标蛋白在结构研究流程中的推进至关重要。在任何结构基因组学流程中，标准化的实验方案可能并不适用于每一个进入流程的目标蛋白，因此可能需要对各个目标进行个性化优化。例如，我们选择在每种情况下均使用20%乙二醇作为冷冻保护剂。当该条件不适用时，可能需要测试其他冷冻保护剂或不同浓度。
由于每种目标蛋白具有独特性，结构解析过程中耗时且难以预测的关键步骤是结晶。MTPP 流程通过从初始稀疏矩阵筛选开始进行优化，弥补了蛋白质结晶通常成功率较低的问题。来自商业化稀疏矩阵筛选的每一个初步结晶结果，均会进一步使用 E-Screen Builder（Emerald Bio）进行优化。优化筛选围绕初步结晶条件设计，调整缓冲液、盐类和添加剂的浓度。成功的优化筛选可获得适用于衍射研究和结构解析的晶体。
美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）提出的功能基因组学项目为Emerald Bio及美国西北地区的其他三家机构提供资金支持，这四家机构共同组成了SSGCID（Emerald Bio、SeattleBiomed、华盛顿大学和太平洋西北国家实验室）。该联盟的每个成员均因其在应用尖端技术以实现NIAID结构基因组学项目目标方面的专长而被选中。迄今为止，SSGCID已向蛋白质数据库（PDB）提交了461个结构，使其成为全球第七大贡献者，并在2011年成为全球产出最多的机构。SSGCID提供的实验方案与方法旨在造福科学界，并推动传染病相关研究的持续发展。
披露
作者是 Emerald Bio, Inc. 的员工。
致谢
作者谨向SSGCID联盟的所有成员致以感谢。SSGCID目标的实现得益于Emerald Bio全体团队成员的巨大努力。本研究由美国国家过敏与传染病研究所、美国国立卫生研究院及美国卫生与公共服务部资助，联邦合同编号为HHSN272200700057C。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 引物 | IDT | ||
| 基因 | DNA 2.0 | ||
| TE缓冲液 | Qiagen | 试剂盒中提供 | |
| 96孔半裙边PCR板 | VWR | 10011-248 | |
| PFU Master Mix | |||
| 6X橙色上样染料 | Fermentas | R0631 | |
| 10X TAE | Teknova | T0280 | |
| 琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414-10G | |
| pET28载体 | |||
| 2-YT肉汤 | VWR | 101446-848 | |
| 卡那霉素 | Teknova | K2151 | |
| 限制性内切酶 | Fermentas | ||
| QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| Top 10化学感受态细胞 | Invitrogen | C4040-06 | |
| 一次性槽（无菌，25 ml） | VWR | 89094-662 | |
| 透气盖膜（用于生物培养的涤纶薄膜） | VWR | 60941-086 | |
| 24孔块 | VWR | 13503-188 | |
| QIAvac 96 | Qiagen | 19504 | |
| BL21(DE3)化学感受态细胞（phageR） | NEB | C2527H | |
| 50%甘油 | VWR | 100217-622 | |
| TB培养基 | Teknova | T7060 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | ||
| 1 M Tris pH 8.0 | Mediatech | 46-031-CM | |
| 5 M NaCl | Teknova | S0251 | |
| 甘油 | Aldrich | G7893-4L | |
| CHAPS | JT Baker | 4145-01 | |
| 咪唑 | Sigma | 56749-1KG | |
| TCEP | Amresco | K831-10G | |
| L-精氨酸 | Amresco | 0877-500G | |
| 苯并核酸酶 | EMD | 70746-3 | |
| 溶菌酶 | USB | 1864525GM | |
| 10 kDa分子量截留透析管 | Thermo | 68100 | |
| Amicon Ultra 10 kDa分子量截留浓缩管 | Millipore | UFC901024 | |
| HisTrap FF柱 | GE | 17-5255-01 | |
| HiTrap螯合柱 | GE | 17/0408-01 | |
| Compact Jr结晶板 | Emerald Bio | EBS-XJR | |
| 结晶筛选试剂盒 | Emerald Bio | ||
| 100%乙二醇 | Emerald Bio | EBS-250-EGLY | |
| 晶体磁力直头镊 | Hampton Research | HR4-729 | |
| 固定式冷冻环（0.1-0.2 mm） | Hampton Research | HR4-955 | |
| ALS型样品托盘（puck） | |||
| 托盘镊（puck wand） | |||
| 弯头镊 | |||
| 托盘推杆（puck pusher） |
参考文献
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