培养表达荧光融合蛋白的分离非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎神经外植体，可实现对生长锥细胞骨架动态的成像观察。
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本文内容
摘要
摘要
轴突导向的复杂过程主要由生长锥驱动，生长锥是生长中轴突末端的动态可移动结构。在轴突延伸过程中，生长锥必须整合多种来源的导向信号信息，以调节其细胞骨架，从而推动自身前进并准确导航，最终找到特定靶标。1在细胞骨架层面，这种整合过程的具体机制仍在探索中，而通过研究生长锥内细胞骨架蛋白及其效应分子的动态变化，有助于阐明这些机制。 非洲爪蟾 生长锥足够大（直径为10-30微米），可进行细胞骨架动态的高分辨率活体成像例如2-4 ）且相较于其他脊椎动物更易于在实验室环境中分离和操作。青蛙是发育神经生物学研究的经典模型系统，关于生长锥微管动态的重要早期发现最初正是利用该系统获得的5-7 在此方法中8，收集卵子并进行受精 体外，注射编码荧光标记的细胞骨架融合蛋白或其他用于调控基因表达的构建体的RNA，随后培养至神经管阶段。通过解剖分离神经管，进行体外培养，并对生长出的神经突起上的生长锥进行成像。本文描述了该方法的实施步骤，其目的是建立培养体系 非洲爪蟾 用于后续的高分辨率图像分析。尽管我们以 +TIP 融合蛋白 EB1-GFP 为例进行说明，但该方法可适用于多种蛋白质，以阐明其在生长锥内的行为。
方案
注意：前两个部分的步骤仅作简要描述，因为已有其他文献发表了更详细且更专注于这些步骤的优秀方案（例如8-12）。此外，处理这些材料的通用操作流程 非洲爪蟾 活细胞培养中脊髓神经元的研究已在一篇详细的方法学文章中发表8我们强烈建议将该文章作为本视频的补充材料进行阅读，尽管在本文中，我们在第3步已提供了足够信息，可成功完成神经管解剖与接种操作并进行故障排查。
1. 体外 受精作用 非洲爪蟾 卵
- 从注射了绒毛膜促性腺激素（400 单位/蛙）12–18 小时后的雌性青蛙中获取卵子。在 1× Marc's Modified Ringer 溶液（MMR）（0.1 M NaCl，2.0 mM KCl，1.0 mM MgSO₄，0.1 mM CaCl₂，5.0 mM HEPES，pH 7.8）中收集卵子。4，2.0 mM CaCl2，5.0 mM HEPES，pH 7.49).
- 受精卵 体外 用剪碎的睾丸组织，如前所述9.
- 至少 20 分钟后，将胚胎置于含 2% 半胱氨酸的 1X MMR 溶液（用 NaOH 调至 pH 7.8）中孵育 3–5 分钟，以去除胚胎的胶状包膜。用 0.1X MMR（或 0.1X MBS....
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讨论
Xenopus laevis 神经外植体在接种于层粘连蛋白/多聚赖氨酸基质后24小时，若条件适宜，会以非常强健的方式长出神经突。在此基质上，生长锥具有高度运动性，轴突长度可延伸至1毫米，从外植体向各个方向延伸，尽管典型长度为100 μm或更长。如果神经突未能长出，可能的原因较为有限。一种可能是神经外植体未能正确贴附于培养皿表面。接种后应避免意外移动培养皿，以免破坏贴附。同时，需确保所使用的层粘连蛋白和多聚赖氨酸包被的培养皿是使用新鲜配制的试剂正确制备的。缺乏神经突延伸的另一个可能原因是细胞培养基条件可能未达到最佳状态。请仔细核对实验方案和计算过程，确保所有培养基溶液均正确配制。最后，获取外植体的胚胎本身可能不健康，但如果胚胎能够发育至神经管阶段，则此问题的可能性较小。然而，最好在进行解剖的同时，将部分完整胚胎在0.1X MMR中继续培养，以确保其发育进程正常持续。
本方案最关键的步骤是神经管的解剖。与许多模式生物胚胎的显微解剖相比，该技术相对简单，且Xenopus laevis胚胎是进行解剖操作时尺寸最大、容错性最高的生物之一。然而，如果实验人员.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Bob Freeman 提供的培训，以及 Kirschner 实验室提供蛙类饲养设施的使用，同时感谢 Van Vactor 实验室成员给予的支持。我们感谢哈佛医学院尼康影像中心在图1图像的光学显微镜成像方面提供的协助。本研究由以下机构资助：L.A.L. 获美国国立卫生研究院（NIH）国家研究服务奖（NRSA）博士后奖学金及 NIH K99 奖学金资助，A.E.F. 获基础科学合作项目资金（https://bsp.med.harvard.edu/）资助，D.V.V. 获 NIH RO1 NS035909 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 绒毛膜促性腺激素 | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine 试剂盒 | Ambion | AM1340 | |
| 毛细管硼硅酸盐针 1.2 mm (外径) x 0.9 mm (内径) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| 菲可（Ficoll） | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| 杜蒙特 #5 不锈钢生物镊 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek 培养皿 | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| 神经营养因子-3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| 脑源性神经营养因子 | Sigma-Aldrich | B3795 |
参考文献
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosc....
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重印与许可
