Xenopus laevis 的神经外植体培养

摘要

培养表达荧光融合蛋白的分离非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎神经外植体，可实现对生长锥细胞骨架动态的成像观察。

摘要

轴突导向的复杂过程主要由生长锥驱动，生长锥是生长中轴突末端的动态可移动结构。在轴突延伸过程中，生长锥必须整合多种来源的导向信号信息，以调节其细胞骨架，从而推动自身前进并准确导航，最终找到特定靶标。¹在细胞骨架层面，这种整合过程的具体机制仍在探索中，而通过研究生长锥内细胞骨架蛋白及其效应分子的动态变化，有助于阐明这些机制。 非洲爪蟾 生长锥足够大（直径为10-30微米），可进行细胞骨架动态的高分辨率活体成像例如^2-4 ）且相较于其他脊椎动物更易于在实验室环境中分离和操作。青蛙是发育神经生物学研究的经典模型系统，关于生长锥微管动态的重要早期发现最初正是利用该系统获得的^5-7 在此方法中⁸，收集卵子并进行受精 体外，注射编码荧光标记的细胞骨架融合蛋白或其他用于调控基因表达的构建体的RNA，随后培养至神经管阶段。通过解剖分离神经管，进行体外培养，并对生长出的神经突起上的生长锥进行成像。本文描述了该方法的实施步骤，其目的是建立培养体系 非洲爪蟾 用于后续的高分辨率图像分析。尽管我们以 +TIP 融合蛋白 EB1-GFP 为例进行说明，但该方法可适用于多种蛋白质，以阐明其在生长锥内的行为。

方案

注意：前两个部分的步骤仅作简要描述，因为已有其他文献发表了更详细且更专注于这些步骤的优秀方案（例如^8-12）。此外，处理这些材料的通用操作流程 非洲爪蟾 活细胞培养中脊髓神经元的研究已在一篇详细的方法学文章中发表⁸我们强烈建议将该文章作为本视频的补充材料进行阅读，尽管在本文中，我们在第3步已提供了足够信息，可成功完成神经管解剖与接种操作并进行故障排查。

1. 体外 受精作用 非洲爪蟾 卵

1. 从注射了绒毛膜促性腺激素（400 单位/蛙）12–18 小时后的雌性青蛙中获取卵子。在 1× Marc's Modified Ringer 溶液（MMR）（0.1 M NaCl，2.0 mM KCl，1.0 mM MgSO₄，0.1 mM CaCl₂，5.0 mM HEPES，pH 7.8）中收集卵子。₄，2.0 mM CaCl₂，5.0 mM HEPES，pH 7.4⁹).
2. 受精卵 体外 用剪碎的睾丸组织，如前所述⁹.
3. 至少 20 分钟后，将胚胎置于含 2% 半胱氨酸的 1X MMR 溶液（用 NaOH 调至 pH 7.8）中孵育 3–5 分钟，以去除胚胎的胶状包膜。用 0.1X MMR（或 0.1X MBS（改良 Barth 盐水，1X 配方：88 mM NaCl，1 mM KCl，0.7 mM CaCl₂）洗涤胚胎。₂，1 mM MgSO₄₄，2.5 mM NaHCO₃₃，5 mM HEPES，pH 7.8）洗涤3-5次，并将胚胎置于室温下直至注射；如需要，可将胚胎置于14-18 °C 以减缓发育。

2. RNA显微注射

注意：尽管本实验采用RNA注射，但这些技术并不仅限于RNA，也可用于DNA、蛋白质或经修饰的核酸进行基因操作，相关方法已有文献报道¹²。

1. 实验前，使用 mMessage mMachine 试剂盒（Ambion）从线性化的 DNA 模板转录用于标记细胞骨架或其他结构的 RNA。mRNA 需要 5' 帽结构和 3' 多聚腺苷酸尾，以促进其在胚胎中的翻译并防止降解。pCS2+ 是常用于此目的的载体，转录试剂盒在合成反应中包含帽类似物。我们将转录的 mRNA 溶解于无核酸酶的 ddH₂O 中，储备浓度为 500 至 2,000 ng/μl，并立即在 -80 °C 下保存。注射前，用 ddH₂O 将 RNA 稀释至适当的注射浓度。由于仅向胚胎中注射极小体积，因此无需使用缓冲液重悬。我们最终的注射浓度通常为 50–200 pg/nl，具体取决于构建体，每个胚胎通常注射最多 4 nl；尽管许多实验室传统上注射最多 10 nl，约为胚胎总体积的 1%。高剂量的 RNA 可能具有毒性，每个胚胎的剂量通常在 10 pg 至 1 ng 之间，尽管根据特定基因和纯度的不同，最高可达 5 ng 也可耐受。然而，在进行蛋白定位成像时，应注射尽可能低的剂量，以避免过表达带来的假象。本方案中 EB1-GFP 的 RNA 使用量为每个胚胎 250 pg。
2. 使用拉针仪⁹拉制毛细管以制备注射针，针尖直径约为 0.2 μm。使用 Sutter P-87 拉针仪时，我们采用以下参数：加热值 644，拉力 125，速度 70，时间 250；但这些参数因仪器而异，更换灯丝后需重新调整（目前我们使用的是宽 2.5 mm 的 2.5 mm 方形盒状灯丝）。在显微镜下，用镊子以一定角度折断针尖，形成类似笔尖的形状。存在其他折断和填充注射针的方法（例如^11,12），但我们通过在针尾放置一小滴（0.5–1 μl）RNA 溶液来填充注射针。用于胚胎显微注射的商业化注射系统有多种，其中最常用的两种是 Pico-injector（Medical Systems）和 Nanoject（Drummond Scientific）（详见¹¹）。我们使用 Medical Systems PLI-100 Pico-Injector，该系统利用压缩气体，在数字设定的时间内释放，以提供稳定的纳升级注射体积。每次更换新的微量移液管后，必须使用载物台测微尺校准注射体积，并调整注射时间以达到所需的 RNA 注射量。
3. 将处于 1 至 4 细胞期的受精胚胎放入含有 5% Ficoll 的 0.1X MMR 溶液的塑料培养皿中。用镊子固定胚胎，或将胚胎置于固定平台（一种带有约 1 mm 网格的塑料网，用橡皮泥或牙科蜡固定在培养皿底部），向动物极卵裂球注射所需体积的 RNA（注射体积详见步骤 2.1）。为获得更均匀的分布，应在胚胎多个位置进行注射，每个动物极卵裂球至少注射一次（例如，对于 4 细胞期胚胎，我们通常在每个卵裂球中注射 1–2 次；而对于 2 细胞期胚胎，则在每个卵裂球中注射 2–4 次）。等到 2–4 细胞期再进行注射的一个优点是可确保胚胎已正常启动卵裂。然而，若时间紧迫，也可在 1 细胞期开始注射，最终结果差异不大，仅需注射更多胚胎。也可使用更晚期的胚胎，尤其当需要靶向特定细胞类型时特别有用；但由于我们通常希望获得更广泛的表达，因此倾向于在较早期胚胎中注射，以减少所需注射次数。
4. 将注射后的胚胎转移至含有 0.1X MMR 的塑料培养皿中，使其发育至 20–23 期¹³。根据所需发育速度，将胚胎在 14 至 22 °C 下孵育（若次日需解剖神经管，则使用约 22 °C；若在后一天进行，则使用约 14 °C）。

3. 神经管解剖与接种

1. 在进行解剖操作之前，需先准备培养皿¹⁴。首先，用含有200 μg/ml多聚赖氨酸的PBS溶液覆盖盖玻片表面（适用于Mattek或Lab-Tek培养皿的盖玻片），使溶液在盖玻片表面形成液滴，37°C孵育1小时（也可选用置于培养皿中的游离玻璃盖玻片，以便后续转移至载玻片上进行成像和免疫细胞化学分析）。吸除溶液后，用过量PBS洗涤3次，晾干。随后，在PBS中加入10 μg/ml层粘连蛋白，每张盖玻片加入500 μl（足以覆盖表面），37°C孵育1小时。吸除层粘连蛋白溶液，再用过量PBS洗涤3次，注意避免层粘连蛋白包被的表面暴露于空气界面。最后，用培养基替换PBS（培养基成分为50% Ringer's溶液、49% L-15培养基、1%胎牛血清，另加50 μg/ml青霉素/链霉素和庆大霉素，pH 7.4，经滤膜除菌）。Ringer's溶液配方：115 mM NaCl、2.5 mM KCl、2 mM CaCl₂、10 mM Hepes（pH 7.4）、0.5 mM EDTA。尽管本实验方案采用上述培养基，但需注意，该培养基为传统Xenopus视网膜神经节细胞培养中常用的富集型培养基，适用于能量储备较低的神经元。年轻的脊髓组织在不含额外生长因子的纯Ringer's溶液中亦可存活并生长超过24小时，这正是该实验系统的优势之一。可选步骤：在培养基中加入NT3和BDNF（终浓度均为25 ng/μl），以促进轴突发芽。
2. 由于注射mRNA后的表达存在个体差异，胚胎可能出现荧光表达的嵌合现象。在进行解剖前，应先筛选胚胎，观察其神经管区域是否表达荧光融合蛋白。将处于20–23期的荧光胚胎置于盛有Steinberg's溶液（58 mM NaCl、0.67 mM KCl、0.44 mM Ca(NO₃)₂、1.3 mM MgSO₄、4.6 mM Tris，调pH至7.8后高压灭菌）⁵的琼脂糖包被塑料培养皿中。制备琼脂糖包被培养皿时，将熔化的1%琼脂糖（溶于0.1X MMR）均匀涂布于塑料培养皿底部，待其凝固。此软质表面可防止后续解剖过程中精细镊子和钨针受损。胚胎超过23期后仍可进行解剖，但组织间粘连更紧密，需更长时间的胶原酶处理。
3. 在解剖显微镜下，用精细镊子去除胚胎的卵膜，然后通过一系列切口分离出胚胎的整个背侧部分。用一把镊子固定胚胎，另一把镊子在胚胎侧面做切口，暴露其内部空腔。随后，用两把镊子夹住胚胎背侧与腹侧之间的组织，将胚胎沿中线剪开，从而分离出包含神经管的背侧部分。
4. 将背侧外植体放入含有2 mg/ml胶原酶的Steinberg's溶液的离心管中，在旋转仪上处理15–20分钟以松解组织，然后用移液器将外植体转移至盛有新鲜Steinberg's溶液的琼脂糖包被塑料培养皿中。也可将外植体直接置于含胶原酶溶液的培养皿中处理15分钟，并在该培养皿中完成后续全部解剖操作。
5. 使用一对镊子，小心地将神经管从背侧表皮和腹侧脊索中分离。将镊子尖端插入表皮与下层组织之间，缓慢向后剥离表皮，暴露出下方的神经管。接着，用一把镊子固定组织，另一把镊子将尖端插入神经管与脊索之间进行分离。最后，用镊子去除神经管两侧的体节组织。
6. 将分离出的神经管转移至盛有培养基的琼脂糖包被培养皿中，操作方法同步骤3.1所述。
7. 在收集多个神经管后，使用磨尖的钨针或镊子将其切成若干小段（若完整保留整条神经管，约可切为20段），然后将组织块接种至已加入培养基（按步骤3.1制备）的培养皿中，并将外植体均匀排布成行。
8. 接种后，避免移动培养皿，以防干扰细胞贴壁。将接种后的神经管外植体置于20–22 °C环境中培养。通常我们将细胞培养皿置于室温下过夜。Xenopus laevis神经元的一大优势在于无需使用可调节CO₂浓度或温度的专用细胞培养孵箱。接种后12–24小时即可在室温下观察并成像神经突和生长锥，若添加生长因子可进一步加快突起生长。通常情况下，RNA或质粒的表达在不同细胞间存在差异，因此不同生长锥的荧光强度可能不一。我们观察到荧光蛋白的RNA表达可持续超过接种后48小时，但具体持续时间取决于所用构建体的特性。

4. 代表性结果

按照本方案操作后（方案概要见图1A），健康且正确分离培养的神经组织外植体将在层粘连蛋白/多聚赖氨酸基质上向各个方向延伸出大量轴突或神经突，如图1B所示。可通过微分干涉差（DIC）光学显微镜对轴突末端的生长锥进行成像（见图1C），以观察其整体运动动态；也可采用高分辨率荧光显微镜观察荧光标记的细胞骨架蛋白的定位情况，例如，EB1-GFP的定位如图1D所示。

图1. 实验方案及预期结果概要。A) 实验流程图。有关第3天解剖操作的详细信息请观看视频。整个神经管应被剪成约20个大小相等的片段，并均匀排列在盖玻片上。图中用剪刀示意使用精细镊子切割组织。CG为绒毛膜促性腺激素。B) 从外植体长出的轴突或神经突的微分干涉差（DIC）图像（外植体位于左上角）。C) 生长中轴突顶端生长锥的高倍放大图像。D) 生长锥中EB1-GFP的荧光显微镜图像。比例尺为10 μm。 点击此处查看大图。

讨论

Xenopus laevis 神经外植体在接种于层粘连蛋白/多聚赖氨酸基质后24小时，若条件适宜，会以非常强健的方式长出神经突。在此基质上，生长锥具有高度运动性，轴突长度可延伸至1毫米，从外植体向各个方向延伸，尽管典型长度为100 μm或更长。如果神经突未能长出，可能的原因较为有限。一种可能是神经外植体未能正确贴附于培养皿表面。接种后应避免意外移动培养皿，以免破坏贴附。同时，需确保所使用的层粘连蛋白和多聚赖氨酸包被的培养皿是使用新鲜配制的试剂正确制备的。缺乏神经突延伸的另一个可能原因是细胞培养基条件可能未达到最佳状态。请仔细核对实验方案和计算过程，确保所有培养基溶液均正确配制。最后，获取外植体的胚胎本身可能不健康，但如果胚胎能够发育至神经管阶段，则此问题的可能性较小。然而，最好在进行解剖的同时，将部分完整胚胎在0.1X MMR中继续培养，以确保其发育进程正常持续。

本方案最关键的步骤是神经管的解剖。与许多模式生物胚胎的显微解剖相比，该技术相对简单，且Xenopus laevis胚胎是进行解剖操作时尺寸最大、容错性最高的生物之一。然而，如果实验人员...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
绒毛膜促性腺激素	Argent Labs	C-HCG-ON-10
半胱氨酸	Sigma-Aldrich	52-90-4
mMessage mMachine 试剂盒	Ambion	AM1340
毛细管硼硅酸盐针 1.2 mm (外径) x 0.9 mm (内径)	FHC, Inc.	30-31-0
菲可（Ficoll）	Sigma-Aldrich	F2637
杜蒙特 #5 不锈钢生物镊	Fine Science Tools	11252-20
胶原酶	Sigma-Aldrich	9001-12-1
Mattek 培养皿	Mat Tek Corporation	P35G-1.5-14-C
L-15	Invitrogen	21083-027
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P-1399
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
神经营养因子-3	Sigma-Aldrich	N1905
脑源性神经营养因子	Sigma-Aldrich	B3795