我们开发了一个软件平台，利用 Imaris Neuroscience、ImarisXT 和 MATLAB 来测量从单个细胞三维共聚焦荧光图像中提取的不规则形状的形态学变化。这种新方法可用于量化受体激活后细胞形态的变化，因此可能成为药物发现的另一种辅助工具。
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摘要
摘要
目前可用于测量荧光图像的最常见软件分析工具主要针对二维（2D）数据，依赖手动设置来确定数据点的纳入与排除，并借助计算机辅助的模式识别来支持分析结果的解读与发现。为了能够捕捉细胞动态的复杂性并理解生物系统中细胞可塑性的基础，测量由三维（3D）数据集构建的荧光图像变得日益重要。先进的显微镜设备通过获取多光谱荧光图像，并结合强大的分析软件对共聚焦图像序列进行重建，从而实现了三维荧光图像的可视化，进而提供所采集二维图像的三维表征。基于先进设计的体视学方法已从最初基于模型的体视学所依赖的近似与假设中发展而来1，即使在复杂组织切片中也得以应用2。尽管显微技术取得了这些科学进步，但仍亟需一种自动化分析方法，能够充分挖掘固有的三维数据，以实现对细胞形态、蛋白质定位及受体转运等复杂变化的分析与定量。
目前可用于量化荧光图像的技术包括提供手动分析功能的 Meta-Morph（Molecular Devices，加利福尼亚州森尼韦尔）和 Image J（美国国立卫生研究院）。Imaris（Andor Technology，北爱尔兰贝尔法斯特）软件提供了 MeasurementPro 功能，允许手动创建测量点，这些测量点可放置在三维图像中，或绘制在一系列二维切片上以构建三维对象。该方法适用于单击式点测量，可用于测量两个物体之间的线性距离，或创建包围感兴趣区域的多边形，但在应用于复杂的细胞网络结构时存在困难。Filament Tracer（Andor）模块可实现对三维神经元样细丝结构的自动检测，然而该模块是为测量具有树突、轴突和棘突（树状结构）等明确定义结构的神经元而开发的。尽管该模块已被巧妙地用于非神经元细胞的形态学测量3，但其输出数据是通过依赖于特定细胞形状而非无定形细胞模型的软件获得的，因此仅能提供扩展细胞网络的信息。为解决无定形细胞分析的问题，并使软件更适用于生物学应用，Imaris 开发了 Imaris Cell。该项目是与瑞士联邦理工学院（Eidgenössische Technische Hochschule）合作开展的科学项目，旨在计算细胞与细胞器之间的关系。尽管该软件可通过限定每个细胞仅含一个细胞核并利用细胞膜对细胞进行分割，从而识别生物学约束条件，但由于其理想状态下构建的细胞表面不含空隙，因此无法用于分析不连续的荧光数据。据我们所知，目前尚未开发出一种用户可自定义的自动化方法，能够从三维荧光图像中获取形态计量学信息，并实现对形状未定义细胞的空间分布分析（图1）。
我们开发了一个分析平台，该平台使用 Imaris 核心软件模块以及与 MATLAB（Mat Works, Inc.）连接的 Imaris XT。这些工具能够对无预定义形状且荧光网络组分不一致的细胞进行三维测量。此外，该方法可使在生物系统方面具有丰富经验但不熟悉计算机应用的研究人员，对细胞动态中的形态学变化进行定量分析。
方案
1. 单细胞表型变化的三维形态计量分析
- 采用血凝素（HA）标签的促肾上腺皮质激素释放因子受体-2（CRF-R2）转染人胚肾（HEK293）细胞，该受体为G蛋白偶联受体（GPCR），转染方法如前所述4, 5。
- 细胞分别进行如下处理：不作处理（无处理，NT）、用CRF-R2内源性配体促肾上腺皮质激素释放因子（CRF，1 μM，30 min）刺激，或在激动剂处理前先用选择性CRF-R2拮抗剂anti-sauvagine 30（AS-30，1 μM，30 min）预处理。
- 随后将细胞固定、通透化，并用抗HA抗体处理。使用Alexa 594 nm偶联的抗小鼠（IgG1）抗体对CRF-R2进行荧光标记，DAPI用于显示细胞核的有丝分裂阶段。
- 为减少实验人员主观偏差，在图像采集和分析完成前，实验人员对实验分组情况保持盲态。
- 使用配备Coherent集成双光子激光系统（包括Verdi-V5激光器和Mira 900-F激光系统）的Zeiss LSM 510 META共聚焦显微镜，结合Plan-apochromat 63x/1.4油镜DIC物镜，采集固定后的HEK293细胞图像。
- 在数据采集过程中，通过多光谱切片（488 nm和790 nm，约350 nm双光子激发）和z轴分层扫描（0.5 μm步进）对细胞进行分区，以涵盖从核膜到细胞外受体末端的全部区域数据。
- 首先....
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讨论
我们发现，CRF 处理可诱导 CRF-R2 在形态和定位上发生显著变化，而该变化可被选择性拮抗剂处理所抑制。我们证实，使用标准的二维多光谱技术无法检测到受体的修饰，也无法对其进行测量。研究复杂三维图像的能力对于纳入生物参数的复杂性以进行形态计量分析至关重要。我们能够在不存在预定义形状且荧光网络组分不一致的情况下，对细胞进行三维测量。我们这套可由用户修改的自动化方法体系，使我们能够在细胞所处的环境中对单个非定形细胞的分子动态进行定量，从而提取有关细胞动态的信息。该工具可帮助预测药理学化合物在抑制剂存在条件下对细胞通路及细胞形态改变的影响，并提供关于细胞存活的信息。
我们这种三维定量方法的优势在于，它使那些在生物学机制方面具有丰富专业知识但不熟悉计算机代码的研究人员能够将显微镜技术与计算机应用相结合。我们进行了单细胞测量，以揭示反映细胞群体特征的信息6。单细胞测量使我们能够分析复杂形态的细胞，且不受邻近细胞干扰的影响。该方法将有助于科学家研究化学刺激后细胞形态的变化以及膜结合蛋白的位置变化7, 8。对细胞的分析应包含从细胞内部核心区域到其胞.......
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致谢
我们感谢加州大学旧金山分校生物成像开发中心（BIDC）提供 Imaris、Imaris XT 和 Matlab 软件的使用权限。感谢 V. Kharazia 提供的技术支持，感谢 A.T. Henry、L.K. Floren 和 L. Daitch 在稿件编辑过程中的贡献。本研究获得了以下资助：加州酒精与药物滥用医学研究项目通过加州大学旧金山分校（UCSF）对 SEB 的资助，美国国立卫生研究院（NIH）项目 1R21DA029966-01 及 NIH 快速通道奖（用于对 MLSMR 化合物库进行筛选，授予 SEB），以及加州大学旧金山分校药学院（院长办公室和临床药学系）和医学院（临床药理学与实验治疗学系）对 CLHK 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人胚胎肾细胞（HEK293） | 美国模式培养物集存库 | CRL-1573 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | 英韦特洛根 | 11965118 | |
| 胎牛血清（FBS） | 英韦特洛根 | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488（IgG2b） | 英韦特洛根 | A-11001 | |
| 单克隆抗HA.11（IgG1） | 科万斯 | 16B12 | |
| DAPI | 维克多实验室 | H-1200 | |
| CRF | 西格玛 | C2917 | |
| 抗蛙皮素-30（AS-30） | 西格玛 | A4727 |
参考文献
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262(2009).
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