الساعة البيولوجية تعمل الساعات داخل الخلايا الفردية، أي أنها خلية مستقلة. هنا، نحن تصف طرق لتوليد نماذج على مدار الساعة خلية المستقلة باستخدام غير الغازية، وسيفيراز التكنولوجيا القائمة على تلألؤ بيولوجي في الوقت الحقيقي. خلايا مراسل توفير لين العريكة، ونظم نموذج وظيفي لدراسة علم الأحياء الإيقاعية.
في الثدييات، وينظم العديد من جوانب السلوك وعلم وظائف الأعضاء مثل دورات النوم واليقظة والتمثيل الغذائي في الكبد عن طريق الساعات الساعة البيولوجية الداخلية (مراجعة 1،2). والإيقاعية الوقت لحفظ النظام هو الهرمي متعدد مذبذب الشبكة، مع ساعة المركزي الموجود في نواة suprachiasmatic (SCN) مزامنة وتنسيق الساعات خارج SCN والطرفية في أماكن أخرى 1،2. الخلايا الفردية هي وحدات وظيفية للجيل وصيانة إيقاعات الساعة البيولوجية 3،4، وهذه مؤشرات التذبذب من أنواع الأنسجة المختلفة في الكائن الحي على حصة متشابهة بشكل ملحوظ البيوكيميائية آلية تغذية مرتدة سلبي. ومع ذلك، نظرا للتفاعلات على مستوى الشبكة العصبية في SCN ومن خلال العظة، الإيقاعي النظامية على المستوى العضوي، إيقاعات الساعة البيولوجية على المستوى العضوي ليست بالضرورة خلية مستقلة 5-7. دراسات مقارنة للنشاط الحركي التقليدية في الجسم الحي وSCN إإكسبلنتس خارج الجسم، جالذراع التي يوجد مقرها في المقايسات المختبر تسمح لاكتشاف خلية مستقلة العيوب الإيقاعية 5،8. استراتيجيا، خلية النماذج القائمة على أكثر لين العريكة تجريبيا لتوصيف المظهري والاكتشاف السريع للآليات الأساسية على مدار الساعة 5،8-13.
لأن الإيقاع اليومي الحيوية، وهناك حاجة إلى قياسات الطولية العالية لقرار الزمنية لتقييم وظيفة على مدار الساعة. في السنوات الأخيرة، أصبح في الوقت الحقيقي باستخدام تسجيل تلألؤ بيولوجي يراعة luciferase كمراسلة تقنية مشتركة لدراسة الإيقاع اليومي في الثدييات 14،15، لأنه يتيح للفحص لاستمرار وديناميات الجزيئية الإيقاعات. لرصد الخلايا المستقلة إيقاعات الساعة البيولوجية في التعبير الجيني، يمكن عرض صحفيين في الخلايا عن طريق وسيفيراز ترنسفكأيشن عابرة 13،16،17 أو تنبيغ مستقرة 5،10،18،19. نحن هنا وصف بروتوكول تنبيغ مستقرة باستخدام الفيروسة البطيئة بوساطة توصيل الجينات. Tانه نظام ناقلات lentiviral متفوقة على الطرق التقليدية مثل ترنسفكأيشن عابرة وانتقال سلالة الجرثومية بسبب كفاءتها وبراعة: أنه يسمح التنفيذ الفعال والتكامل مستقرة في الجينوم المضيف على حد سواء وعدم تقسيم تقسيم الخلايا 20. مرة واحدة يتم إنشاء خط خلية مراسل، يمكن فحص وظيفة ديناميكية على مدار الساعة من خلال تسجيل تلألؤ بيولوجي. وصفنا لأول مرة جيل من (Per2) P-خطوط مراسل د لوك، ومن ثم تقديم بيانات من هذا وصحفيين الإيقاعية الأخرى. في هذه المقايسات، وتستخدم الخلايا الليفية الماوس 3T3 وU2OS خلايا عظمية الإنسان كنماذج الخلوية. نناقش أيضا سبل مختلفة لاستخدام هذه النماذج على مدار الساعة في الدراسات الإيقاعية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لمجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا لدراسة أساس الخلوية والجزيئية من الساعات الإيقاعية، وربما تكون مفيدة في معالجة المشاكل في النظم البيولوجية الأخرى.
1. تعديلات على البروتوكول الحالي
أجهزة تسجيل 1.1 و اعتبارات الإنتاجية
بسبب توافر التجاري، أصبح LumiCycle (Actimetrics) الأكثر شيوعا جهاز luminometer الآلي في الوقت الحقيقي تسجيل 4،5،9،19،29-31. وتوظف LumiCycle أناب…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل في جزء من المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS-0920417) (ACL).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
FBS | HyClone | SH3091003 | |
Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
All other chemicals | Sigma | ||
Equipment | |||
Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37°C | ||
Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
LumiCycle | Actimetrics |