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方法文章

利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

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DOI：

10.3791/4234

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2012年9月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, The University of Memphis

本文内容

摘要

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。

摘要

在哺乳动物中，昼夜节律钟调控着行为和生理的诸多方面，例如睡眠-觉醒周期和肝脏代谢（综述见1,2）。昼夜计时系统是一个具有层级结构的多振荡器网络，其中位于视交叉上核（SCN）的中枢钟起到核心作用，负责同步和协调SCN以外及其他外周组织中的生物钟1,2。单个细胞是产生和维持昼夜节律的功能单位3,4，机体中不同组织类型的这些振荡器共享一种高度相似的生化负反馈机制。然而，由于SCN神经元网络层面的相互作用以及机体系统层面的节律性信号调控， organismal 水平的昼夜节律并不一定是细胞自主的5-7。与传统的活体（in vivo）运动活动研究和离体（ex vivo）SCN组织块实验相比，基于细胞的体外（in vitro）检测方法能够揭示细胞自主性的昼夜节律缺陷5,8。从实验策略上看，基于细胞的模型更易于进行表型特征分析，并能快速发现基本的生物钟机制5,8-13。

由于昼夜节律具有动态性，因此需要高时间分辨率的纵向测量来评估生物钟功能。近年来，利用萤火虫luciferase作为报告基因进行实时生物发光记录已成为研究哺乳动物昼夜节律的常用技术14,15，因为它能够检测分子节律的持续性和动态变化。为了监测基因表达的细胞自主性昼夜节律，可通过瞬时转染13,16,17或稳定转导5,10,18,19将荧光素酶报告基因导入细胞。本文描述了一种基于慢病毒介导基因递送的稳定转导方案。慢病毒载体系统相较于瞬时转染和种系传递等传统方法更具效率和通用性：它能够高效地将外源基因递送并稳定整合到分裂和非分裂细胞的宿主基因组中20。一旦建立报告细胞系，即可通过生物发光记录来观察生物钟功能的动态变化。我们首先描述P(Per2)-dLuc报告细胞系的构建过程，随后展示来自该系统及其他昼夜节律报告系统的实验数据。在这些实验中，使用小鼠3T3成纤维细胞和人骨肉瘤U2OS细胞作为细胞模型。我们还讨论了这些生物钟模型在昼夜节律研究中的多种应用方式。本文所述方法可广泛应用于多种细胞类型，以研究昼夜节律钟的细胞与分子基础，并可能有助于解决其他生物系统中的相关问题。

方案

1. 慢病毒荧光素酶报告系统的构建

哺乳动物昼夜节律报告基因载体通常包含一个表达盒，其中昼夜节律启动子与luciferase基因相融合。DNA克隆通常采用连接法和基于重组的方法。例如，本文描述了一种基于重组的Gateway克隆方法，用于构建P(Per2)-dLuc慢病毒报告载体，其中 destabilized luciferase（dLuc）受小鼠Per2启动子调控。

  1. 克隆Per2启动子。使用正向引物（5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3'）和反向引物（5'-CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3'），通过PCR扩增小鼠Per2 BAC克隆中转录起始位点上游526 bp的Per2启动子DNA片段9-13，并将产物克隆至pENTR5'-TOPO载体（Invitrogen）中，构建pENTR5'-P(Per2)。
  2. 克隆dLuc。dLuc包含萤火虫luciferase基因以及一个位于C末端的PEST序列，用于实现蛋白质的快速降解，如先前所述21。使用PCR扩增dLuc DNA片段，并将其克隆至pENTR/D-TOPO载体（Invitrogen）中，构建pENTR/D-dLuc。
  3. 报告载体的构建。将两种pENTR质粒pENTR5'-P(Per2)和pENTR/D-dLuc与慢病毒目的载体pLV7-Bsd（Bsd为杀稻瘟菌素抗性基因）混合，利用Clonase进行重组反应，生成pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc报告载体（图1）。pLV7-Bsd是pLenti6/R4R2/V5-DEST（Invitrogen）的改良版本（由本实验室构建），在其表达盒下游紧接插入了土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）序列22，以增强基因表达水平。

2. 慢病毒颗粒的制备

1. 接种293T细胞（第1天）

  1. 在10 cm培养皿中，使用添加10%胎牛血清和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）的常规DMEM培养基，将人胚胎肾（HEK）293T细胞培养至90–100%汇合度。（低传代数且生长迅速的细胞对高效转染至关重要。）
  2. 转染前，向6孔培养板每孔加入1 ml含0.001%多聚-L-赖氨酸的PBS溶液，室温孵育20分钟进行包被。吸除溶液后，用1×PBS洗涤一次，备用。
  3. 用胰酶消化293T细胞，将0.75 × 106个细胞接种至已包被的6孔板每孔中，每孔加入2 ml常规DMEM培养基。轻轻晃动培养板，使细胞均匀分布。将细胞置于37 °C培养箱中过夜培养。

2. 通过 CaPO4/DNA 沉淀法进行瞬时转染（第 2 天）

  1. 从第1天开始观察接种的细胞，细胞应达到80-90%融合度。
  2. 在1.5 ml微量离心管中配制质粒转染混合液，依次加入 2 μg 慢病毒报告质粒DNA的例如，pLV7-P(Per2)-dLuc；刘氏实验室）以及3种包装载体（1.3 μg Gag/Pol 0.5 μg Rev，以及 0.7 μg VSVG；Invitrogen)。为了同时对照转染和后续感染效率，我们通常在转染时额外设置一个孔，用于转染慢病毒GFP表达载体pLV156-CMV-EGFP（图1A），在CMV启动子控制下携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP），如先前所述20.
  3. 添加 100 μl 0.25 M CaCl₂2 （用无DNase/RNase的ddH₂O稀释）2将2.5 M储存液中的O加入第2步的质粒混合物中，充分混匀。然后加入 100 μl 2× BBS 溶液（50 mM BES，280 mM NaCl，1.5 mM Na2HPO4，pH 6.95）并轻轻但充分混匀。将DNA混合物在室温下孵育15分钟。
  4. 等待期间，吸除293T细胞的培养基，更换为2 ml新鲜培养基。将培养板放回培养箱中，至少孵育10分钟以平衡培养基pH值，再进行转染。
  5. 将第3步的转染混合物逐滴加入293T细胞中。轻轻摇动培养板，并在显微镜下观察颗粒形成情况。于5% CO₂条件下孵育2, 37 °C 过夜。（CaPO细颗粒的形成）4DNA 沉淀物对于高效的转染至关重要。

3. 收获病毒颗粒（第3-4天）

  1. 转染后约16小时（第3天），此时细胞应达到100%汇合度，吸除细胞培养基，更换为2 ml新鲜的常规DMEM培养基。于37 °C孵育过夜。
  2. 第4天，通过观察转染对照细胞中EGFP的表达情况评估转染效率（若EGFP表达水平高，转染效率达90–100%，通常可可靠预测病毒制备效果良好）。
  3. 收集含有分泌型感染性病毒颗粒的培养上清。在>2,000 × g条件下离心5分钟，以去除残留的293T细胞，并收集含病毒的上清液。或者，也可使用0.45 μm孔径的膜滤器对培养基进行过滤除菌。所得病毒颗粒可直接用于感染实验。

3. 3T3 细胞的感染

1. 接种3T3细胞（第3天）

在12孔板中接种适量数量（约12,000个）的3T3细胞，使次日细胞融合度达到20-30%。于37 °C过夜培养。

2. 感染 3T3 细胞（第 4 天）

  1. 观察接种的细胞，感染时细胞融合度应达到 20–30%（低于 50%）为宜。
  2. 向含有病毒颗粒的收集培养基中加入聚凝胺，使其终浓度为 5 μg/ml，用移液器轻轻吹打混匀。
  3. 吸除 3T3 细胞的培养基，每孔加入 1 ml 上述病毒混合液，于 37 °C 培养过夜。（聚凝胺可提高感染效率，但并非绝对必需；因其可能对某些细胞具有毒性，建议预先进行测试。）

3. 选择感染的细胞（第5天及之后）

  1. 感染后24小时，吸弃含有病毒和polybrene的培养基，用1×PBS洗涤一次，更换为新鲜培养基。继续在 37 °C 过夜培养以恢复和生长。
  2. 当细胞汇合时（通常为1-2天后），传代细胞并继续在 37 °C 过夜。
  3. 次日，从细胞中吸除培养基（<期望达到 50% 汇合度，并更换为含有新鲜培养基的培养液 10 μg/ml 使用杀稻瘟菌素筛选稳定转导的细胞。（杀稻瘟菌素致死曲线需针对特定细胞系通过实验确定。）
  4. 每2-3天更换一次含有杀稻瘟菌素（Blasticidin）的新鲜培养基，以持续筛选表达生物钟报告基因的抗生素抗性细胞（通常共需4-6天）。

4. 报告细胞的生物发光记录

1. 接种报告细胞

扩增具有杀稻瘟菌素抗性的报告细胞，并接种至35 mm培养皿中。在37 °C条件下孵育至细胞融合。我们通常在每种条件下为每种报告细胞系准备不少于3个培养皿，用于昼夜节律表型分析。

2. 同步化及更换为记录培养基

  1. 吸去汇合的报告细胞的培养基，用 PBS 洗涤一次，然后更换为含有 10 μM 福斯科林（或 200 nM 地塞米松）的 DMEM 培养基。在 37 °C 下孵育 1 小时以同步细胞。（也可通过温度循环23或血清冲击24实现细胞同步化。）
  2. 等待期间，按如下方法配制 3T3 细胞的记录培养基：含 10% FBS、1x 青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1 μM 福斯科林、1 mM 萤光素、25 mM HEPES（pH 7.4）的 1x DMEM（HyClone）。血清和福斯科林的浓度可凭经验确定。对于发光极弱的细胞，可使用不含酚红的培养基。
  3. 福斯科林处理结束后，吸去培养基，并更换为新配制的记录培养基。

3. 报告细胞的生物发光记录

  1. 更换培养基后，用40 mm无菌盖玻片覆盖培养皿，并用真空脂密封以防止蒸发。
  2. 将培养皿装载到LumiCycle化学发光仪中，该仪器置于设定为36 °C且无H2O和CO2的培养箱内。
  3. 开始实时生物发光记录。我们通常记录1周的节律，随后更换培养基并继续记录第二周（详见Savelyev et al. 的研究）25。（对于96孔板的记录，使用Synergy SL2作为记录设备；详见讨论部分1.1）。

5. 数据分析与展示

报告细胞有助于实现高分辨率的定量发光记录，这对于确定表型对生物钟功能的影响至关重要。为获得包括相位、周期长度、节律振幅和阻尼率在内的生物钟参数，我们使用 LumiCycle Analysis 程序（Actimetrics）分析生物发光数据5,14简而言之，原始数据首先进行基线拟合，然后对减去基线的数据拟合正弦波，从中确定参数。对于呈现持续节律的样本，拟合优度的 >通常可达到90%。由于换液后瞬时生物发光信号较强，我们通常在分析中排除第一个周期的数据。

在数据展示时，我们通常将原始数据（生物发光值，每秒计数）对时间（天）作图。必要时，可绘制减去基线后的数据，以比较振幅和相位。

6. 代表性结果

1. 特定阶段的昼夜节律报告基因

昼夜节律钟基于一种生化负反馈机制1核心反馈回路由转录激活因子BMAL1和CLOCK，以及抑制因子PERs和CRYs组成，这些因子作用于昼夜节律E/E'-盒增强子元件，驱动基因的节律性表达（呈早晨相位， 例如, Rev-erbα）。核心环路调控并整合至少另外两个昼夜节律顺式作用元件，即DBP/E4BP4结合元件（D-box；对应白天相位， 例如, Per3）以及ROR/REV-ERB结合元件（RRE；用于夜间阶段， 例如, Bmal1)17多个昼夜节律元件的组合调控可产生新的中间相位。例如， Cry1 转录由全部三种昼夜节律元件介导（即启动子区的E/E'-盒和D-盒元件以及第一内含子中的RREs Cry1 基因），产生不同的 Cry1 晚间相位13.

基于这些基因调控机制，我们构建了四种不同的报告基因载体：P(Per2)-dLuc 和 P(Cry1)-dLuc 同时含有E/E'-盒和D-盒元件的报告基因，其调控区包含这两种元件17,26,27；P(Cry1)-内含子- dLuc 由所有三个元件共同参与的组合调控即E/E'-盒、D-盒和RRE13,17；以及 P(Bmal1)-dLuc 仅由 RRE 调控9,17,19,21我们将这些报告基因导入3T3细胞，以产生预期的报告基因表达的不同阶段图2).

2. 通过RNAi和药理学活性化合物进行基因敲低

当转染效率较高时，可将合成的siRNA瞬时转染入细胞以实现基因表达的敲低。当转染技术上存在困难时，可通过慢病毒感染将shRNA表达载体稳定转导至细胞中，使细胞产生的shRNA被加工为siRNA，从而实现基因敲低（KD）。本文展示了以下基因敲低效果： Cry1 和 Cry2 使用siRNA在U2OS细胞中靶向基因（图3A) 以及使用 pLL3.7 Gateway 表达载体在 3T3 细胞中表达 shRNA9 (图3B）。除了3T3细胞外，U2OS模型也已成为另一种主要的细胞钟模型，主要是因为它满足了对市售人源siRNA文库进行高通量筛选的关键要求（例如，人类来源，能够产生强烈的昼夜节律，所有已知生物钟基因的功能均已得到验证，且适用于高效转染和定量生物发光记录）。在这两种细胞类型中，RNAi介导的基因敲低（KD）所产生的生物钟表型与此前的小鼠基因敲除（KO）及细胞水平KD研究结果一致5,10,11,28例如， Cry1 KD缩短周期长度并降低节律持续性，而 Cry2 KD 延长周期。此外，可选用特定小分子通过药理学手段靶向并干扰蛋白质功能（图3C).

基因编辑载体示意图及转染结果；包含 pLV7-Bsd、pLV156-EGFP 构建体。
图1. 慢病毒介导的基因递送系统。（A） 两种慢病毒P(Per2)-dLuc 报告载体和一种CMV-EGFP 构建体的示意图。仅显示整合到宿主细胞基因组的区域。在两种报告载体中，dLuc 的转录均由Per2 启动子直接调控。在pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc 载体（基于重组的克隆）中，共表达的杀稻瘟菌素抗性基因（Bsd）有助于筛选感染细胞。在pLV156-P(Per2)-dLuc 载体（基于连接的克隆）中，dLuc 下游的内部核糖体进入位点（IRES）介导EGFP的翻译，从而允许对感染细胞进行可视化观察和FACS分选。此外，SV40启动子/终止子（P/T）被用作绝缘子（见讨论1.3）。在CMV-EGFP对照载体中，EGFP的表达由强效CMV启动子驱动。（B） 转染和感染后表达GFP细胞的荧光图像。通常，我们在293T细胞的瞬时转染以及目标细胞系的慢病毒感染中均能实现高效率，如这些细胞中GFP的表达所示。 点击此处查看大图。

生物发光活性图；P(Per2)、P(Cry1)、P(Cry1-内含子)、P(Bmal1) 随时间（天）的变化。
图 2. 3T3 细胞中生物发光报告基因的相位特异性表达。 本实验所用的慢病毒报告载体为 pLV7-Bsd-P(Per2)-dLuc、P(Cry1)-dLuc、P(Cry1)-Intron-dLuc 和 P(Bmal1)-dLuc。每个报告基因表现出不同的振荡相位，如箭头所示。Per2 和 Cry1 启动子驱动的生物发光峰值出现在清晨至白天阶段，Bmal1 启动子驱动的峰值出现在夜间阶段，而包含 E-box、D-box 和 RRE 元件的 P(Cry1)-Intron 通过组合调控，使生物发光峰值出现在傍晚阶段。 点击此处查看高清大图。

Bioluminescence assay graphs showing effects of RNAi and inhibitors on gene expression in U2OS cells.
图3. 报告细胞中昼夜节律性生物发光的遗传与药理学干扰。(A) 影响 Cry1 和 Cry2 通过siRNA敲低U2OS报告细胞的细胞节律。使用LumiCycle化学发光仪记录35 mm培养皿中细胞的生物发光信号。图示已改编 参考文献[10]，经爱思唯尔（2009）许可。 （B） 影响 Cry2 通过shRNA在3T3报告细胞中敲低细胞节律。使用含有U6-shRNA表达盒的pLL3.7 Gateway载体进行实验。 Cry2 基因敲低。通过Western印迹分析确定，shRNA2的敲低效率优于shRNA1（数据未显示）。使用Synergy发光仪记录96孔板中细胞的生物发光信号。记录设置如下：培养箱温度， 33 °C积分时间，15 秒；间隔时间，30 分钟。 (C) 小分子抑制剂对U2OS报告细胞节律的影响。Chir99021和Roscovitine分别为靶向GSK-3和CDK的抑制剂。使用ViewLux系统（Chir99021实验）和Tecan发光仪（Roscovitine实验）记录384孔板中细胞的生物发光信号。该图改编自参考文献#19（版权所有 2008 美国国家科学院）。 单击此处查看大图.

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讨论

1. 当前方案的修改

1.1 记录设备与通量考虑因素

由于其商业化供应，LumiCycle（Actimetrics）已成为用于实时记录最常用的自动化发光仪设备4,5,9,19,29-31。LumiCycle采用光电倍增管（PMTs）作为光检测器，具有极高的灵敏度和低噪声14，因此特别适用于极微弱的基于荧光素酶的生物发光信号的数据采集。其他类似的基于光电倍增管的设备（例如，Kronos，Atto Co.；以及POLARstar Optima，BMG labtech Inc.）也在许多研究中被广泛应用32,33。

使用35毫米培养皿的LumiCycle检测可适用于96孔、384孔甚至1,152孔板格式，以进行高通量筛选（HTS）实验。HTS检测方法的开发主要集中在以下两个方面：1）具有更亮荧光素酶和/或更高报告基因表达水平的优化报告细胞（见下文）；2）可兼容多孔板的高灵敏度记录设备。我们及其他研究者已使...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究工作部分由美国国家科学基金会（IOS-0920417）（ACL）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMHyCloneSH30243FS用于常规细胞培养
DMEMInvitrogen12100-046用于发光测定
FBSHyCloneSH3091003
青霉素/链霉素/谷氨酰胺（100倍浓缩）HyCloneSV3008201
B-27Invitrogen17504-044
D-荧光素BiosynthL-8220
聚-L-赖氨酸SigmaP4707
Polybrene默克密理博TR-1003-G
ForskolinSigmaF6886
所有其他化学品Sigma
<强>仪器设备
组织培养箱37℃、5% CO₂ °C
组织培养罩BSL-2 认证
光 &荧光显微镜相差可选
LumiCycleActimetrics

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