利用荧光素酶生物发光报告系统监测细胞自主性基因表达的昼夜节律

摘要

昼夜节律钟在单个细胞内发挥作用，即具有细胞自主性。本文描述了利用非侵入性的、基于荧光素酶的实时生物发光技术构建细胞自主性节律钟模型的方法。报告基因细胞为研究昼夜节律生物学提供了易于操作且功能明确的模型系统。

摘要

在哺乳动物中，昼夜节律钟调控着行为和生理的诸多方面，例如睡眠-觉醒周期和肝脏代谢（综述见^1,2）。昼夜计时系统是一个具有层级结构的多振荡器网络，其中位于视交叉上核（SCN）的中枢钟起到核心作用，负责同步和协调SCN以外及其他外周组织中的生物钟^1,2。单个细胞是产生和维持昼夜节律的功能单位^3,4，机体中不同组织类型的这些振荡器共享一种高度相似的生化负反馈机制。然而，由于SCN神经元网络层面的相互作用以及机体系统层面的节律性信号调控， organismal 水平的昼夜节律并不一定是细胞自主的^5-7。与传统的活体（in vivo）运动活动研究和离体（ex vivo）SCN组织块实验相比，基于细胞的体外（in vitro）检测方法能够揭示细胞自主性的昼夜节律缺陷^5,8。从实验策略上看，基于细胞的模型更易于进行表型特征分析，并能快速发现基本的生物钟机制^5,8-13。

由于昼夜节律具有动态性，因此需要高时间分辨率的纵向测量来评估生物钟功能。近年来，利用萤火虫luciferase作为报告基因进行实时生物发光记录已成为研究哺乳动物昼夜节律的常用技术^14,15，因为它能够检测分子节律的持续性和动态变化。为了监测基因表达的细胞自主性昼夜节律，可通过瞬时转染^13,16,17或稳定转导^5,10,18,19将荧光素酶报告基因导入细胞。本文描述了一种基于慢病毒介导基因递送的稳定转导方案。慢病毒载体系统相较于瞬时转染和种系传递等传统方法更具效率和通用性：它能够高效地将外源基因递送并稳定整合到分裂和非分裂细胞的宿主基因组中²⁰。一旦建立报告细胞系，即可通过生物发光记录来观察生物钟功能的动态变化。我们首先描述P(Per2)-dLuc报告细胞系的构建过程，随后展示来自该系统及其他昼夜节律报告系统的实验数据。在这些实验中，使用小鼠3T3成纤维细胞和人骨肉瘤U2OS细胞作为细胞模型。我们还讨论了这些生物钟模型在昼夜节律研究中的多种应用方式。本文所述方法可广泛应用于多种细胞类型，以研究昼夜节律钟的细胞与分子基础，并可能有助于解决其他生物系统中的相关问题。

方案

1. 慢病毒荧光素酶报告系统的构建

哺乳动物昼夜节律报告基因载体通常包含一个表达盒，其中昼夜节律启动子与luciferase基因相融合。DNA克隆通常采用连接法和基于重组的方法。例如，本文描述了一种基于重组的Gateway克隆方法，用于构建P(Per2)-dLuc慢病毒报告载体，其中 destabilized luciferase（dLuc）受小鼠Per2启动子调控。

1. 克隆Per2启动子。使用正向引物（5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3'）和反向引物（5'-CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3'），通过PCR扩增小鼠Per2 BAC克隆中转录起始位点上游526 bp的Per2启动子DNA片段^9-13，并将产物克隆至pENTR5'-TOPO载体（Invitrogen）中，构建pENTR5'-P(Per2)。
2. 克隆dLuc。dLuc包含萤火虫luciferase基因以及一个位于C末端的PEST序列，用于实现蛋白质的快速降解，如先前所述²¹。使用PCR扩增dLuc DNA片段，并将....

讨论

1. 当前方案的修改

1.1 记录设备与通量考虑因素

由于其商业化供应，LumiCycle（Actimetrics）已成为用于实时记录最常用的自动化发光仪设备^{4,5,9,19,29-31}。LumiCycle采用光电倍增管（PMTs）作为光检测器，具有极高的灵敏度和低噪声¹⁴，因此特别适用于极微弱的基于荧光素酶的生物发光信号的数据采集。其他类似的基于光电倍增管的设备（例如，Kronos，Atto Co.；以及POLARstar Optima，BMG labtech Inc.）也在许多研究中被广泛应用^32,33。

使用35毫米培养皿的LumiCycle检测可适用于96孔、384孔甚至1,152孔板格式，以进行高通量筛选（HTS）实验。HTS检测方法的开发主要集中在以下两个方面：1）具有更亮荧光素酶和/或更高报告基因表达水平的优化报告细胞（见下文）；2）可兼容多孔板的高灵敏度记录设备。我们及其他研究者已使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	HyClone	SH30243FS	用于常规细胞培养
DMEM	Invitrogen	12100-046	用于发光测定
FBS	HyClone	SH3091003
青霉素/链霉素/谷氨酰胺（100倍浓缩）	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-荧光素	Biosynth	L-8220
聚-L-赖氨酸	Sigma	P4707
Polybrene	默克密理博	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
所有其他化学品	Sigma
<强>仪器设备
组织培养箱			37℃、5% CO₂ °C
组织培养罩			BSL-2 认证
光 &荧光显微镜			相差可选
LumiCycle	Actimetrics