Monitoreo de células autónomas Ritmos reloj circadiano de expresión génica utilizando luciferase reporteros Bioluminiscencia

Resumen

Los relojes circadianos funcionar dentro de las células individuales, es decir, son células autónomas. A continuación, se describen los métodos para la generación de células autónomas modelos de reloj de forma no invasiva, luciferasa tiempo real basado en la tecnología de bioluminiscencia. Células Reporter proporcionar sistemas manejables, modelo funcional para el estudio de la biología circadiana.

Resumen

En los mamíferos, muchos aspectos del comportamiento y la fisiología como los ciclos de sueño-vigilia y el metabolismo del hígado son regulados por relojes circadianos endógenos (revisado ^1,2). El tiempo circadiano de mantenimiento de sistema es una estructura jerárquica multi-oscilador red, con el reloj central situado en el núcleo supraquiasmático (SCN) sincronizar y coordinar los relojes extra-SCN y periférico en otra parte ^1,2. Las células individuales son las unidades funcionales para la generación y el mantenimiento de los ritmos circadianos ^3,4, y estos osciladores de diferentes tipos de tejidos en el organismo una proporción notablemente similar mecanismo bioquímico de retroalimentación negativa. Sin embargo, debido a las interacciones a nivel de red neuronal en el SNC y por medio de señales rítmicas, sistémicas a nivel de organismos, de los ritmos circadianos en el nivel organismal no necesariamente son células autónomas de ^5-7. En comparación con los estudios tradicionales de actividad locomotora in vivo y ex vivo explantes SCN, Cell-basado en los ensayos in vitro permiten el descubrimiento de células autónomas defectos circadianos ^5,8. Estratégicamente, modelos basados ​​en células son más experimentalmente tratable para la caracterización fenotípica y rápido descubrimiento de los mecanismos de reloj básicas ^5,8-13.

Debido a que los ritmos circadianos son dinámicas, las mediciones longitudinales con alta resolución temporal son necesarios para evaluar la función del reloj. En los últimos años, grabación en tiempo real utilizando bioluminiscencia luciferasa de luciérnaga como reportero se ha convertido en una técnica común para el estudio de los ritmos circadianos en mamíferos ^14,15, ya que permite el examen de la persistencia y la dinámica de los ritmos moleculares. Para supervisar células autónomas ritmos circadianos de la expresión génica, luciferase reporteros se pueden introducir en las células a través de la transfección transitoria ^13,16,17 o transducción estable ^5,10,18,19. Aquí se describe un protocolo de transducción estable utilizando lentivirus mediada por la entrega de genes. Tsistema de vector lentiviral que es superior a los métodos tradicionales tales como la transfección transitoria y transmisión de línea germinal debido a su eficiencia y versatilidad: permite una entrega eficaz y la integración estable en el genoma huésped de tanto que se dividen y no se dividen las células ^20. Una vez que una línea celular reportera se ha establecido, la dinámica de la función de reloj se pueden examinar a través de grabación de bioluminiscencia. En primer lugar, describimos la generación de P (Per2)-D líneas Luc reportero, y luego se presentan datos de este y otros reporteros circadianos. En estos ensayos, los fibroblastos 3T3 de ratón y células de osteosarcoma humano U2OS se utilizan como modelos celulares. También se discuten las diversas formas de utilizar estos modelos en estudios reloj circadiano. Los métodos descritos aquí se pueden aplicar a una gran variedad de tipos de células para estudiar la base molecular y celular de los relojes circadianos, y puede resultar útil en la lucha contra los problemas en otros sistemas biológicos.

Protocolo

1. Construcción de Lentiviral luciferase reporteros

Un constructo reportero circadiano de mamíferos por lo general contiene un casete de expresión en la que se fusiona un promotor circadiano con el gen de la luciferasa. Tanto las estrategias de ligación y basadas en la recombinación son comúnmente utilizados para la clonación del ADN. Como ejemplo, aquí se describe un método de Gateway recombinación basada en la clonación para generar una P (Per2)-d reportero Luc lentiviral, en la que la luciferasa desestabilizado (d Luc) está bajo el control del promotor de ratón Per2.

1. Clon....

Discusión

1. Modificaciones al Protocolo actual

1.1 Los dispositivos de grabación y consideraciones de rendimiento

Debido a su disponibilidad comercial, la LumiCycle (Actimetrics) se ha convertido en el dispositivo más utilizado luminómetro automatizado para grabación en tiempo real ^{4,5,9,19,29-31.} El LumiCycle emplea tubos fotomultiplicadores (PMT) como detectores de luz, que proporcionan una sensibilidad extremadamente alta y bajo ruido ^14, y por lo tant.......

Materiales

Nombre de reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	HyClone	SH30243FS	Para el crecimiento celular normal
DMEM	Invitrogen	12100-046	Para luminometría
FBS	HyClone	SH3091003
Pen / Strep / Gln (100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-luciferina	Biosynth	L-8220
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
Todos los otros productos químicos	Sigma
			Equipo
Incubadora de cultivo de tejido			5% de CO2 a 37 ° C
Tejido capucha cultura			BSL-2 certificado
Light & microscopio fluorescente			Fase opcional contraste
LumiCycle	Actimetrics