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方法文章

利用微阵列对植物细胞壁多糖进行糖谱分析

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DOI：

10.3791/4238

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2012年12月17日

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1Australian Centre of Excellence in Plant Cell Walls, School of Botany, University of Melbourne, 2Plant Cell Biology Research Centre, School of Botany, University of Melbourne, 3CSIRO Plant Industry, Black Mountain Laboratories, 4Department of Plant Biology and Biotechnology, University of Copenhagen

本文内容

摘要

本文介绍了一种称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP）的技术，用于植物细胞壁多糖的表征。该方法结合了针对特定多糖表位的单克隆抗体的特异性与微型微阵列分析平台，可在多种生物学背景下对多糖的存在进行高通量筛选。

摘要

植物细胞壁是由多种异质性多糖构成的复杂基质，在植物的生理和发育过程中发挥着重要作用，并为人类社会提供原材料（例如木材、造纸、纺织和生物燃料工业）1,2。然而，这些组分的生物合成及其功能的研究仍然具有挑战性。

由于构成细胞壁多糖的基本单元——糖基残基的复杂性，细胞壁多糖在化学结构和构象上具有高度多样性。这些糖基残基可在多个位置形成糖苷键，并在环状结构、异构体或异头构型上存在差异，此外还带有多种非糖残基的取代基。多糖的组成在不同细胞和/或组织类型中有所不同，甚至在同一细胞壁的不同亚区域也存在差异3。此外，其组成在发育过程中1或响应环境信号时4也会发生改变。

已有超过 2,000 个基因被预测参与拟南芥（Arabidopsis）细胞壁多糖的生物合成与修饰5。然而，其中仅有少数生物合成基因得到了功能表征4,5。由于这些基因在不同细胞类型间常常差异表达，且表达水平通常较低，因此采用反向遗传学方法研究较为困难6。此外，基因冗余或补偿机制往往会阻碍突变体研究，以确保细胞壁功能得以正常维持7。因此，亟需开发新的方法，以快速表征多种多样的多糖结构，并推动功能基因组学在细胞壁生物合成与修饰研究中的应用。

单克隆抗体（mAbs）8,9 已成为确定植物中聚糖结构与分布的重要工具。这些抗体可识别存在于主要类别的植物细胞壁聚糖中的特异性表位，包括果胶、木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖和阿拉伯聚半乳聚糖。近年来，其应用已扩展到大规模筛选实验，以同时测定多种植物和组织类型中聚糖的相对丰度9,10,11。

本文介绍了一种基于微阵列的聚糖筛选方法，称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP）（图1和图2）10,11，该方法利用微型化微阵列平台，减少试剂和样品用量，可实现对多个样品（约100个）进行高通量筛选。微阵列上的点信号可进行正式定量，从而获得有关聚糖表位出现情况的半定量数据。该方法特别适用于追踪复杂生物系统中聚糖的变化12，并在缺乏细胞壁组成先验知识的情况下，提供其整体组成概况。

方案

1. 组织采集与制备

  1. 采集每种目标植物组织的新鲜组织至少三份，每份取100 mg鲜重（干重不少于10 mg）。以下步骤描述了从营养组织中制备细胞壁材料的方法。对于贮藏组织，需先通过酶法去除不需要的淀粉，再进行细胞壁多糖的提取，方法如前所述13。
  2. 使用液氮和Qiagen TissueLyser II（配备24孔适配器和3 mm碳化钨珠）将样品研磨成细粉（30 Hz，2 × 30秒）。若仅处理少量样品，可使用研钵和研杵。
  3. 将研磨后的样品转移至10 ml塑料锥形管中。
  4. 在室温下用10 ml 80% v/v乙醇洗涤样品，并剧烈涡旋振荡2分钟，以制备细胞壁材料。
  5. 在3,500 × g离心，弃去上清液。重复用70%乙醇洗涤至少三次，或直至上清液澄清，特别是含叶绿素的组织需更彻底洗涤。
  6. 最后用100%丙酮进行一次洗涤，并将含有醇不溶残渣（AIR）的沉淀在室温下静置过夜，使其自然干燥。
  7. 使用0.4 mm2孔径的筛网对AIR样品进行过筛，以获得细而均匀的粉末，并去除研磨不充分而残留的较大颗粒。
  8. 称取10 mg AIR样品至微量离心管中，每管加入一颗3 mm玻璃珠，以助样品混合均匀。

2. 细胞壁多糖的提取

  1. 将500 μl的50 μM CDTA（pH 7.5）加入各样本中，以提取果胶及与果胶相关的多聚物。
  2. 短暂涡旋振荡管子以确保溶剂与样品充分接触，然后在8 Hz条件下使用TissueLyser混合3小时。
  3. 在 12,000 x g 条件下离心样品，小心移除上清液并置于 4 °C 保存。
  4. 用1 ml去离子水重悬沉淀，以稀释并去除残留溶剂，涡旋混匀后在13,000 × g条件下离心。重复此步骤一次，注意勿扰动沉淀，每次均彻底移除管中液体后再进行下一步操作。
  5. 用 500 μl 含 0.1% w/v NaBH4 的 4M NaOH 溶液，按照步骤 2.1–2.4 中所述 CDTA 提取的相同程序，从剩余的细胞壁沉淀中依次提取交联多糖。NaBH4 用于将多糖还原端的醛基（或酮基）还原为醇基，从而 防止 多糖的碱性剥脱。
  6. 离心后，再次移除上清液并置于4 °C保存，沉淀物用去离子水洗涤两次，然后进行下一步提取。
  7. 作为可选步骤，可使用与步骤 2.1 - 2.4 相同的操作流程，用 500 μl 镉乙二胺溶液（体积分数为 31% 的 1,2-二氨基乙烷与 0.78 M CdO 混合液）提取残留的聚合物（如纤维素）。或者，可采用乙酸/硝酸法测定剩余沉淀中的总纤维素含量（见讨论部分）。

3. 打印微阵列

  1. 将含有提取细胞壁多糖的上清液在13,000 × g条件下离心，以去除任何颗粒物。
  2. 使用预先设计的自定义布局，将每个样品50 μl加入聚丙烯384孔微孔板中，样品按组织类型和提取类型排列。
  3. 用去离子水将细胞壁多糖样品进行0、5倍和25倍的系列稀释。
  4. 在控制微阵列仪的软件中设置针头高度、收集时间、停留时间以及洗涤步骤等参数。
  5. 打印室的湿度控制在60%，以防止样品蒸发。
  6. 使用LabNEXT软件及对应微阵列布局的程序启动打印任务。
  7. 机器人使用毛细管通道针将样品板中的溶液点样到固定于机器平板上的20 × 20 cm硝酸纤维素膜上。阵列上的每个点包含15 nl溶液，并以三份重复形式点样。
  8. 相同的微阵列在膜上并排打印，打印完成后切割成单独的阵列。
  9. 在每次实验中，可根据需要调整阵列以容纳更多或更少的样品、稀释度或重复数。

4. 糖芯片的探针检测

  1. 打印后，在室温下用含5% w/v脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（MPBS）封闭各微阵列2小时，以减少非特异性结合。
  2. 在MPBS中加入针对细胞壁多糖表位的单克隆抗体，孵育微阵列2小时。大多数针对细胞壁多糖的单克隆抗体可从三家公司商业购得：Biosupplies（www.biosupplies.com.au）、Carbosource Services（www.carbosource.net）和PlantProbes（www.plantprobes.net）。
  3. 设置阴性对照，即仅加入MPBS而不加一抗的微阵列。
  4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微阵列3次，每次5分钟，以去除非特异性结合。
  5. 在MPBS中加入与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，孵育微阵列2小时。大多数针对细胞壁多糖的单克隆抗体需使用抗小鼠或抗大鼠的二抗。
  6. 重复用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，以去除非特异性结合。
  7. 使用显色底物（3,3-二氨基联苯胺）或化学发光底物（鲁米诺）显影微阵列。

5. 定量分析

  1. 显色完成后，使用高分辨率（1,200 dpi）台式扫描仪扫描各个微阵列，并将图像保存为负片模式的16位TIFF文件（图3）。
  2. 使用配备自动网格工具的Xplore图像处理软件（LabNEXT）计算每个点的积分光密度。每个点的积分光密度值来源于围绕该点的网格区域内所有像素值的总和。
  3. 每个微阵列的网格数据以txt文件格式导出，可手动导入Excel电子表格进行分析。已开发一种在线工具（http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/），可自动转换和处理单个txt文件中的数据。
  4. 通过对打印重复点和稀释梯度取平均值，计算得到每个样本的“平均点强度”值（图2）。或者，也可仅使用阵列上对应单一稀释度的点信号来量化各样本中糖链表位的相对丰度。
  5. 不同样本间的相对平均点强度可通过Excel中的条件格式或在线热图工具（http://bar.utoronto.ca/welcome.htm）以热图形式展示（图4）。每种抗体类型的数据均标准化至100，并设定5%的截断值，以消除背景信号和假阳性结果。

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结果

利用CoMPP技术测定了Nicotiana alata花中六种组织类型（花药丝、花粉、子房、花瓣、萼片和柱头）中糖类的相对丰度。图3A显示了一个代表性微阵列，该阵列使用了单克隆抗体JIM5进行探针检测，JIM5特异性识别部分（低）甲酯化的同型半乳糖醛酸聚糖（HG），该表位存在于果胶多糖上14。JIM5表位在所有花组织的CDTA提取物中均被检测到，但在花粉中含量最高，在柱头组织中最低（图3A和4A）。有趣的是，JIM5表位在花粉的NaOH提取物中也有检出，但在其他组织中则未检测到（图3A）。

通过在微阵列上加入一系列纯化的多糖作为内标，可以获得有关目标糖链发生情况的定量信息（图3B）。用单克隆抗体 JIM5 检测不同组织提取物的斑点总强度，并与一系列稀释浓度的同型半乳糖醛酸聚糖（甲酯化程度为25%，DE）所产生的信号进行比对。在子房组织中，每个样品大约含有157 μg 含 JIM5 表位的同型半乳糖醛酸聚糖，约占总细胞壁残渣重量的1.5%（<...

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讨论

CoMPP 是一种快速且灵敏的方法，可在数天内对数百种植物来源样品的聚糖组成进行分析。该方法补充了已有的细菌或哺乳动物聚糖芯片平台，可用于高通量筛选碳水化合物与聚糖结合蛋白（如凝集素、受体和抗体）之间的相互作用16。由于存在大量可用于检测细胞壁聚糖的探针，因此有可能获得有关植物细胞壁中所有主要多糖类别聚糖表位的详细信息8,9。然而，这些探针仅涵盖已鉴定聚糖结构中的一小部分8,9，在某些情况下限制了CoMPP的全面解析能力。尽管如此，近年来通过使用针对植物聚糖的碳水化合物结合模块（CBMs）17，以及针对由非糖基残基（如酚类18和乙酰基残基19）修饰糖基残基所形成的表位的CBMs，已进一步拓展了这一技术的能力，这些修饰残基在聚糖功能中发挥着重要作用。

尽管CoMPP可测定一组样品中糖类的相对含量，但通过将特定样品中的结合信号与已知标准品的信号进行比较，仍有可能对连续提取物中的表位水平进行定量（图3B和C）。虽然基于微阵列...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

IEM 感谢丹麦研究理事会（FTP 和 FNU）提供的资金支持。ERL 感谢澳大利亚研究委员会（ARC）DP 项目资助的支持。AB 感谢澳大利亚研究委员会植物细胞壁卓越中心项目资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3 毫米碳化钨珠Qiagen69997
收集用微量离心管（1.2 毫米）Qiagen19560也可使用 1.5 毫升微量离心管
Qiagen TissueLyser IIQiagen85300
3 毫米玻璃珠Sigma AldrichZ143928
CDTASigma Aldrich34588
氧化镉Sigma Aldrich202894
1,2-二氨基–乙烷Sigma Aldrich03550
硝酸纤维素膜（0.22 μm 孔径）GE-water process technologiesEP2HY00010不同孔径的膜适用于不同类型的点样针
Xact II 微阵列点样机器人Labnext001AXact II 机器人配备了一个定制的 20 × 20 厘米陶瓷板，用于固定硝酸纤维素膜
Xtend RM 微阵列点样针Labnext0037-350点样针必须适用于在膜上点样
384 孔微量滴定板（聚丙烯）Greiner781207
抗聚糖单克隆抗体Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies		相关网站：PlantProbes（www.plantprobes.net）、Carbosource（www.carbosource.net）和 Biosupplies（www.biosupplies.com.au）。
抗大鼠 IgG（全分子）- 辣根过氧化物酶标记山羊抗体SigmaA9037二抗的类型取决于所用的一抗（例如由大鼠、小鼠、山羊等动物制备）。
SIGMAFAST 3,3'-二氨基联苯胺片剂SigmaD4293显色试剂的类型取决于所用的二抗及检测方法（比色法或化学发光法）。
SuperSignal West Pico 化学发光底物Thermoscientific34080参见上文
Xplore 图像处理软件LabNext008目前有多种具备自动网格化工具的软件可用于测量微阵列点的像素值。
植物多糖Sigma/Megazyme

参考文献

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