斑马鱼胚胎脑室的手动引流

摘要

我们介绍了一种收集脑脊液（CSF）并在胚胎斑马鱼脑室系统中创建缺乏脑脊液环境的方法。这使得能够进一步研究脑脊液的成分及其在胚胎脑发育过程中的必要性。

摘要

脑脊液（CSF）是一种富含蛋白质的液体，存在于脑室系统内。它在脊椎动物胚胎发育早期即已出现，并持续存在于整个生命周期。成体脑脊液被认为具有缓冲大脑、清除代谢废物以及运输分泌分子的功能^1,2。在成体及较晚期的胚胎中，大部分脑脊液由脉络丛产生，脉络丛是一组高度血管化的分泌结构，位于脑室附近^3-5。在斑马鱼中，脉络丛在受精后144小时（hpf）完全形成⁶。在此之前，在斑马鱼以及其他脊椎动物胚胎（包括小鼠）中，均已存在大量胚胎期脑脊液（eCSF）。这些数据以及在鸡胚中的研究表明，在发育早期，神经上皮具有分泌功能，可能在脉络丛发育之前是eCSF的主要来源⁷。

胚胎脑脊液（eCSF）所含蛋白质约为成人脑脊液（CSF）的三倍，提示其在发育过程中可能发挥重要作用^8,9。在鸡和小鼠中的研究表明，eCSF中的分泌因子、流体压力或二者共同作用，对神经上皮中的神经发生、基因表达、细胞增殖和细胞存活具有重要意义^10-20。对人、大鼠、小鼠和鸡的eCSF进行的蛋白质组学分析已鉴定出多种可能对脑脊液功能至关重要的蛋白质，包括细胞外基质成分、载脂蛋白、调节渗透压的蛋白质，以及参与细胞死亡和增殖的蛋白质^21-24。然而，eCSF的复杂功能在很大程度上仍不明确。

我们建立了一种从斑马鱼脑室中移除胚胎脑脊液（eCSF）的方法，从而能够鉴定eCSF的成分，并分析其在发育过程中的必要性。尽管其他具有较大胚胎的脊椎动物体系可收集到更多的eCSF，但斑马鱼可在发育的最早阶段收集eCSF，并可在导致脑室体积或形态异常的遗传或环境条件下进行收集。eCSF的移除与收集使其可用于质谱分析、eCSF功能研究，以及将特定因子重新引入脑室以检测其功能。因此，斑马鱼早期胚胎的可及性为深入分析eCSF在发育过程中的功能提供了便利。

方案

1. 制备显微注射针和细胞转移管

1. 根据制造商的说明，用矿物油填充 Eppendorf CellTram 油微注射装置。
2. 使用 Sutter 仪器的拉针仪拉制毛细管，制备微注射针。
3. 将注射针安装到与 Eppendorf CellTram 相连的显微操作器上。
4. 小心折断针尖。为确保针尖尺寸一致，可用千分尺测量，或与参考针进行比较。
5. 使用 CellTram 将油推入针的全长以充满整个针管，注意避免产生气泡。

2. 胚胎的制备

1. 用1-200 μl移液枪头在1%琼脂糖包被的培养皿上戳孔，并移除琼脂糖塞。用胚胎培养基（按Westerfield²⁵方法配制）填充培养皿。
2. 在体视显微镜下，用镊子去除胚胎的卵膜。
3. 将去卵膜的胚胎转移至琼脂糖包被的培养皿中。
4. 为麻醉胚胎，向琼脂糖培养皿中加入Tricaine（0.1 mg/ml），直至胚胎停止运动（按Westerfield²⁵方法配制）。

3. 引流脑脊液

1. 将胚胎的尾部置于琼脂糖小孔中，使其后侧靠近显微操作仪，以便观察脑的背侧。
2. 将针头定位在菱脑节0/1的铰接点或后脑室最宽处（图1A）。
3. 小心刺穿后脑室的顶板，注意不要穿透脑组织进入卵黄。
4. 使用CellTram排出脑外液（eCSF），并将液体收集至显微注射针头中。注意避免吸入任何细胞。

4. 收集脑脊液用于成分分析

1. 一旦在针头中收集到脑脊液（eCSF），请小心停止CellTram的吸力。
2. 将培养皿从针头下方移开，并小心地将针头移至含有所需缓冲液的离心管中。
3. 使用CellTram将针头中的eCSF排入缓冲液中，尽量避免将油滴带入溶液造成污染。
4. 为了去除与eCSF一同吸入的细胞，将eCSF在10,000 × g条件下离心。收集未受污染的eCSF（上清液），并于-80 °C保存，直至进行后续分析。

5. 特定因子的重新引入

1. 在所需时间段内每2小时排空一次脑脊液（eCSF），因为该液体在此期间内会得到补充。在两次排液时间点之间，取出针头并将胚胎保存在28.5 °C或所需温度下。
2. 用待测因子加载第二根微移液针。
3. 将针头放入连接至显微注射仪的显微操作器中。
4. 通过测量油中液滴大小并调整注射时间和压力，将注射体积调节至1 nl。
5. 按照先前所述方法²⁶向脑室注射1–2 nl。

结果

排空脑室的示例见图1B-C。由于缺乏脑室外液（eCSF），脑室呈现塌陷状态（图1B 与 C）。从背侧图像可见（图1B-C 及 图2A-D），后脑神经上皮仍保持其特征性形态，尽管缺乏eCSF，腔体似乎仍开放，这可能是由于存在坚固的铰链点所致。然而，侧视图（图2A'-D'）显示后脑脑室已被排空，这与存在一层薄而柔韧的顶板上皮、其向腹侧塌陷的表现一致。在野生型胚胎中，eCSF会持续生成，并在排空后2-3小时重新充满脑室（图2）。因此，在感兴趣的时间段内需要持续耗尽脑脊液（CSF）。

尽管在24 hpf时移除脑脊液不会破坏整体形态或发育，但在更长的发育阶段持续移除脑脊液可能对整体发育产生不利影响。在评估注入脑室的因子的有效性时，应考虑这一因素。此外，为了确定发育缺陷是由脑脊液的缺失引起，还是由针头穿刺脑组织所致，一个重要的对照实验是将针头插入脑内但不移除脑脊液。

讨论

采用该技术手动抽取斑马鱼脑室中的胚胎脑脊液（eCSF），将有助于确定eCSF在发育过程中的必要性。此外，该技术可实现对胚胎发育过程中eCSF蛋白质谱的系统描述。在此期间鉴定出的不同蛋白质将推动对脑脊液功能及其在脑发育中潜在作用的进一步研究。在羊膜动物中，已在eCSF中鉴定出一些因子（如IGF2、FGF2、视黄酸和载脂蛋白），已被证实参与神经上皮细胞的存活、增殖及神经发生^{13,17,20,23,27,28}。然而，在脉络丛形成后获取的eCSF中似乎存在数百种尚未表征的蛋白质，其采集时间晚于本研究中所示的时间点。此外，本实验室及其他研究团队已鉴定出具有异常脑室大小或脑部缺陷的斑马鱼突变体^29-31，这些突变体可能在eCSF的组成和功能上存在异常。本方法可便捷地用于分离并检测来自突变体或不同环境条件下的潜在异常eCSF。

斑马鱼系统的一个强大应用是：在去除脑脊液（eCSF）后，通过向脑室注射来替换特定因子，从而检测这些因子在脑发育过程中的功能。可测试经遗传或化学干预后获得的小分子、蛋白质以及eCSF。将来自其他物种的eCSF重新引入，将有助于跨物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eppendorf CellTram Oil	Eppendorf	516 000.025
矿物油	Sigma	M8410
三卡因粉末	Sigma	A5040
毛细管	FHC 公司	30-30-1