腺病毒颗粒被改造为含有非天然氨基酸类似物叠氮高丝氨酸或叠氮糖O-GlcNAz。通过“点击”化学反应，每种分子中的叠氮基团可发生化学选择性连接，从而实现病毒表面的修饰。
本文内容
摘要
摘要
病毒颗粒的修饰因其在基因治疗、溶瘤应用和疫苗开发方面巨大的潜力而受到广泛关注。1,2,3 目前对病毒表面进行修饰的方法主要基于遗传学手段，但常常存在病毒产量降低、感染性减弱以及细胞转导效率下降等问题。4,5 我们利用化学选择性点击化学反应，开发了一种简单直接的替代方法，可规避上述问题，同时兼具高度灵活性和可操作性。1,2
本实验方案的目的是展示利用生物正交点击化学修饰5型腺病毒颗粒表面的有效性。这一两步法既可用于治疗1，也可用于分析2,6，因为它能够将靶向分子、染料或其他感兴趣的分子以化学选择性的方式连接到预先标记有叠氮基团的蛋白质上。该方法具有三个主要优势：（1）代谢标记对病毒适应性几乎没有或完全没有影响1,7；（2）可使用多种效应配体；（3）反应速度极快，且具有高度可靠性和易操作性1,2,7。
在该实验的第一步中，产生携带叠氮高丝氨酸（Aha，一种甲硫氨酸类似物）或非天然糖O-连接的N-叠氮乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAz）的腺病毒颗粒，二者均含有叠氮（-N3）官能团。在纯化叠氮修饰的病毒颗粒后，通过化学选择性连接方式将含有荧光TAMRA基团的炔烃探针连接至预先标记的蛋白质或糖蛋白上。最后，通过SDS-PAGE分析验证探针成功连接至病毒衣壳蛋白。结果显示，Aha的掺入可标记所有病毒衣壳蛋白（六邻体、五邻体和纤维蛋白），而O-GlcNAz的掺入仅能标记纤维蛋白。
在这一不断发展的领域中，已成功开发出多种叠氮-炔烃连接方法；但本文仅展示其中我们发现最为便捷的两种方法——应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）以及在无氧气氛下进行的铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）。
方案
有关本方案中提及的所有培养基、缓冲液和溶液的配制，请参见表1。
1. Aha标记腺病毒的制备
- 准备十一皿100 mm组织培养皿，其中培养有人胚肾细胞（HEK 293），使用HEK 293细胞生长培养基（见表1）在37 °C条件下培养，直至细胞融合度达到80 - 90%。（注意：融合度超过90%的培养物可能难以感染，且病毒产量可能不理想。）
- 通过先移除培养基，用5 ml TD缓冲液冲洗一次，然后在1 ml胰蛋白酶-EDTA（1×）中孵育1分钟，使其中一皿的细胞松解。
- 加入9 ml HEK 293细胞生长培养基，并使用血细胞计数板对本皿收获的HEK 293细胞数量进行计数。利用该数值，根据感染复数（MOI）为10 PFU / 细胞的条件，计算感染所需的5型腺病毒（Ad5）用量。需考虑正常Ad5的感染性指数（感染性颗粒与总颗粒数之比）通常为1:20。
- 准备10 ml感染缓冲液。
- 缓慢移除其余十个培养皿中的HEK 293细胞生长培养基，然后用5 ml TD缓冲液洗涤。每皿加入1 ml感染缓冲液，并在37 °C孵育1小时。在感染期间，每隔15分钟轻柔地将每皿培养皿左右摇动一次。
- 感染结束后，每皿加入9 ml新鲜HEK 293细胞生长培养基，并在37 °C继续孵育18小时。
- 准备100 ml Aha标记培养基（对照组使用甲硫氨酸对照培养基）。在配制标记培养基前，务必使用0.2-μm无菌注射器滤器过滤浓缩储备液。
- 孵育18小时后，小心移除HEK 293细胞生长培养基（避免冲走感染的细胞），并用5 ml TD缓冲液洗涤每皿。
- 移除TD缓冲液洗涤液，每皿加入10 ml Aha标记培养基。作为对照，此步骤应使用甲硫氨酸对照培养基代替Aha标记培养基。
- 将感染的细胞在标记培养基中于37 °C孵育6小时。标记可在感染后12 - 24小时之间的任意时间进行，但持续时间不应超过6小时。该时间间隔已被确定为可在最大程度重叠病毒结构蛋白翻译的同时，确保感染性不显著降低。7
- 小心移除标记培养基，避免扰动细胞。每皿加入10 ml新鲜HEK 293细胞生长培养基，并在37 °C继续孵育18小时。为尽量减少此步骤中感染细胞的丢失，无需完全移除标记溶液。HEK 293细胞生长培养基中含有过量甲硫氨酸，可竞争性抑制任何残留的Aha。
- 进入步骤3进行纯化。
2. 叠氮糖标记腺病毒的制备
- 按照名为“生产Aha标记的腺病毒”的实验方案，进行至第1.5步。
- 准备100 ml叠氮糖标记培养基。
- 用10 ml新鲜的叠氮糖标记培养基覆盖细胞，在37 °C孵育44小时。
3. 叠氮标记腺病毒颗粒的纯化
- 从每个培养皿中移除培养基及感染的细胞，并转移至锥形管中。在4 °C条件下，以2,000 g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于TD缓冲液中（每10个培养皿使用8 ml TD缓冲液）。
- 使用液氮杜瓦瓶和37 °C水浴，通过反复（3次或以上）冻融循环裂解感染的细胞。在4 °C条件下以2,000 g离心10分钟，以分离细胞碎片和上清液。
- 通过先将2.5 ml浓度为1.25 g/ml的CsCl溶液用移液器加入Ultra Clear离心管中，制备CsCl密度梯度离心管。接着，将移液器的吸头置于管底，缓慢加入2.0 ml浓度为1.4 g/ml的CsCl溶液，注意不要扰动梯度界面。
- 将步骤3.2中的上清液小心地加至CsCl密度梯度管顶部，必要时用TD缓冲液加满离心管。在超速离心机中，使用摆动桶转子于15 °C以125,000 g离心1小时。
- 超速离心完成后，病毒颗粒应在两种CsCl溶液的界面处呈现为一条浓密的白色条带。用无菌针头在管底刺一小孔，使溶液逐滴流出。
- 收集浓密的白色条带（应含有标记的Ad5颗粒），注意避免过量CsCl溶液。避免收集位于病毒层上方的细胞蛋白条带，同时排除位于浓密白色病毒条带稍上方的较浅层空病毒衣壳。
- 可选步骤：对标记的Ad5颗粒进行最终纯化。将步骤3.6中收集的组分加入4 ml超速离心管中，并用1.35 g/ml的CsCl溶液加满离心管。在15 °C下以125,000 g离心18小时，并按照步骤3.5和3.6所述方法收集在管中部形成的浓密白色条带。（注意：若病毒滴度较低，第二次离心后可能无法观察到白色条带，因而无法回收标记病毒。）
- 如需长期保存病毒颗粒，应对收集的病毒提取物进行针对病毒储存缓冲液的透析处理。将透析后的病毒样品储存在-80 °C。
4. 使用应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）将修饰的腺病毒颗粒与炔烃探针连接
- 在 50 μl 病毒储存缓冲液中的叠氮化修饰 Ad5 溶液中，加入 0.25 μl SPAAC 标记溶液。（有关市售张力炔烃试剂供应商列表，请参见试剂表）。
- 在室温下避光孵育过夜，使张力促进的环加成反应进行。若使用对光敏感的探针（例如 TAMRA），需用铝箔包裹反应容器。
- 按照步骤 6 的方法纯化标记后的病毒。
5. 在脱氧气氛下利用铜(I)催化叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）将修饰的腺病毒颗粒与炔烃探针连接
- 在一个 Eppendorf 管中加入 7.2 mg 氯化亚铜（CuBr）粉末，并用铝箔包裹。
- 用移液器将 1 ml DMSO 加入第二个 Eppendorf 管中。
- 在第三个 Eppendorf 管中配制 50 μl 的 CuAAC 标记溶液。如果炔烃探针对光敏感（例如 TAMRA-Alkyne），则用铝箔包裹。
- 将上述三个未加盖的 Eppendorf 管置于脱氧手套袋中，放置 6 小时。所有样品在完成 CuAAC 反应前均应保留在手套袋内。
- 通过向已根据步骤 5.4 进行脱氧处理的 7.2 mg CuBr 粉末中加入 1 ml 已脱氧的 DMSO，配制 50× 的 CuBr 储存液。
- 向已根据步骤 5.4 进行脱氧处理的 50 μl CuAAC 标记溶液中加入 1 μl 上述 CuBr 储存液，启动 CuAAC 反应。反应在手套袋内继续进行 12 小时。
- 根据步骤 6 对标记后的病毒进行纯化。
6. 标记病毒颗粒的纯化与保存
- 使用已用病毒储存缓冲液平衡的Centri-Sep凝胶过滤离心柱，按照制造商指南纯化标记的病毒样品。
- 或者，可通过在病毒储存缓冲液中透析进行纯化。
- 标记的病毒颗粒应保存在-80 °C条件下。
7. 标记腺病毒的SDS-PAGE及荧光凝胶扫描
- 向20 μl纯化的标记病毒中加入20 μl Laemmli上样缓冲液（2×），煮沸10分钟。离心样品30秒以去除任何不溶性沉淀物。如果纯化后仍残留铜离子，煮沸样品可能导致SDS-PAGE凝胶上出现明显的蛋白质拖尾条带，影响后续成像。在此情况下，应省略本步骤中的煮沸处理。
- 将凝胶板固定在电泳槽中并加入电泳缓冲液。将病毒蛋白样品加入所需数量的加样孔中，留一孔加入预染蛋白分子量标准品。在200 V电压下电泳运行1小时。整个过程中用电泳槽覆盖铝箔，以减少荧光染料标记物的光漂白。
- 为获得最佳分辨效果并彻底去除游离荧光染料，应使示踪染料完全跑出凝胶。停止电泳后，迅速将凝胶转移至荧光凝胶扫描仪，并在适当波长下（TAMRA为574 nm）扫描检测荧光信号。
- 通过测定多个标准浓度TAMRA的荧光强度，并与步骤7.3中的样品进行比较，可定量每颗病毒颗粒所偶联的染料分子数量。
8. 代表性结果
TAMRA 标记的 Ad5 经 SDS-PAGE 及荧光凝胶扫描所观察到的结果如图 3所示。尽管这些荧光凝胶扫描是在通过 CuAAC 修饰的样品上进行的，但当探针通过 SPAAC 连接时，结果应具有可比性。这些凝胶扫描结果表明，Aha 标记导致 Ad5 衣壳蛋白中的三种蛋白（六邻体、五邻体和纤维蛋白）均被修饰，而糖标记仅修饰纤维蛋白。此外，Aha 浓度的增加（4 mM 与 32 mM 相比）导致更高的 Aha 掺入程度，但也已被证明会降低病毒的感染性。先前的研究结果7表明，对于在 4 mM Aha 中产生的 Ad5，大约 5% 的暴露甲硫氨酸位点被 TAMRA 修饰，当使用 32 mM Aha 时，该比例增加至 10%。这分别对应于每个 Ad5 颗粒上约有 280 和 510 个染料标记位点。对糖标记的分析1表明，Ad5 上 36 个糖基化位点中约有 22 个被叠氮糖占据，并随后被 TAMRA 标记。
如果按照本方案使用十个组织培养板来制备叠氮化修饰的Ad5病毒，则应从第3.6步收集的白色条带中获得200 - 300 μl的叠氮化修饰病毒，滴度约为1.5 × 1012 粒子 / ml。该纯化步骤中常见的问题是未出现病毒条带，这通常归因于病毒滴度过低。这一般是由于感染的细胞密度过高或过低，或在第1步冲洗过程中将感染后从培养板上松动脱落的细胞洗去所致。
图1. 实验流程概述。首先将含叠氮基团的Aha或GalNAz整合入腺病毒颗粒中，随后通过“点击化学”与荧光炔烃探针进行连接反应，最后利用SDS-PAGE验证荧光探针的连接效果。
图 2. 通过 (a) SPAAC、(b) 去氧条件下 CuAAC 及 (c) 有氧条件下 CuAAC 将炔烃探针连接至叠氮修饰的病毒。
图3. 叠氮标记的5型腺病毒（Ad5）经CuAAC反应与TAMRA-炔烃偶联后SDS-PAGE的荧光扫描图。（a）使用两种不同浓度Aha标记的Ad5。标记主要出现在腺病毒的六邻体（Hexon）、五邻体（Penton）和纤维（Fiber）衣壳蛋白上，且标记程度随Aha浓度增加而增强。（b）Ac4GalNAz标记的腺病毒似乎仅在纤维衣壳蛋白上发生标记。
| 溶液 | 准备 | 注意事项 |
| Ad5 储存缓冲液 | 5 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0），含 0.5 mM MgCl2，50 mM NaCl、25%（v/v）甘油和0.05%（w/v）牛血清白蛋白（BSA） | 储存于 -20 °C |
| Ad5 感染缓冲液 | 2% (v/v) 牛胎血清，1× TC 溶液，储存缓冲液中的 Ad5（体积根据 MOI 为 10 PFU/细胞和感染指数为 1:20 确定）。用 TD 缓冲液定容至终体积 | 可通过紫外吸收法测定Ad5浓度。 |
| TC溶液（200×） | 136 mM CaCl2，100 mM MgCl2 | 储存于 4 °C |
| TD缓冲液 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.07 mM Na2HPO4，以及 25 mM Tris-HCl，pH 7.5 | 储存于 4 °C |
| HEK 293细胞培养基 | Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 10% (v/v) 小牛血清（BCS）和 1% (v/v) 青霉素-链霉素 | 储存于 4 °C |
| 半胱氨酸储备液（100×） | DMEM（不含甲硫氨酸/不含半胱氨酸）添加200 mM L-半胱氨酸 | 制备新鲜溶液，并用 0.2-μm 使用前用无菌注射器滤器过滤。 |
| Aha 储存液（25×） | DMEM（-Met / -Cys），添加100 mM L-叠氮高丙氨酸 | 制备新鲜溶液，并用 0.2-μm 使用前用无菌注射器滤器过滤。 |
| Aha 标记培养基 | DMEM（-Met / -Cys），添加10% BCS、Aha储存液（1×）、2 mM L-Cysteine | 使用前新鲜配制。 这相当于4 mM的Aha浓度，尽管可以使用不同的浓度（参见 代表性结果). |
| 甲硫氨酸储备液（25×） | DMEM（-Met / -Cys），添加100 mM L-甲硫氨酸 | 制备新鲜溶液，并用 0.2-μm 使用前用无菌注射器滤器过滤。 |
| 对照培养基 | DMEM（-Met / -Cys），添加10% BCS、Met储存液（1×）、2 mM L-Cysteine | 使用前新鲜配制。 |
| 乙酰化4GalNAz 储存液（1,000×） | 50 mM 乙酰化产物 N-叠氮乙酰半乳糖胺 (Ac4甲醇中的 GalNAz | 储存于 4 °C. 乙酰化4GalNAz 是 GlcNAz 的代谢前体。 |
| 叠氮糖标记培养基 | 100 μl 乙酰化4GalNAz 储存液，100 ml HEK 293 细胞培养基 | 在加入HEK 293细胞培养基之前，让甲醇完全挥发。 |
| 氯化铯溶液 | TD缓冲液中溶解的CsCl： 1.25 g/ml（18.08 g / 50 ml H2O 1.35 g/ml（25.60 g / 50 ml H2O 1.40 g/ml（31.00 g / 50 ml H2O | 用于超速离心的密度梯度 |
| 病毒储存缓冲液 | 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.2，含 0.5 mM CaCl2，0.9 mM MgCl2，以及10% (v/v) 甘油 | 储存于 -20 °C |
| TAMRA-BCN（SPAAC）标记溶液 | TAMRA-BCN 在 DMSO 中：
| 应变促进型炔烃探针 对于SDS-PAGE，病毒滴度约为1012 建议每毫升颗粒数 |
| TAMRA-炔烃（CuAAC）标记溶液 | 50 μl 叠氮修饰的Ad5在病毒储存缓冲液中的情况（NAd5 （如上所述测定），1.5 mM 浴吩嗪二磺酸盐（bathophenanthroline disulfonate）即 1.5 × 终浓度 CuBr)，TAMRA-炔烃 TAMRA-炔烃 摩尔浓度（单位：M）通过以下方法确定： cAlk = 2 × 106 × (NAd5 / NAvo) （使第5步制备的反应混合物中每病毒颗粒含有100个炔烃探针） | Tris 缓冲液是铜的竞争性抑制配体。8 |
| Laemmli 上样缓冲液 (2×) | 125 mM Tris-HCl (pH 6.8)，4% (w/v) SDS，20% (v/v) 甘油，10% (v/v) 2-巯基乙醇，以及 0.004% (w/v) 溴酚蓝 | |
| 运行缓冲液 | 187 mM 甘氨酸，19 mM Tris-HCl，3.5 mM SDS 溶于 H2O | 储存于 4 °C |
表1. 本实验方案所需缓冲液和溶液的配制。
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讨论
叠氮化合物的化学选择性和生物正交点击反应的研究领域发展迅速，因此可用于生物偶联应用的此类反应种类日益增多。本实验方案仅限于其中两种方法，选择依据是这些方法在我们实验室中的实用性以及所有试剂均可商业化获得。
在第一种此类路线——应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）中，炔烃包含在环辛炔环内（图2a）。这一近期发展起来的方法可在含氧气氛下进行，且无需铜催化剂。9,10 此前，该方法的一个缺点是这些应变炔烃的合成较为繁琐，且商业化供应不如铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）中使用的端炔丰富；然而，目前这类探针的种类日益增多，并已实现商业化供应（参见试剂列表）。基于上述原因，本实验方案选择SPAAC作为首选方法。
本方案还描述了在脱氧气氛下，使用邻菲啰啉二磺酸二钠盐（BDA）作为螯合剂，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）连接叠氮修饰的腺病毒颗粒的方法（图2b）。该方法的优势在于，BDA催化剂 commercially avai...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢美国国家科学基金会（NSF）的资助（CBET-0846259）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含GFP转基因的5型腺病毒（Ad5） | BCBC | 391 | |
| 人胚胎肾（HEK 293）细胞 | ATCC | CRL-1573 | |
| 高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Invitrogen | 11965-092 | |
| 高糖型缺甲硫氨酸和半胱氨酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM -Met / -Cys） | Invitrogen | 21013-024 | |
| 牛犊血清 | Invitrogen | 16170-078 | |
| 青霉素-链霉素 100× 溶液（青霉素-链霉素） | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm 细胞培养皿，经组织培养处理的聚苯乙烯 | BD Falcon | 353003 | |
| 细胞培养 CO2 培养箱 | |||
| 血细胞计数板 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 无菌注射器滤器（0.2 μm，醋酸纤维素 | VWR | 28145-477（北美），514-0061（欧洲） | |
| Avanti J-E 离心机 | 贝克曼库尔特 | 369001 | |
| 锥形管（50 ml，无菌） | BD Falcon | 352098 | |
| 超薄管，超透明，13.2 ml，14 × 89 mm | 贝克曼 | 344059 | |
| 配备 SW 41 和 SW 60 转子的超速离心机 | 贝克曼 | ||
| Eppendorf Biopur Safe-Lock 管，1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| 离心机 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep 凝胶过滤离心柱 | 普林斯顿分离技术公司 | CS-901 | |
| 无菌针头，18号 | |||
| 氮气手套袋（若进行脱氧CuAAC反应） | |||
| 杜瓦瓶 | |||
| 液氮 | |||
| 电泳槽 | |||
| 荧光凝胶扫描仪 | |||
| Ready Gel Tris-HCl 凝胶 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-1105 | |
| L-叠氮高丙氨酸 | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| 全乙酰化 N-叠氮乙酰基半乳糖胺（Ac4GalNAz | Invitrogen | C33365 | |
| 赛默飞世尔科技 | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| 邻二氮杂菲二磺酸（BDA）二钠盐 | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | |||
| 甲醇 | |||
| Tris 碱（三（羟甲基）氨基甲烷） | |||
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4) | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| 1 M HCl | |||
| 甘油 | |||
| 牛血清白蛋白 | |||
| L-半胱氨酸 | |||
| L-甲硫氨酸 | |||
| SDS（十二烷基硫酸钠） | |||
| 2-巯基–乙醇 | |||
| 甘氨酸 | |||
| 溴酚蓝 | |||
| 氯化铯（CsCl） | |||
| 溴化亚铜（CuBr） | |||
| 氯化钙（CaCl2) | |||
| 氯化钾（KCl） | |||
| 氯化镁（MgCl2) | |||
| 氯化钠（NaCl） | |||
| <强>用于CuAAC的炔烃探针* | |||
| TAMRA 炔烃 | Invitrogen | T10183 | |
| <强>用于SPAAC的张力炔烃探针* | |||
| TAMRA DIBO 炔烃 | Invitrogen | C10410 | |
提供点击化学试剂和试剂盒的主要供应商包括 Invitrogen、Jena Biosciences、Berry Associates、Sigma-Aldrich、Glen Research、Click Chemistry Tools 和 Baseclick。这些供应商的产品目录中包含多种炔烃染料和靶向配体。 |
参考文献
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