通过生物正交点击化学实现病毒表面的化学选择性修饰

摘要

腺病毒颗粒被改造为含有非天然氨基酸类似物叠氮高丝氨酸或叠氮糖O-GlcNAz。通过“点击”化学反应，每种分子中的叠氮基团可发生化学选择性连接，从而实现病毒表面的修饰。

摘要

病毒颗粒的修饰因其在基因治疗、溶瘤应用和疫苗开发方面巨大的潜力而受到广泛关注。^1,2,3 目前对病毒表面进行修饰的方法主要基于遗传学手段，但常常存在病毒产量降低、感染性减弱以及细胞转导效率下降等问题。^4,5 我们利用化学选择性点击化学反应，开发了一种简单直接的替代方法，可规避上述问题，同时兼具高度灵活性和可操作性。^1,2

本实验方案的目的是展示利用生物正交点击化学修饰5型腺病毒颗粒表面的有效性。这一两步法既可用于治疗¹，也可用于分析^2,6，因为它能够将靶向分子、染料或其他感兴趣的分子以化学选择性的方式连接到预先标记有叠氮基团的蛋白质上。该方法具有三个主要优势：（1）代谢标记对病毒适应性几乎没有或完全没有影响^1,7；（2）可使用多种效应配体；（3）反应速度极快，且具有高度可靠性和易操作性^1,2,7。

在该实验的第一步中，产生携带叠氮高丝氨酸（Aha，一种甲硫氨酸类似物）或非天然糖O-连接的N-叠氮乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAz）的腺病毒颗粒，二者均含有叠氮（-N₃）官能团。在纯化叠氮修饰的病毒颗粒后，通过化学选择性连接方式将含有荧光TAMRA基团的炔烃探针连接至预先标记的蛋白质或糖蛋白上。最后，通过SDS-PAGE分析验证探针成功连接至病毒衣壳蛋白。结果显示，Aha的掺入可标记所有病毒衣壳蛋白（六邻体、五邻体和纤维蛋白），而O-GlcNAz的掺入仅能标记纤维蛋白。

在这一不断发展的领域中，已成功开发出多种叠氮-炔烃连接方法；但本文仅展示其中我们发现最为便捷的两种方法——应变促进的叠氮-炔烃环加成反应（SPAAC）以及在无氧气氛下进行的铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）。

方案

有关本方案中提及的所有培养基、缓冲液和溶液的配制，请参见表1。

1. Aha标记腺病毒的制备

1. 准备十一皿100 mm组织培养皿，其中培养有人胚肾细胞（HEK 293），使用HEK 293细胞生长培养基（见表1）在37 °C条件下培养，直至细胞融合度达到80 - 90%。（注意：融合度超过90%的培养物可能难以感染，且病毒产量可能不理想。）
2. 通过先移除培养基，用5 ml TD缓冲液冲洗一次，然后在1 ml胰蛋白酶-EDTA（1×）中孵育1分钟，使其中一皿的细胞松解。
3. 加入9 ml HEK 293细胞生长培养基，并使用血细胞计数板对本皿收获的HEK 293细胞数量进行计数。利用该数值，根据感染复数（MOI）为10 PFU / 细胞的条件，计算感染所需的5型腺病毒（Ad5）用量。需考虑正常Ad5的感染性指数（感染性颗粒与总颗粒数之比）通常为1:20。
4. 准备10 ml感染缓冲液。
5. 缓慢移除其余十个培养皿中的HEK 293细胞生长培养基，然后用5 ml TD缓冲液洗涤。每皿加入1 ml感染缓冲液，并在37 °C孵育1小时。在感染期间，每隔15分钟轻柔地将每皿培养皿左右摇动一次。
6. 感染结束后，每皿加入9 ml新鲜HEK 293细胞生长培养基，并在37 °C继续孵育18小时。<....

讨论

叠氮化合物的化学选择性和生物正交点击反应的研究领域发展迅速，因此可用于生物偶联应用的此类反应种类日益增多。本实验方案仅限于其中两种方法，选择依据是这些方法在我们实验室中的实用性以及所有试剂均可商业化获得。

在第一种此类路线——应变促进的叠氮-炔烃环加成（SPAAC）中，炔烃包含在环辛炔环内（图2a）。这一近期发展起来的方法可在含氧气氛下进行，且无需铜催化剂。^9,10 此前，该方法的一个缺点是这些应变炔烃的合成较为繁琐，且商业化供应不如铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成（CuAAC）中使用的端炔丰富；然而，目前这类探针的种类日益增多，并已实现商业化供应（参见试剂列表）。基于上述原因，本实验方案选择SPAAC作为首选方法。

本方案还描述了在脱氧气氛下，使用邻菲啰啉二磺酸二钠盐（BDA）作为螯合剂，通过铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）连接叠氮修饰的腺病毒颗粒的方法（图2b）。该方法的优势在于，BDA催化剂 commercially avai.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含GFP转基因的5型腺病毒（Ad5）	BCBC	391
人胚胎肾（HEK 293）细胞	ATCC	CRL-1573
高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Invitrogen	11965-092
高糖型缺甲硫氨酸和半胱氨酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM -Met / -Cys）	Invitrogen	21013-024
牛犊血清	Invitrogen	16170-078
青霉素-链霉素 100× 溶液（青霉素-链霉素）	Invitrogen	15140-122
0.5% 胰蛋白酶-EDTA（10×)	Invitrogen	15400-054
100 mm 细胞培养皿，经组织培养处理的聚苯乙烯	BD Falcon	353003
细胞培养 CO2 培养箱
血细胞计数板
生物安全柜
无菌注射器滤器（0.2 μm，醋酸纤维素	VWR	28145-477（北美），514-0061（欧洲）
Avanti J-E 离心机	贝克曼库尔特	369001
锥形管（50 ml，无菌）	BD Falcon	352098
超薄管，超透明，13.2 ml，14 × 89 mm	贝克曼	344059
配备 SW 41 和 SW 60 转子的超速离心机	贝克曼
Eppendorf Biopur Safe-Lock 管，1.5 ml	Eppendorf	0030 121.589
离心机 5418	Eppendorf	5418
Centri-Sep 凝胶过滤离心柱	普林斯顿分离技术公司	CS-901
无菌针头，18号
氮气手套袋（若进行脱氧CuAAC反应）
杜瓦瓶
液氮
电泳槽
荧光凝胶扫描仪
Ready Gel Tris-HCl 凝胶	伯乐（Bio-Rad）	161-1105
L-叠氮高丙氨酸	AnaSpec	63669
Jena Biosciences	CLK-AA005
全乙酰化 N-叠氮乙酰基半乳糖胺（Ac4GalNAz	Invitrogen	C33365
赛默飞世尔科技	88905
Sigma-Aldrich	A7480
邻二氮杂菲二磺酸（BDA）二钠盐	MP Biomedicals	0215011201
二甲基亚砜（DMSO）
甲醇
Tris 碱（三（羟甲基）氨基甲烷）
磷酸氢二钠（Na2HPO4)
磷酸盐缓冲液（PBS）
1 M HCl
甘油
牛血清白蛋白
L-半胱氨酸
L-甲硫氨酸
SDS（十二烷基硫酸钠）
2-巯基–乙醇
甘氨酸
溴酚蓝
氯化铯（CsCl）
溴化亚铜（CuBr）
氯化钙（CaCl2)
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl2)
氯化钠（NaCl）
<强>用于CuAAC的炔烃探针*
TAMRA 炔烃	Invitrogen	T10183
<强>用于SPAAC的张力炔烃探针*
TAMRA DIBO 炔烃	Invitrogen	C10410
提供点击化学试剂和试剂盒的主要供应商包括 Invitrogen、Jena Biosciences、Berry Associates、Sigma-Aldrich、Glen Research、Click Chemistry Tools 和 Baseclick。这些供应商的产品目录中包含多种炔烃染料和靶向配体。