通过在同一样本血浆上连续进行ELISA，可对多个候选生物标志物进行高通量验证，从而最大限度地减少冻融循环次数并节约珍贵的血浆样本。本文演示如何在同一血浆样本上连续检测六种已验证的移植物抗宿主病（GVHD）4血浆生物标志物1-3的ELISA操作方法。
方法文章
高通量连续ELISA法验证急性移植物抗宿主病生物标志物
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
非靶向发现蛋白质组学策略有可能鉴定出大量新型生物标志物，从而改善临床环境中的诊断和预后检测，并可能指导治疗干预。当鉴定出大量候选蛋白质时，从那些由事件驱动、体积有限且不可替代的患者血浆样本中及时高效地验证候选生物标志物可能会面临困难，例如在异基因造血干细胞移植（HSCT）后可能危及生命的并发症——急性移植物抗宿主病（GVHD）发作时的样本。
本文描述了以连续方式进行六种经验证的移植物抗宿主病（GVHD）蛋白的商业化ELISA检测流程：IL-2Rα5、TNFR16、HGF7、IL-88、elafin2 和 REG3α3（也称为PAP1），以最大限度减少冻融循环次数、血浆解冻后的存放时间以及血浆用量。在本操作中，我们根据实验室先前使用厂家提供的ELISA试剂盒和方案（经少量优化调整）所确定的样本稀释倍数，按顺序依次进行ELISA检测。所得的血浆生物标志物浓度数据可进一步汇总并用于患者队列中的显著性分析。尽管这些生物标志物目前仅限于科研用途，但其在临床诊疗中的应用价值正在多项临床试验中进行评估。
该技术可用于在同一样本上同时检测多种目标蛋白或细胞因子的ELISA，前提是样本无需与其他试剂混合。如果ELISA试剂盒未提供预包被的微孔板，则可使用96孔半体积板或384孔板，以进一步减少样本和试剂的用量。
引言
急性移植物抗宿主病（GVHD）是异基因造血干细胞移植（HSCT）后非复发相关死亡（NRM）的主要原因，其严重程度通过皮肤、肝脏和胃肠道（GI）三个器官系统的功能障碍进行评估4。急性GVHD通常发生在移植后2至8周之间，但也可能更晚出现，在临床上常难以与其他HSCT后并发症（如预处理方案毒性、感染或药物副作用）相区分。通过采用蛋白质组学策略并结合连续ELISA进行高通量验证，我们已鉴定出6种在GVHD临床症状出现时浓度升高的蛋白质。其中，IL-2Rα、TNFR1、HGF和IL-8组成的四标志物组合，可在临床症状初现时诊断GVHD，并能独立于GVHD严重程度预测HSCT后的生存率1。Elafin作为皮肤GVHD的生物标志物，可有效区分GVHD皮疹与其他原因（如药物疹）引起的皮疹，并可预测移植后的生存情况2。我们近期鉴定出REG3α是下胃肠道GVHD的生物标志物，而下胃肠道正是与NRM关联最密切的靶器官。血浆中REG3α浓度可可靠地识别HSCT后腹泻是否由GVHD引起，并与诊断性肠道活检中的组织学严重程度相关。在胃肠道GVHD发病时的REG3α浓度还可预测对GVHD治疗的反应性及非复发相关死亡率3。目前，多项临床试验正在评估将这些经过验证的GVHD生物标志物整合入临床诊疗的可行性。
这些实验使用了2000年至2010年间接受造血干细胞移植（HSCT）的患者在移植物抗宿主病（GVHD）发作时采集的小份血浆样本，这些样本数量有限且不可替代。由于这些样本极为珍贵，我们开发了一种高效、可重复地同时测定多种血浆蛋白浓度的方法，以减少反复冻融、解冻时间和血浆消耗。该技术可用于同一样本（或样本集）中多个目标蛋白/细胞因子的ELISA检测，前提是样本无需与其他试剂混合。若ELISA试剂盒未提供预包被的微孔板，可使用96孔半体积板或384孔板，以进一步减少样本和试剂的使用量。本文重点介绍检测GVHD生物标志物的技术细节。
方案
1. 实验第0天：样本制备及使用IL-2Rα、REG3α和HGF捕获抗体包被ELISA检测板
- 用于分析的血浆分装样品将被取出，解冻后在12,000 rpm下离心10分钟，以分离底部的凝块和顶部的脂质。根据预定义的分布图，通过手动移液将每份样品150 μl未稀释的血浆加入96孔V型底板（源板）中。分装后的样品将用封口膜包裹，并在整个操作过程中置于4 °C的湿盒中保存，保存时间不超过72小时。
- IL-2Rα和HGF捕获抗体将按照生产商说明书进行重悬和稀释，并将50 μl加入各自对应的96孔高结合力半区板的每个孔中，随后密封并在4 °C下孵育过夜。或者，可根据蛋白的稳定性，将多块板在37 °C干燥后于4 °C保存，以备后续使用。
- REG3α捕获抗体将使用生产商提供的包被缓冲液，按照其操作规程进行稀释，并将25 μl加入Nunc Maxi-Sorp 384孔板的每个孔中，随后密封并在4 °C下孵育过夜。
2. 实验第1天：IL-2Rα ELISA（图1）
- 按照制造商说明书，IL-2Rα 检测板经洗涤后，用 TBS 中的 BLOTTO 进行封闭，并将标准品复溶，制备 8 个浓度点的标准曲线。
- 封闭步骤后，将源板中的未稀释血浆以每孔 50 μl 量重复加样至 ELISA 检测板中，同时将各标准品也以每孔 50 μl 量重复加样。板密封后置于设定为 300 rpm 的板式摇床上，室温孵育 2 小时。
- 将血浆从 IL-2Rα ELISA 检测板中回收，并重新放回未稀释血浆源板中。按照制造商说明书完成 ELISA 操作（体积按半孔板比例调整），使用酶标仪在 450–570 nm 波长下读取每孔的光密度值，并保存和分析数据。
3. 实验第1天：REG3α ELISA（图1）
- 将10 μl未稀释的血浆转移至一个独立的V型底源板中。每孔加入90 μl厂家提供的稀释缓冲液，以制备1:10稀释的源板。
- 按照厂家说明书进行REG3α ELISA实验（体积已调整为适用于384孔板），使用酶标仪在450-620 nm波长下读取每孔的光密度值，并保存和分析数据。
4. 实验第1天：Elafin和TNFR1检测板的捕获抗体包被
- 根据制造商说明，将重组并稀释Elafin和TNFR1捕获抗体，每孔加入50 μl至相应的96孔高结合力半面积板中，密封后，Elafin于室温孵育过夜，TNFR1于4 °C孵育过夜。
第5步 实验第1-2天：HGF ELISA（图1）
- 完成IL-2Rα ELISA检测并确认无需重复实验后，将60 μl未稀释的血浆转移至新的源板中，然后向每孔加入60 μl含1% BSA的1×PBS，制备成1:2稀释的血浆源板。
- 对HGF检测板进行洗涤，使用TBS中的BLOTTO封闭，并按照生产商说明书重悬标准品，制备8点标准曲线。
- 封闭步骤完成后，对板进行洗涤，将50 μl 1:2稀释的血浆以复孔形式加入ELISA检测板中，同时将每种标准品各50 μl以复孔形式加入。密封反应板后，在300 RPM的板式摇床上室温孵育过夜。
- 从HGF ELISA检测板中回收1:2稀释的血浆，重新放回1:2稀释的血浆源板中。按照生产商说明书完成ELISA操作（体积按半孔板进行调整），使用酶标仪在450–570 nm波长下读取各孔的光密度值，并保存数据进行分析。
6. 实验第2天：Elafin ELISA
- 将10 μl未稀释的血浆转移至新的源板中，然后向每孔加入190 μl含1% BSA的1×PBS，使每孔总体积为200 μl，血浆稀释倍数为1:20。
- 按照试剂盒制造商的说明书进行Elafin ELISA实验（体积已根据半孔板进行调整），使用酶标仪在450–570 nm波长下读取各孔的光密度值，并保存和分析数据。
7. 实验第2天：TNFR1 ELISA
- 向1:20稀释的血浆原液板（现含有100 μl 1:20稀释血浆）中加入25 μl含1% BSA的PBS，以获得125 μl 1:25稀释的血浆。
- 按照试剂盒制造商的说明书完成TNFR1 ELISA检测（体积按半孔板进行调整），使用酶标仪在450-570 nm波长下读取每孔的光密度值，并保存和分析数据。
8. 实验第2天：IL-8 ELISA
- 将60 μl 1:2稀释的血浆转移至新的源板中，然后向每孔加入180 μl IL-8稀释液，制成1:6稀释的血浆源板。
- 按照试剂盒制造商的说明书完成IL-8 ELISA实验（体积已根据半孔板进行调整），使用酶标仪在450-570 nm波长下读取每孔的光密度值，并保存和分析数据。
所有ELISA实验完成后，未使用的储备血浆将被重新放回已解冻的等分试样中，并冷冻以备将来使用。
结果
生物标志物检测流程和时间线分别在表1和表2中详细说明。完成检测后，现已使用总共150 μL血浆，在同一样本上定量了6种不同蛋白质的浓度。每项检测将样本以复孔形式加样，可用于内部质量控制，且以变异系数（CV）低于10%为最佳。若在多个酶标板上连续进行ELISA检测，应尽量保持高浓度标准品吸光度的一致性，以提高板间测量结果的可靠性；可通过比较不同酶标板之间的标准曲线吸光度（OD）来评估ELISA检测性能是否存在不一致（图2）。实验室中使用四甲基联苯胺比色底物的显色时间以及各生物标志物所观察到的高浓度吸光度值列于表3中。
图1. IL-2Rα、REG3α 和 HGF ELISA 检测的工作流程。在将血浆样本加入 IL-2Rα ELISA 检测板后，回收样本用于制备其他 ELISA 检测的稀释源板。对于 HGF ELISA 检测，回收的血浆用于制备 IL-8 的 1:6 稀释板。 点击此处查看大图。
图 2. 用于检测1084名患者初始REG3α胃肠道移植物抗宿主病生物标志物报告的7块不同ELISA板的标准曲线的光密度值3。各ELISA板之间一致的光密度（OD）确保了蛋白浓度测量结果在不同板之间的可重复性。血浆样本中蛋白浓度通过将样本的光密度值与标准曲线的光密度值进行比较计算得出。
| 实验第0天 | 1. 准备样品 |
| 2. IL-2Rα、HGF 和 REG3α 捕获抗体 | |
| 实验第1天 | 1. IL-2Rα ELISA |
| 2. REG3α ELISA | |
| 3. HGF ELISA（进行样品包被） | |
| 4. Elafin 和 TNFR 捕获抗体 | |
| 实验第2天 | 1. 完成 HGF ELISA |
| 2. Elafin ELISA | |
| 3. TNFR1 ELISA | |
| 4. IL-8 ELISA | |
| 5. 将未使用的血浆重新冻存 |
表1. 移植物抗宿主病生物标志物工作流程概述
| 第0天 | 样本制备及捕获抗体过夜孵育 | ||||||
| ELISA | IL-2Rα | REG3α | HGF | Elafin | TNFR1 | IL-8 | |
| 时间（小时） | 0.0 | 封闭 | |||||
| 1.0 | 加样 | ||||||
| 3.0 | 回收血浆样本；加入检测抗体 | 封闭；样本准备（1:10稀释） | |||||
| 4.0 | 加样（1:10） | ||||||
| 5.0 | 链霉亲和素-HRP | 检测抗体 | |||||
| 5.5 | TMB | 链霉亲和素-HRP | |||||
| 6.0 | 读板 | TMB | 封闭；样本准备（1:2稀释） | ||||
| 6.5 | 读板 | ||||||
| 7.0 | 加样（1:2） | 捕获抗体（过夜孵育） | 捕获抗体（过夜孵育） | ||||
| 第2天 | |||||||
| 时间（小时） | 0.0 | 回收血浆，加入检测抗体 | 封闭；样本准备（1:20） | ||||
| 1.0 | 加样（1:2） | 将1:20样本进一步稀释至1:25 | |||||
| 2.0 | HRP | 加样（1:25） | |||||
| 2.5 | TMB | ||||||
| 3.0 | 读板 | 检测抗体 | |||||
| 3.5 | 样本准备（1:6稀释） | ||||||
| 4.0 | 检测抗体 | 加样（1:6） | |||||
| 5.0 | HRP | ||||||
| 5.5 | TMB | ||||||
| 6.0 | 读板 | HRP | 检测抗体 | ||||
| TMB | |||||||
| 7.0 | 读板 | TMB | |||||
| 7.5 | 读板 | ||||||
| 完成之后 | 将原始血浆分装并冷冻保存以备后续使用 | ||||||
表2. 执行ELISA的时间线。
| 血浆稀释倍数 | 高浓度标准品浓度 | 底物显色时间（分钟） | 高吸光度值 | 标准曲线类型 | |
| IL-2Rα | 1:1 | 2,000 pg/ml | 5 | 1 | Linear |
| HGF | 1:2 | 4,000 pg/ml | 22 | 2.1 | 4-parameter |
| IL-8 | 1:6 | 200 pg/ml | 12 | 2.7 | 4-parameter |
| REG3α | 1:10 | 100 ng/ml | 12 | 1.7 | 4-parameter |
| Elafin | 1:20 | 2,000 pg/ml | 20 | 1.9 | 4-parameter |
| TNFR1 | 1:25 | 800 pg/ml | 8 | 2.7 | Linear |
表3. 6种移植物抗宿主病生物标志物的ELISA检测详情。
讨论
本文介绍的连续ELISA方法可在少量血浆样本上检测多种血浆蛋白，这类样本可能难以获得和/或不可替代，例如来自罕见病患者的血浆或从小鼠获取的血浆样本9,10。连续ELISA通常按照血浆稀释倍数递增的顺序进行，一般而言，需要将血浆稀释≥1:10的ELISA步骤无需回收样本，但若需要也可进行回收。连续ELISA的应用受限于某些ELISA试剂盒或实验方案，例如当血浆需与其他试剂混合，或不同检测需要使用不同稀释缓冲液时；由于不相容的缓冲液或试剂可能干扰后续特定检测的性能，因此无法重复使用样本。通过周密规划，可在同一样本上完成10次甚至更多的ELISA检测。
各实验室可能需要调整血浆稀释度，以便根据受试者样本中目标蛋白的预期血浆浓度获得可解读的结果。由于实验室设备的差异，可能需要优化孵育时间及显色反应时间、洗涤次数和/或浸泡洗涤时间，以使特定ELISA实验达到最佳效果。
为了提高高通量检测能力与准确性，并以经济高效的方式进行分析，建议使用能够对384孔板进行操作的自动化液体处理平台，以及配备堆叠装置的自动洗板机。该设备可提高多位操作人员进行分析时的准确性和精密度，并有助于实现分析过程的一致性，从而降低不同检测间和同次检测内的变异。
我们选择连续进行ELISA而非现有的多重检测平台，原因有两点：1）针对新蛋白的大多数抗体对难以直接偶联到微球或其他材料上，且该过程耗时且昂贵；2）单个ELISA检测的精确度高于多重微阵列或微球检测，这主要得益于不存在交叉反应性11。如果能够建立一种可靠的多重微球微阵列检测方法，则有可能替代连续ELISA流程，但其应用可能受限于抗体与微球的偶联能力，以及所需同时分析的蛋白数量。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 RC1-HL-101102、P01-CA039542、T32-HL007622、Hartwell 基金会及多丽丝·杜克慈善基金会资助。Paczesny 博士是 Eric Hartwell 基金和 Amy Strelzer Manasevit 研究项目的研究员。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人IL-2Rα Duoset | R&D Systems | DY223 | |
| 人源HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
| 人IL-8 OptEIA试剂盒II | Becton Dickinson | 550999 | |
| Ab-Match ASSEMBLY 人 PAP1（REG3）α) 试剂盒 | MBL国际 | 5323 | |
| Ab-Match UNIVERSAL 试剂盒 | MBL International | 5310 | |
| 人可溶性TNFRI/TNFRSF1A DuoSet | R&D Systems | DY225 | |
| 人源Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
| 96孔聚苯乙烯锥底板 | 赛默飞世尔科技 | 249570 | 用于等离子体源板 |
| Costar 半区高结合力 96 孔板 | 康宁 | 3690 | 对于IL-2Rα，HGF、TNFR1 和 elastase 特异性抑制剂 ELISA |
| Nunc 384孔MaxiSorp板 | Nunc | 464718 | 对于 REG3α ELISA |
| HyClone 磷酸盐缓冲液，1x | 赛默飞世尔科技 | SH30256.02 | |
| 牛血清白蛋白，第五组分，热激处理 | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| TBS 中的 BLOTTO 封闭液 | 赛默飞世尔科技 | 37530 | IL-2R阻断剂α HGF 和 TNFR1 ELISA |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Gibco | 21600-069 | IL-2R 洗涤缓冲液α，HGF、Elafin 和 TNFR1 ELISA |
| TMB 过氧化物底物 | 柯尔克和佩里实验室 | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | IL-2R 洗涤缓冲液α，HGF、Elafin 和 TNFR1 ELISA |
| 硫酸 | Sigma-Aldrich | 84720 | （稀释至2N）作为终止液 |
参考文献
- Paczesny, S. A biomarker panel for acute graft-versus-host disease. Blood. 113, 273-278 (2009).
- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12(2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. Graft-versus-host disease. Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Miyamoto, T. Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).
- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
- Okamoto, T. Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease. Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).
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- Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes. J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).
- Osuchowski, M. F., Remick, D. G. The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA. Methods. 38, 304-311 (2006).
- Schweitzer, B. Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification. Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).
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