我们介绍一种简单的方法，利用一种高溶解性的染料LysoTracker，对小鼠胚胎以及分化中的胚胎干细胞（ES细胞）培养物中程序性细胞死亡（PCD）的区域进行可视化观察。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
程序性细胞死亡（PCD）在成体中发生以维持正常的组织稳态，在胚胎发育过程中则参与组织和器官的形态构建1,2,6,7在发育过程中，有毒化学物质或基因改变可导致程序性细胞死亡（PCD）增加或改变PCD模式，从而引起发育异常和出生缺陷。3-5为了理解这些缺陷的病因，可结合胚胎研究进行补充 体外 使用分化中的胚胎干细胞（ES细胞）的检测方法。
细胞凋亡是一种被广泛研究的程序性细胞死亡（PCD）形式，其通过内在和外在信号通路激活半胱天冬酶（caspase）酶级联反应。典型的细胞变化包括细胞膜起泡、细胞核收缩以及DNA片段化。其他形式的程序性细胞死亡不涉及caspase的激活，可能是长期自噬的最终结果。无论通过何种PCD通路，死亡细胞都需要被清除。在成体中，这一功能由免疫细胞执行；而在胚胎中，由于免疫系统尚未发育成熟，清除过程通过另一种机制完成。该机制涉及邻近细胞（称为“非专业性吞噬细胞”）发挥吞噬作用——它们识别死亡细胞表面的“吃我”信号，并将其吞噬8-10。吞噬后，细胞碎片被运送至溶酶体进行降解。因此，无论PCD的具体机制如何，溶酶体活性的增加均可与细胞死亡的增加相关联。
为了研究程序性细胞死亡（PCD），一种能够在厚组织和多层分化培养物中可视化溶酶体的简单检测方法可能非常有用。LysoTracker 染料是一种高度可溶的小分子，可保留在溶酶体等酸性亚细胞区室中11-13。该染料通过扩散和循环系统被细胞摄取。由于其穿透能力不受限制，因此可以在厚组织和多层培养物中实现对 PCD 的可视化12,13。相比之下，TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记）分析14则仅限于小样本、组织学切片和单层培养物，因为该实验步骤需要末端转移酶进入细胞或穿透细胞膜。
与会扩散且被溶剂溶解的苯胺蓝不同，LysoTracker Red DND-99 可固定、荧光强且稳定。使用水性或有机溶剂封片介质时，均可通过标准荧光显微镜或共聚焦显微镜在整体封片或切片样本中观察染色结果12,13。本文描述了利用该染料检测正常及sonic hedgehog基因敲除小鼠胚胎中程序性细胞死亡（PCD）的实验方案。此外，我们还展示了在分化中的胚胎干细胞（ES）培养体系中分析PCD的方法，并介绍了一种简单的定量分析技术。总之，LysoTracker染色可作为检测程序性细胞死亡的其他方法的有力补充。
方案
1. 小鼠胚胎的LysoTracker染色
- 通过将年轻的（5-6周龄）雌性小鼠放入雄性种鼠笼中来获得小鼠胚胎。在接下来的早晨观察阴道栓的出现，以确认交配已发生。如果雌鼠已受孕，则当天中午记为0.5 dpc（交配后天数）。本方案适用于7-13 dpc的小鼠胚胎。
- 在目标胚胎发育阶段，按照批准的实验方案对雌鼠实施安乐死，并取出子宫。在直径10 cm的培养皿中使用Hanks BSS（不含酚红）将胚胎从蜕膜中分离。去除胚外膜组织，并用Hanks BSS至少清洗一次，以去除多余组织和血液。
- 配制LysoTracker胚胎染色液（含5 μM LysoTracker的Hanks BSS）。对于1-2窝小鼠胚胎，建议使用5 ml作为方便的体积。轻轻混匀，使染料均匀分散。
- 将胚胎加入含有LysoTracker胚胎染色液的微量离心管或小瓶中，在37 °C孵育45分钟。
- 用Hanks BSS轻柔清洗四次，每次5分钟。
- 在4%多聚甲醛中固定过夜。
- 用Hanks BSS清洗一次，持续10分钟，以去除固定液。
- 通过甲醇梯度（50%、75%、80%、100%，每步5分钟）进行脱水，以消除背景染色。这对于成像时获得良好的信噪比至关重要。
- 此时，可将胚胎样本长期保存于-20 °C的甲醇中，避光存放。
注意：可在任意步骤取组织样本进行DNA基因分型，但在储存前取样通常最为方便，因为在此步骤之前的所有样本均可进行批量处理。从每个胚胎的尾部、肢体或头部采集组织样本，并分别放入不同的离心管中。将组织样本重新水化，并准备进行基因分型。
2. 不同分化 ES 培养物的 LysoTracker 染色
- 采用悬滴法15制备拟胚体，起始密度为每20 μl滴液中500个细胞。
- 3天后，将拟胚体转移至10 cm非黏附性培养皿（i.e. 用于细菌学实验的培养皿）中进行悬浮培养。培养5天，每2天更换一次培养基。
- 第7天，将拟胚体转移至明胶包被的8孔腔室载玻片中（向孔腔中加入0.1%明胶，静置5分钟，吸出明胶后加入培养基）。每孔转移1–2个拟胚体。
- 继续培养10天，每隔一天更换一次培养基。操作时需小心，将移液器置于腔室载玻片的角落，以免干扰拟胚体在玻璃表面的贴附。添加新鲜培养基时，也应将移液器置于孔腔角落，并缓慢释放培养基。
- 培养10天后，为诱导细胞凋亡作为阳性对照，用0.1 mM和1.0 mM H2O2处理部分孔（将H2O2加入新鲜培养基中，混匀后加入细胞），处理60分钟。用D-PBS洗涤两次，随后在常规培养基中过夜培养。
- 轻柔吸除原有培养基，加入LysoTracker细胞染色液（培养基中含500 nM LysoTracker（终浓度），每孔300 μl）。
- 在37 °C孵育15分钟。
- 用D-PBS洗涤两次，每次5分钟。
- 在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。
- 用D-PBS洗涤两次，每次5分钟。
3. 观察经LysoTracker染色的胚胎或胚胎干细胞培养物
- 通过吸除 D-PBS 将细胞样品制备用于显微镜观察；从载玻片上取下腔室；空气干燥约 5 分钟；然后加入水性封片介质（含 DAPI 的 Vectashield 或类似物）。干燥过程中放置铝箔屏障以减少荧光染料的光漂白。将胚胎封片于深凹玻璃培养皿或小型培养皿中的 Vectashield 或类似介质中。
- 使用配备罗丹明或 Texas Red 滤光片的解剖显微镜或复式显微镜进行观察（LysoTracker RED DND-99，激发/发射波长：577/590 nm）。染色通常非常明亮，因此通常无需长时间曝光。
4. 使用成像技术对结果进行定量分析
- 在手动模式下，以相同的曝光条件对您的样品进行数码拍照。
- 在 Adobe Photoshop 或类似的图像处理程序中打开图像。为确定 LysoTracker 染色量，选择红色通道并对图像进行阈值处理（将图像转换为黑白图像），使红色染色区域以白色像素表示。选中白色像素，并使用直方图功能获取总像素数。
- 使用蓝色通道对视野中的细胞核数量进行计数。可通过在图像上添加注释来记录计数值，以便后续参考。
- 记录所得数值，然后计算每个细胞的平均染色水平。对所有需要分析的图像，均使用相同的阈值设置重复此分析过程。
5. 代表性结果
在胚胎发育过程中，程序性细胞死亡（PCD）存在正常的模式，而当去除生长因子基因（如Sonic hedgehog (Shh)）时，该模式可能发生改变16,17。由于LysoTracker是一种小分子染料，具有高度扩散性，因此可对整个胚胎进行可视化观察，以评估即使位于间充质深层的PCD区域12,13。图1展示了在10.5天胚胎期（10.5 dpc）正常小鼠胚胎与Shh-/-突变型小鼠胚胎的LysoTracker染色模式。在此阶段，Shh-/-突变型胚胎中的PCD显著增加，尤其在肢芽和体节区域。可通过整体标本在更高倍镜下成像（1B）来评估PCD的整体分布模式。胚胎的分离组织也可使用振动切片机（1C）或恒冷切片机（D-F）进行切片，以更详细地揭示PCD区域。
TUNEL 分析最好在薄切片上进行，因为此时末端转移酶的渗透问题较小。在同一组织中可同时进行 LysoTracker 染色和 TUNEL 检测（图 1D-G）。这些结果表明，尽管 LysoTracker 与 TUNEL 染色之间并不存在严格的 1:1 对应关系，但程序性细胞死亡（PCD）的整体区域有很大程度的重叠。在更高倍镜下观察，可以发现一些仅 TUNEL 检测呈阳性的点状信号，一些仅被 LysoTracker 染料染色的点状信号，以及一些染色信号重叠的点状结构。
当将拟胚体（EB）接种于明胶包被的表面时，分化中的细胞会向外迁移。经过10天的培养后，细胞将分化为多种细胞类型，包括神经元、肌细胞和心肌细胞。如图2所示的培养物包含上述多种细胞类型的混合群体，但研究者可调整本方案以研究特定目标细胞类型的程序性细胞死亡（PCD）。例如，可用维甲酸处理拟胚体以促进神经元的分化19，随后利用LysoTracker检测在不同条件下神经元的细胞死亡情况。在正常分化的胚胎干细胞（ES细胞）培养中，有少量细胞会发生程序性细胞死亡，这些细胞可通过LysoTracker和/或TUNEL检测法检出（图2A）。程序性细胞死亡可由多种不同的细胞毒性试剂诱导，例如过氧化氢（H2O2），其可引起氧化损伤并启动凋亡通路20,21。与未处理组相比，低剂量H2O2可增加LysoTracker和TUNEL染色信号，而高剂量则导致细胞皱缩以及广泛的LysoTracker和TUNEL阳性反应。与胚胎中的结果类似，可观察到仅TUNEL染色阳性而LysoTracker染料不染色的点状结构、仅被LysoTracker染色的点状结构，以及染色信号重叠的点状结构。诱导凋亡的细胞毒性试剂处理结果可与诱导自噬的无血清饥饿条件进行比较（图2D）。经历一段时间（1小时）无血清饥饿的细胞表现出不同的染色模式，其中LysoTracker与TUNEL染色信号的相关性较低。与未处理的培养物相比，LysoTracker染色显著增强，但TUNEL阳性水平仍处于正常范围。
利用 Adobe Photoshop 中的标准工具，可通过简单的阈值法对 LysoTracker 染色进行定量，从而计算出细胞群体的平均染色水平。图3A-B展示了样本图像在定量过程中的显示方式。从一张基础图像开始，其中 LysoTracker 染色显示在红色通道，DAPI 染色的细胞核显示在蓝色通道（图3A），对该图像的红色通道进行阈值处理，将图像转换为黑白图像，然后选择并计数白色像素（图3A'）。所选择的阈值水平应能代表 LysoTracker 的染色模式。与任何基于图像的定量方法一样，应避免图像过度曝光，因为这可能会夸大差异。随后可通过仅观察蓝色通道（图3B），使用画笔等绘图工具标记细胞核并进行计数，从而统计视野中的细胞核数量（图3B'）。然后可通过计算每个细胞的平均染色水平（像素数/细胞核计数）来表示染色强度。如果希望将此算法用于高通量筛选，大多数筛选软件包均可测量特定通道的亮度，并具备可识别并计数视野中细胞核的对象识别功能；但对于大多数常规应用，手动方法快速且简便。举例而言，对图2A-C中的一个样本区域进行了定量分析，结果证实 H2O2 浓度的增加会导致 LysoTracker 染色水平升高（图3C）。
图 1. 正常胚胎与 Shh-/- 胚胎中的 LysoTracker 染色。A,A'. 在妊娠 10.5 天（dpc）的正常和 Shh-/- 小鼠胚胎，经 LysoTracker Red 染色后，封片于 Vectashield 中，并在落射荧光解剖显微镜下拍摄。括号标示前肢的位置。B,B'. 正常胚胎与 Shh-/- 胚胎前肢的高倍放大图像。注意细胞死亡的正常区域，包括“后部坏死区”（星号标记）以及肢芽近端间充质中的一个区域（箭头标记）。Shh 缺失肢芽在内侧和远端区域表现出更强的染色信号。C,C'. 正常与缺失型肢芽前肢芽的内侧切面。注意正常肢芽中近端间充质（箭头）和外胚层顶脊（AER，箭头所示）存在染色信号，而在缺失型肢芽中，背侧、腹侧及远端间充质均呈现强染色信号。D-F. 同一组织切片（12 微米，冷冻切片）同时进行 LysoTracker 与 TUNEL 染色（Roche 1684795）成像。该切面穿过 Shh 缺失间充质的远端区域。箭头所示为 AER。可见两种方法的整体染色模式非常相似，但染色信号并不完全重叠。G,G'. 在 AER 与间充质的更高倍放大图像中，可观察到仅呈 LysoTracker 阳性或仅 TUNEL 阳性的点状信号，以及染色信号重叠的点状结构。
图 2. 分化 ES 细胞中的 LysoTracker 染色。将正在分化的细胞接种于不含 LIF 的 8 孔载玻片上。为比较 LysoTracker 与 TUNEL 染色的结果，通过两种不同浓度的 H2O2 诱导凋亡通路，同时通过 1 小时无血清培养诱导自噬通路。这些图像使用 Zeiss LSM5 共聚焦显微镜拍摄。A-A''：未经处理的细胞培养物显示出一定程度的正常凋亡，表现为 LysoTracker 和 TUNEL 染色阳性。两种技术的染色模式大部分重叠（白色箭头），但也可观察到少数仅 LysoTracker 阳性的点状结构（红色箭头）。B-B''、C-C''：随着 H2O2 浓度增加，凋亡被激活。较低剂量组相较于未处理组显示出更多的 LysoTracker 和 TUNEL 阳性点状结构；较高剂量组则进一步增加了 LysoTracker 和 TUNEL 阳性点状结构的数量。白色箭头指示染色重叠区域，红色箭头指示仅 LysoTracker 阳性的点状结构。此外，还可观察到仅 TUNEL 染色阳性的点状结构（绿色箭头）。D-D''：无血清培养可诱导自噬，导致溶酶体和自噬溶酶体中物质的积累。与未处理组相比，可见明显更多的 LysoTracker 阳性点状结构。TUNEL 阳性点状结构也存在（其中大部分与 LysoTracker 染色重叠，白色箭头），但其数量相较于未处理组并未显著增加。此外，在无血清培养条件下，仅 LysoTracker 阳性的点状结构非常普遍（红色箭头）。
图 3. 使用 Adobe Photoshop 对细胞群体染色水平进行定量分析的方法。A：选取图 2A的一部分，本图展示了 LysoTracker（红色通道）和 DAPI 染色（细胞核，蓝色通道）。A'：对图 3A的红色通道进行阈值处理，将其转换为黑白图像。随后可使用直方图功能选择并统计白色像素的数量。B-B'：蓝色通道显示细胞核，在计数过程中可使用画笔等绘图工具对图像进行标注。C：此为来自图 2A-C 各图的一个样本的定量分析示例，数据以每细胞核的像素数表示。点击此处查看大图。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
细胞凋亡的重要特征包括通过TUNEL法检测DNA损伤，以及检测caspase活性（可通过单克隆抗体或ZVAD-fmk等结合分子检测）、观察细胞形态变化，以及细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露（可通过Annexin V结合检测）。这些检测方法各自存在一些局限性。例如，TUNEL法中所使用的末端脱氧核苷酸转移酶无法穿透数层以上的细胞。此外，Annexin V也可能标记非凋亡细胞，例如细胞膜受损的细胞（Annexin V进入细胞内部，与内层小叶上的PS结合）。同时，caspase活性检测可能检测到与细胞凋亡无关的caspase活性。LysoTracker并不能替代上述检测方法，但在特定实验背景下可作为有用的补充检测手段。
与其它方法相比，LysoTracker 染色具有多项优势。由于它是一种小分子染料，而非如末端转移酶（TUNEL 法所用）或 Annexin V 等蛋白质，因此能够轻易穿透较厚的组织。这意味着 LysoTracker 染色特别适用于观察细胞凋亡整体模式的变化。因此，LysoTracker 染色的一项重要应用是作为初筛实验，用于确定不同基因型的胚胎或细胞中程序性细胞...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Mariani实验室成员在编辑本方案过程中提供的帮助。本研究由加州再生医学研究所（CIRM）博士后培训基金（JLF）、CIRM BRIDGES实习项目（TZTT）、Robert E.和May R. Wright基金会（FVM）以及南加州大学（FVM）资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |
| Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |
| 多聚甲醛 | EMD | EM-PX0055-3 | |
| Vectashield | 载体 | H-1200 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| 非必需氨基酸 | Cellgro | 25-025-CI | |
| 丙酮酸钠 | Cellgro | 25-000-CI | |
| FBS | Hyclone | SH30071.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-巯基乙醇–乙醇，50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |
| LabTek-II 培养皿腔室载玻片 （8孔） | Nalge Nunc International | 154534 | |
| 0.1% 明胶 | 默克密理博 | ES-006-B | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Cellgro | 21-031-CV | |
溶液配制方法 4% 多聚甲醛 100 ml：
警告：以“颗粒”形式（压缩的小颗粒）存在的多聚甲醛粉尘较少，因此可在通风橱外称量。但在操作时仍应佩戴防护性防尘口罩（至少N95级别）。 EB培养基 500 ml EB 培养基： <表格 边框="1"> | |||
| DMEM： | 404.5 ml | ||
| FBS： | 75.0 ml | ||
| L-谷氨酰胺： | 5.0 ml | ||
| 青霉素/链霉素 | 5.0 ml | ||
| 非必需氨基酸： | 5.0 ml | ||
| 丙酮酸钠： | 5.0 ml | ||
| β-巯基–乙醇 | 500 μl |
参考文献
- Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
- Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
- Ikonomidou, C. Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome. Science. 287, 1056-1060 (2000).
- Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder. Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).
- Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker. Cytometry A. 53, 9-21 (2003).
- Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. Programmed cell death in animal development. Cell. 88, 347-354 (1997).
- Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147, 742-758 (2011).
- Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development. Cell. 128, 931-946 (2007).
- Grimsley, C., Ravichandran, K. S. Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals. Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release. Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).
- Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos. Cytometry. 33, 348-354 (1998).
- Zucker, R. M., Hunter, E. S. 3rd, Rogers, J. M. Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy. Methods. 18, 473-480 (1999).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).
- Chiang, C. Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function. Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).
- Ishibashi, M., McMahon, A. P. A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo. Development. 129, 4807-4819 (2002).
- Schuldiner, M. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913, 201-205 (2001).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Dumont, A. Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB. Oncogene. 18, 747-757 (1999).
- Hampton, M. B., Orrenius, S. Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis. FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).
- Wood, W. Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos. Development. 127, 5245-5252 (2000).
- Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death. Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).
- Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes. Autophagy. 2, 39-46 (2006).
- Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes. Autophagy. 1, 23-36 (2005).
- Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system. Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Klionsky, D. J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes. Autophagy. 4, 151-175 (2008).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
