我们介绍一种简单的方法，利用一种高溶解性的染料LysoTracker，对小鼠胚胎以及分化中的胚胎干细胞（ES细胞）培养物中程序性细胞死亡（PCD）的区域进行可视化观察。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
程序性细胞死亡（PCD）在成体中发生以维持正常的组织稳态，在胚胎发育过程中则参与组织和器官的形态构建1,2,6,7在发育过程中，有毒化学物质或基因改变可导致程序性细胞死亡（PCD）增加或改变PCD模式，从而引起发育异常和出生缺陷。3-5为了理解这些缺陷的病因，可结合胚胎研究进行补充 体外 使用分化中的胚胎干细胞（ES细胞）的检测方法。
细胞凋亡是一种被广泛研究的程序性细胞死亡（PCD）形式，其通过内在和外在信号通路激活半胱天冬酶（caspase）酶级联反应。典型的细胞变化包括细胞膜起泡、细胞核收缩以及DNA片段化。其他形式的程序性细胞死亡不涉及caspase的激活，可能是长期自噬的最终结果。无论通过何种PCD通路，死亡细胞都需要被清除。在成体中，这一功能由免疫细胞执行；而在胚胎中，由于免疫系统尚未发育成熟，清除过程通过另一种机制完成。该机制涉及邻近细胞（称为“非专业性吞噬细胞”）发挥吞噬作用——它们识别死亡细胞表面的“吃我”信号，并将其吞噬8-10。吞噬后，细胞碎片被运送至溶酶体进行降解。因此，无论PCD的具体机制如何，溶酶体活性的增加均可与细胞死亡的增加相关联。
为了研究程序性细胞死亡（PCD），一种能够在厚组织和多层分化培养物中可视化溶酶体的简单检测方法可能非常有用。LysoTracker 染料是一种高度可溶的小分子，可保留在溶酶体等酸性亚细胞区室中11-13。该染料通过扩散和循环系统被细胞摄取。由于其穿透能力不受限制，因此可以在厚组织和多层培养物中实现对 PCD 的可视化12,13。相比之下，TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记）分析14则仅限于小样本、组织学切片和单层培养物，因为该实验步骤需要末端转移酶进入细胞或穿透细胞膜。
与会扩散且被溶剂溶解的苯胺蓝不同，LysoTracker Red DND-99 可固定、荧光强且稳定。使用水性或有机溶剂封片介质时，均可通过标准荧光显微镜或共聚焦显微镜在整体封片或切片样本中观察染色结果12,13。本文描述了利用该染料检测正常及sonic hedgehog基因敲除小鼠胚胎中程序性细胞死亡（PCD）的实验方案。此外，我们还展示了在分化中的胚胎干细胞（ES）培养体系中分析PCD的方法，并介绍了一种简单的定量分析技术。总之，LysoTracker染色可作为检测程序性细胞死亡的其他方法的有力补充。
方案
1. 小鼠胚胎的LysoTracker染色
- 通过将年轻的（5-6周龄）雌性小鼠放入雄性种鼠笼中来获得小鼠胚胎。在接下来的早晨观察阴道栓的出现，以确认交配已发生。如果雌鼠已受孕，则当天中午记为0.5 dpc（交配后天数）。本方案适用于7-13 dpc的小鼠胚胎。
- 在目标胚胎发育阶段，按照批准的实验方案对雌鼠实施安乐死，并取出子宫。在直径10 cm的培养皿中使用Hanks BSS（不含酚红）将胚胎从蜕膜中分离。去除胚外膜组织，并用Hanks BSS至少清洗一次，以去除多余组织和血液。
- 配制LysoTracker胚胎染色液（含5 μM LysoTracker的Hanks BSS）。对于1-2窝小鼠胚胎，建议使用5 ml作为方便的体积。轻轻混匀，使染料均匀分散。
- 将胚胎加入含有LysoTracker胚胎染色液的微量离心管或小瓶中，在37 °C孵育45分钟。
- 用Hanks BSS轻柔清洗四次，每次5分钟。
- 在4%多聚甲醛中固定过夜。
- 用Hanks BSS清洗一次，持续10分钟，以去除固定液。
- 通过甲醇梯度（50%、75%、80%、100%，每步5分钟）进行脱水，以消除背景染色。这对于成像时获得良好的信噪比至关重要。
- 此时，可将胚胎样本长期保存于-20 °C的甲醇中，避光存放。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
细胞凋亡的重要特征包括通过TUNEL法检测DNA损伤，以及检测caspase活性（可通过单克隆抗体或ZVAD-fmk等结合分子检测）、观察细胞形态变化，以及细胞膜表面出现磷脂酰丝氨酸（PS）的暴露（可通过Annexin V结合检测）。这些检测方法各自存在一些局限性。例如，TUNEL法中所使用的末端脱氧核苷酸转移酶无法穿透数层以上的细胞。此外，Annexin V也可能标记非凋亡细胞，例如细胞膜受损的细胞（Annexin V进入细胞内部，与内层小叶上的PS结合）。同时，caspase活性检测可能检测到与细胞凋亡无关的caspase活性。LysoTracker并不能替代上述检测方法，但在特定实验背景下可作为有用的补充检测手段。
与其它方法相比，LysoTracker 染色具有多项优势。由于它是一种小分子染料，而非如末端转移酶（TUNEL 法所用）或 Annexin V 等蛋白质，因此能够轻易穿透较厚的组织。这意味着 LysoTracker 染色特别适用于观察细胞凋亡整体模式的变化。因此，LysoTracker 染色的一项重要应用是作为初筛实验，用于确定不同基因型的胚胎或细胞中程序性细胞.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Mariani实验室成员在编辑本方案过程中提供的帮助。本研究由加州再生医学研究所（CIRM）博士后培训基金（JLF）、CIRM BRIDGES实习项目（TZTT）、Robert E.和May R. Wright基金会（FVM）以及南加州大学（FVM）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | #L-7528 | |
| Hanks BSS | Invitrogen | 14025-076 | |
| 多聚甲醛 | EMD | EM-PX0055-3 | |
| Vectashield | 载体 | H-1200 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| 非必需氨基酸 | Cellgro | 25-025-CI | |
| 丙酮酸钠 | Cellgro | 25-000-CI | |
| FBS | Hyclone | SH30071.02 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-巯基乙醇–乙醇，50 mM | Invitrogen | 21985-023 | |
| LabTek-II 培养皿腔室载玻片 （8孔） | Nalge Nunc International | 154534 | |
| 0.1% 明胶 | 默克密理博 | ES-006-B | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS） | Cellgro | 21-031-CV | |
溶液配制方法 4% 多聚甲醛 100 ml：
警告：以“颗粒”形式（压缩的小颗粒）存在的多聚甲醛粉尘较少，因此可在通风橱外称量。但在操作时仍应佩戴防护性防尘口罩（至少N95级别）。 EB培养基 500 ml EB 培养基： <表格 边框="1"> | |||
| DMEM： | 404.5 ml | ||
| FBS： | 75.0 ml | ||
| L-谷氨酰胺： | 5.0 ml | ||
| 青霉素/链霉素 | 5.0 ml | ||
| 非必需氨基酸： | 5.0 ml | ||
| 丙酮酸钠： | 5.0 ml | ||
| β-巯基–乙醇 | 500 μl |
参考文献
- Baehrecke, E. H. How death shapes life during development. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).
- Meier, P., Finch, A., Evan, G. Apoptosis in development. Nature. 407, 796-801 (2000).
- Ikonomidou, C.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
