骨转移模型

摘要

动物模型常被用于研究癌症向骨骼的转移。在本方案中，我们将介绍两种常用于骨转移研究的肿瘤接种方法，并简要描述一些用于监测和定量分析这些模型的常用方法。

摘要

骨转移在多种恶性肿瘤中较为常见，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌。一旦肿瘤在骨组织中定植，将导致显著的发病率和死亡率¹。因此，深入理解调控肿瘤在骨中定植、生长及活性的分子机制具有重要意义。目前已建立多种体内模型用于研究这些过程，每种模型均有其特定的优势与局限性。最常用的模型是将肿瘤细胞直接注射至无胸腺（裸鼠）BalbC小鼠的心室，从而进入动脉血液循环系统。该方法可适用于多种不同类型的肿瘤（包括PC-3前列腺癌、肺癌和小鼠乳腺脂肪垫肿瘤）；然而，在本文中我们将重点介绍乳腺癌模型MDA-MB-231。在该模型中，我们使用一种高度特异性趋向骨组织的克隆株，该克隆株最初由圣安东尼奥Dr. Mundy研究组建立²，后经我们研究组转染以表达GFP并重新克隆³。该克隆株为骨转移变异型，具有高度的嗜骨性，极少向肺、肝或肾上腺转移。尽管心内注射最常用于骨转移研究²，但在某些情况下，胫骨内注射⁴或乳腺脂肪垫注射更为合适。当使用人源肿瘤细胞并旨在监测转移后期阶段（特别是癌细胞在骨中滞留、存活、增殖并形成导致癌性骨病的肿瘤的能力）时，通常采用心内注射。若研究重点是肿瘤转移至骨后癌细胞与骨组织之间的相互作用，则更宜采用胫骨内注射，该模型大致对应于已建立的转移性骨病状态。然而，这两种模型均无法重现肿瘤细胞发生栓塞并进入循环系统之前的转移早期过程。若需监测原发肿瘤的生长或从原发部位向骨转移的情况，通常首选乳腺脂肪垫接种；但极少有肿瘤细胞系能稳定地从原发部位发生骨转移，其中例外的是4T1骨趋向性克隆，即一种小鼠乳腺癌细胞系^5,6。

本文详细介绍了接种操作流程，并重点阐述了接种后分析的关键步骤。具体内容包括细胞培养、心内接种和胫骨内接种的肿瘤细胞接种操作，以及利用X射线、荧光成像和组织形态计量学分析进行每周监测的简要信息。

方案

1. 细胞培养与维护

1. MDA-MB-231 存在多种骨转移亚克隆，其在骨组织中定植和生长的能力各不相同。在我们的实验中，使用的是来自UTHSCA开发的GFP标记MDA-MB-231细胞系的一个克隆²。该特定亚克隆在接种后约3周可形成可见的溶骨性骨病变，实验终点为接种后4周处死动物。
2. 将细胞培养于含10%胎牛血清和0.1 mg/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，37 °C、5-8% CO₂条件下培养⁷。
3. 当细胞融合度达到80-90%时进行传代，按1:10比例重新接种（具体比例可根据细胞类型和培养皿大小调整。以T-75培养瓶中的MDA-MB-231细胞为例，约为6×10⁵个细胞），大约每72小时传代一次。
4. MDA-MB-231细胞通常呈成纤维细胞样形态，具有大量伪足。若出现细胞变圆，提示存在过度拥挤或其他不良应激状态，应予以避免，因为这可能影响其在体内的转移潜能in vivo。
5. 理想情况下，细胞在接种前仅应短暂培养（建议不超过1周，或直至获得足够实验用量的细胞）。若观察到细胞变圆或生长速率改变，应重新复苏新的冻存细胞株。

2. 细胞制备

1. 使用 0.15% 胰蛋白酶/EDTA（将 0.5% Gibco 胰蛋白酶 EDTA 用 PBS 按 1:2 稀释）对 80–90% 融合度的细胞进行消化。该浓度可实现快速脱离（<2 分钟），并减少细胞聚团。
2. 立即用 10 ml 冰冷的含 10% FBS 的 DMEM 终止消化并收集细胞，移入 15 ml 圆底离心管中，以 200 × g 离心 5 分钟。
3. 将细胞沉淀重悬于 50 ml 圆底离心管中的 25 ml 冰冷 PBS（不含 Ca 和 Mg）中，并进行计数。
4. 离心后重新沉淀细胞，然后在冰预冷的 PBS 中重悬至终浓度为 10⁶ 个细胞/ml（用于心内注射）或 250,000 个细胞/10 μl（用于胫骨内注射）。PBS 的温度至关重要，可防止细胞聚团及注射后发生栓塞。细胞悬液在注射过程中应始终置于冰上，可在 30 分钟内保持活性且不发生聚团。所需培养皿数量因研究者而异，我们通常使用 1 个 T-75 培养瓶可满足 8–10 只小鼠的细胞需求。

3. 心内接种

1. 使用4-6周龄的雌性（Foxn nu-/-：Harlan）小鼠进行这些实验，但其他免疫缺陷小鼠（如RAG1-/-、RAG2-/-、SCID、XID等）也可用于人源癌细胞实验。
2. 在注射前5-10天应给裸鼠饲喂Teklad 2920x饲料，以降低注射操作导致的死亡率，并减少成像过程中的背景荧光（因为该饲料不含苜蓿）。
3. 若使用非nu/nu小鼠，操作开始前需通过剃毛或使用Nair脱毛剂去除腹腹部区域的毛发（根据我们的经验，Nair效果更佳）。
4. 在隔离室中使用异氟烷蒸发器（2.5% Iso：2-3 L/min O₂）或其他首选麻醉方法对小鼠进行麻醉（根据我们的经验，异氟烷对心内接种耐受性最佳）。
5. 将小鼠逐只转移至不锈钢通风罩内麻醉机的鼻罩中。
6. 将每只小鼠仰卧固定，胸部朝上。
7. 先用10%聚维酮/碘溶液棉签或溶液擦拭胸部，再用70%乙醇擦拭，重复两次。
8. 在小鼠胸部标记注射位置（可使用无菌标记笔，或稍偏离注射点标记以保持注射部位无菌）。我们通常选择胸骨切迹与剑突顶端之间的中点，并略微偏向胸骨左侧（解剖学左侧）。用28 g ½胰岛素注射器（300 μl）吸取少量空气形成气泡，使推杆与弯月面之间留有空隙（便于观察心脏搏动），然后抽取100 μl细胞悬液。
9. 保持针头朝上。用另一只手绷紧小鼠皮肤后插入针头。
10. 成功插入左心室后，注射器内应可见明显的鲜红色搏动性回血。在此深度下，缓慢推动注射器推杆（注入100 μl体积），避免针头明显移动，以防刺穿心脏或将细胞泄漏至胸腔。
11. 注射完成后，轻轻回抽推杆，产生轻微负压，以减少细胞液滴入胸腔。
12. 将针头垂直从胸部拔出，拔出时避免倾斜，以免撕裂心脏内膜导致出血。
13. 在注射部位轻压胸部以减少出血。
14. 将小鼠从鼻罩移开，继续施加轻压约1分钟。
15. 将小鼠转移至加热垫直至完全清醒。
16. 若小鼠恢复后出现旋转或抽搐，可能原因为栓塞。此时应腹腔注射80-120 mg/kg的氯胺酮，以增加血流量和心输出量，同时降低血管阻力，帮助小鼠通过血栓。发生此情况后，建议更换细胞悬液，因其提示细胞已发生聚集。我们通常在处理约8只小鼠或30分钟后更换一次细胞悬液。

4. 胫内注射

1. 在操作前立即向小鼠注射Buprenex（0.1 mg/kg）或类似的批准镇痛剂。
2. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉，然后转移至鼻罩并维持麻醉状态。
3. 用10%聚维酮碘棉签/溶液清洁双侧腿部，随后用乙醇擦拭，重复2次。若腿部有毛发，应在清洁前使用Nair或类似产品脱毛。
4. 用拇指和食指轻轻抓住外踝、内踝及胫骨下半部分，然后弯曲腿部（结合屈曲和外旋动作），使膝关节清晰可见并易于操作。
5. 用70%乙醇润湿皮肤，以增强皮下髌韧带的可见度，该韧带应呈现为一条明显、粗大、白色的线条。在牢固握住小鼠脚踝/腿部的同时，将28G ½针头从髌骨下方穿过髌韧带中部，进入胫骨上端的前髁间区域。
6. 将针头插入胫骨时，应使用稳定而坚定的压力，并辅以轻微旋转动作，小心通过生长板。
7. 当针头穿透胫骨生长板时，会明显感觉到阻力减小。
8. 轻轻横向移动针头，以确认其已进入胫骨并穿过生长板。若针头位置正确位于胫骨内，其活动范围将受到限制。
9. 缓慢推动针栓，注入10 μl细胞悬液。此时应几乎感觉不到阻力。
10. 缓慢拔出针头。
11. 按照相同操作步骤，对另一侧腿部注入10 μl PBS。
12. 将小鼠移出麻醉状态，并置于加热垫上直至恢复意识。
13. 在接下来的24小时内密切观察小鼠，若动物持续表现出痛苦迹象，应每12小时追加一次Buprenex注射。

5. 成像时间过程

1. 荧光素酶成像：在肿瘤细胞接种后第7天开始，应根据情况使用荧光素酶成像（但在大多数骨转移模型中，通常在第14天左右才可检测到）。小鼠通过腹腔注射150 mg/kg的荧光素，麻醉后，在注射后8分钟使用IVIS设备进行成像 ⁸。
2. 绿色荧光蛋白（GFP）成像：通常，表达GFP的肿瘤在胫骨内注射后约第10-14天开始可检测到，而在心脏内注射实验中则在第16-21天可检测到，使用Maestro成像设备（CRi）⁹。简而言之，小鼠使用异氟烷（3%）麻醉，并通过鼻罩在Maestro成像腔内维持麻醉状态。对于表达eGFP的细胞，我们使用蓝色滤光片组（eGFP激发波长498，发射波长515），曝光时间为500毫秒，以10纳米为步长进行扫描。
3. Faxitron（X射线）：从第7至14天开始每周拍摄X射线图像。在心脏内注射模型中，病灶在第21天可见，而在胫骨内注射模型中则提前一周可见³。我们的体外（ex vivo）和体内（in vivo）放射学数据使用Faxitron LX-60设备在35 kV电压下曝光8秒获得。
4. 其他成像方法：成像方式完全取决于具体研究需求。除上述方法外，基于三维微型计算机断层扫描（μCT）、微型正电子发射断层扫描（μPET）及其他成像模式的活体动物成像^10,11也可提供有价值的信息。

6. 小鼠处死

1. 每种模型的时间进程略有不同。使用 MDA-MB-231 细胞时，小鼠通常在接种后 21 至 35 天之间出现恶病质或截瘫，通常在第 28 天左右（尾静脉注射小鼠在 21 至 28 天之间）。
2. 一旦多只小鼠出现病灶突破皮质骨、发生截瘫或体重减轻 10–20%，即采用过量氯胺酮/赛拉嗪联合颈椎脱位法（或其他经 IACUC 批准的方法）处死研究中的所有小鼠。
3. 取出后续研究所需骨骼，并保存于含 4% 甲醛的缓冲液中。
4. 出现胸部肿瘤的小鼠提示注射失误，应从研究中剔除。

7. 离体 分析

1. μCT：在70% EtOH中扫描，可对同一骨样本同时测量结构和组织学参数。
2. 根据各自的实验设计和可用设备进行轮廓勾画与分析¹⁰。我们的数据采用Scanco μCT 40以12 μm分辨率获得。
3. 组织形态计量学：采用常规组织学方法处理样本，并用苏木精/伊红染色⁷。

8. 代表性结果

在将肿瘤细胞接种至小鼠心脏内或胫骨内后（图1），通过放射成像和荧光（或生物发光）每周监测小鼠。病灶通常在第2至第3周之间通过X射线可见，而通过荧光或生物发光成像可能早在第2周即可观察到，具体取决于模型（图2）。病灶在骨骼中表现为暗色空洞，并随时间推移逐渐加重（图3）。采用Metamorph软件对X光片进行分析以量化病灶，荧光信号则使用Maestro（CRi）成像采集与分析软件进行定量。随着病灶开始生长，小鼠常出现恶病质。当小鼠体重减轻达到初始体重的10–20%时，需实施安乐死。小鼠状况可能迅速恶化，必须每天多次观察。在第3至第4周期间，小鼠开始拖行一条或两条后肢，此时整个实验结束，于安乐死前采集图像。在麻醉过量后采集血液，用于检测骨转换标志物或其他因子。经颈椎脱位处死后，剥离小鼠皮肤，取出骨骼并清理干净，用于ex vivo成像（图3），该方法可比in vivo成像技术提前至少7天观察到肿瘤病灶。成像完成后，将骨骼置于标记好的包埋盒中，用甲醛固定，用于后续组织学处理或μCT分析。在对胫骨进行μCT扫描以定量骨破坏程度后，对样本进行组织形态计量学分析，以评估肿瘤负荷及骨体积/组织体积（BV/TV）（图4）。

图1. 注射位置的正确放置。 成年小鼠胸部腹侧X线影像（A），显示针头正确置于第4肋间^th 肋间隙并插入左心室以进行心内接种。胸骨上的解剖标志以白色轮廓标出，其上显示水平的虚线。在小鼠皮肤表面，胸骨切迹和剑突可作为定位标志，进针位置位于胸骨左侧稍偏处。图B为成年小鼠腿部的腹位X线影像，显示针头正确置于胫骨近端，位于内外侧髁之间。从侧位观察，针尖位于胫骨结节后方，并处于骨骺板深部。白色圆圈所示为理想的注射位置。

图2. 骨转移模型的时间进程。 利用X射线与肿瘤GFP+荧光图像显示癌性骨病的进展 体内 来自胫内注射（A）和心脏内注射（B）。

图3. 心内注射MDA-MB-231模型的时间进程。 上排：离体图像，显示在心内注射MDA-MB-231细胞后第0、14、21和28天的GFP荧光信号。请注意，第14天的肿瘤病灶仅在去除软组织后的离体状态下可见。下排：相同股骨的离体放射影像，显示溶骨性骨病变。请注意，骨破坏通常在心脏注射后3周才开始显现。

图4. 骨转移进展的定量分析。 通过Maestro成像系统对非荷瘤小鼠（A）和经心内注射表达GFP的MDA-MB-231亚克隆后4周的小鼠胫骨进行离体（ex vivo）成像所观察到的GFP+肿瘤（B）。Faxitron成像显示，肿瘤病灶与骨破坏区域相对应（D），而无肿瘤的骨骼则无此现象（C）。microCT测量所得的骨结构与矿化数据被重建为三维图像，分别展示健康骨（E）和荷瘤骨（F），其中骨破坏区域表现为空腔区域。相应的H&E染色组织切片中可进一步观察到骨与肿瘤的详细结构（G 和 H）。

讨论

肿瘤诱导性骨病的研究依赖于多种动物模型，其中最常用的两种是心脏内接种和胫骨内接种。在许多情况下，心脏内接种是研究肿瘤向骨骼转移的最佳选择；然而，它并不能完全代表整个转移过程，因此理想情况下应使用乳腺脂肪垫或其他原位注射方法来实现这一目的。在大多数使用人源细胞的研究中，肿瘤细胞从原发部位发生转移的能力较弱，即使发生转移，也主要转移至肺部。某些4T1细胞株可转移至骨骼^5,6，但所形成的病灶较小、难以定量，且这些细胞为鼠源而非人源。此外，在免疫功能健全的模型中常使用的4T1克隆若表达GFP，可能引发免疫反应，从而干扰长期转移研究¹²。其他用于肿瘤诱导性骨病的模型（如骨髓瘤）则采用尾静脉注射¹³。然而，该方法不适用于实体瘤转移研究，因为它会导致肿瘤细胞大量定植于肺部，使小鼠在出现骨转移前即因肺部疾病死亡。通常认为胫骨内注射的适用性低于其他方法，因为它并不代表转移过程的模型，而仅反映已建立的转移性骨病的进展过程，且可能引起注射部位的炎症反应。尽管如此，该操作有助于将初始转移事件与癌性骨病终末期的直接效应区分开来。此外，对于许多前列腺肿瘤模型而言，这是唯一能够在骨组织中实现稳定肿瘤生...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MDA-MB-231 人乳腺癌细胞	最初来自 ATCC，内部克隆并筛选
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech 公司	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
胰蛋白酶	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT 扫描仪	Scanco
裸鼠（无胸腺裸鼠）	Harlan	Fox nu -/-
胰岛素注射器（300 μl，28.5 g）	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
辐照啮齿类动物饲料	Teklad	2920x