方法文章

骨转移模型

DOI：

10.3791/4260

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2012年9月4日

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1Department of Pharmacology, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Center for Bone Biology, Vanderbilt University, 3Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Healthcare System (VISN 9), 4Department of Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Vanderbilt University, 5Department of Cancer Biology, Vanderbilt University

本文内容

摘要

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动物模型常被用于研究癌症向骨骼的转移。在本方案中，我们将介绍两种常用于骨转移研究的肿瘤接种方法，并简要描述一些用于监测和定量分析这些模型的常用方法。

摘要

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骨转移在多种恶性肿瘤中较为常见，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌。一旦肿瘤在骨组织中定植，将导致显著的发病率和死亡率1。因此，深入理解调控肿瘤在骨中定植、生长及活性的分子机制具有重要意义。目前已建立多种体内模型用于研究这些过程，每种模型均有其特定的优势与局限性。最常用的模型是将肿瘤细胞直接注射至无胸腺（裸鼠）BalbC小鼠的心室，从而进入动脉血液循环系统。该方法可适用于多种不同类型的肿瘤（包括PC-3前列腺癌、肺癌和小鼠乳腺脂肪垫肿瘤）；然而，在本文中我们将重点介绍乳腺癌模型MDA-MB-231。在该模型中，我们使用一种高度特异性趋向骨组织的克隆株，该克隆株最初由圣安东尼奥Dr. Mundy研究组建立2，后经我们研究组转染以表达GFP并重新克隆3。该克隆株为骨转移变异型，具有高度的嗜骨性，极少向肺、肝或肾上腺转移。尽管心内注射最常用于骨转移研究2，但在某些情况下，胫骨内注射4或乳腺脂肪垫注射更为合适。当使用人源肿瘤细胞并旨在监测转移后期阶段（特别是癌细胞在骨中滞留、存活、增殖并形成导致癌性骨病的肿瘤的能力）时，通常采用心内注射。若研究重点是肿瘤转移至骨后癌细胞与骨组织之间的相互作用，则更宜采用胫骨内注射，该模型大致对应于已建立的转移性骨病状态。然而，这两种模型均无法重现肿瘤细胞发生栓塞并进入循环系统之前的转移早期过程。若需监测原发肿瘤的生长或从原发部位向骨转移的情况，通常首选乳腺脂肪垫接种；但极少有肿瘤细胞系能稳定地从原发部位发生骨转移，其中例外的是4T1骨趋向性克隆，即一种小鼠乳腺癌细胞系5,6。

本文详细介绍了接种操作流程，并重点阐述了接种后分析的关键步骤。具体内容包括细胞培养、心内接种和胫骨内接种的肿瘤细胞接种操作，以及利用X射线、荧光成像和组织形态计量学分析进行每周监测的简要信息。

方案

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1. 细胞培养与维护

  1. MDA-MB-231 存在多种骨转移亚克隆，其在骨组织中定植和生长的能力各不相同。在我们的实验中，使用的是来自UTHSCA开发的GFP标记MDA-MB-231细胞系的一个克隆2。该特定亚克隆在接种后约3周可形成可见的溶骨性骨病变，实验终点为接种后4周处死动物。
  2. 将细胞培养于含10%胎牛血清和0.1 mg/ml青霉素-链霉素的DMEM培养基中，37 °C、5-8% CO2条件下培养7。
  3. 当细胞融合度达到80-90%时进行传代，按1:10比例重新接种（具体比例可根据细胞类型和培养皿大小调整。以T-75培养瓶中的MDA-MB-231细胞为例，约为6×105个细胞），大约每72小时传代一次。
  4. MDA-MB-231细胞通常呈成纤维细胞样形态，具有大量伪足。若出现细胞变圆，提示存在过度拥挤或其他不良应激状态，应予以避免，因为这可能影响其在体内的转移潜能in vivo。
  5. 理想情况下，细胞在接种前仅应短暂培养（建议不超过1周，或直至获得足够实验用量的细胞）。若观察到细胞变圆或生长速率改变，应重新复苏新的冻存细胞株。

2. 细胞制备

  1. 使用 0.15% 胰蛋白酶/EDTA（将 0.5% Gibco 胰蛋白酶 EDTA 用 PBS ....

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讨论

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肿瘤诱导性骨病的研究依赖于多种动物模型，其中最常用的两种是心脏内接种和胫骨内接种。在许多情况下，心脏内接种是研究肿瘤向骨骼转移的最佳选择；然而，它并不能完全代表整个转移过程，因此理想情况下应使用乳腺脂肪垫或其他原位注射方法来实现这一目的。在大多数使用人源细胞的研究中，肿瘤细胞从原发部位发生转移的能力较弱，即使发生转移，也主要转移至肺部。某些4T1细胞株可转移至骨骼5,6，但所形成的病灶较小、难以定量，且这些细胞为鼠源而非人源。此外，在免疫功能健全的模型中常使用的4T1克隆若表达GFP，可能引发免疫反应，从而干扰长期转移研究12。其他用于肿瘤诱导性骨病的模型（如骨髓瘤）则采用尾静脉注射13。然而，该方法不适用于实体瘤转移研究，因为它会导致肿瘤细胞大量定植于肺部，使小鼠在出现骨转移前即因肺部疾病死亡。通常认为胫骨内注射的适用性低于其他方法，因为它并不代表转移过程的模型，而仅反映已建立的转移性骨病的进展过程，且可能引起注射部位的炎症反应。尽管如此，该操作有助于将初始转移事件与癌性骨病终末期的直接效应区分开来。此外，对于许多前列腺肿瘤模型而言，这是唯一能够在骨组织中实现稳定肿瘤生.......

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致谢

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作者感谢以下资助来源：P01CA040035（FE/JAS）和退伍军人事务部职业发展奖（JAS）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MDA-MB-231 人乳腺癌细胞最初来自 ATCC，内部克隆并筛选
DMEMGIBCO11885
PBSMediatech 公司21-040-CV
FBSAtlas BiologicalF-0050a
胰蛋白酶GIBCO15400
FaxitronFaxitron
MaestroCRi
μCT 扫描仪Scanco
裸鼠（无胸腺裸鼠）HarlanFox nu -/-
胰岛素注射器（300 μl，28.5 g）Becton Dickinson309300
IVISCaliper
辐照啮齿类动物饲料Teklad2920x

参考文献

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  1. Sterling, J. A., Edwards, J. R., Martin, T. J., Mundy, G. R. Advances in the biology of bone metastasis: how the skeleton affects tumor behavior. Bone. 48, 6-15 (2011).
  2. Yoneda, T., Sasaki, A., Mundy, G. R. Osteolytic bone metastasis in breast cancer. Breast Cancer Res. Treat

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MDA MB 231 GFP X CT

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