原位 膜片钳记录用于对完整神经环路中神经元的电生理特性进行表征。在完整的 果蝇 遗传模型中的膜片钳技术具有挑战性，因为其中枢神经系统体积较小且被一层坚韧的鞘膜包裹。本文描述了去除鞘膜并清理神经元以进行后续膜片钳记录的操作步骤。
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摘要
摘要
较短的世代周期和简便的遗传操作技术使果蝇 Drosophila melanogaster 基础神经科学研究中一种优良的遗传学模型。离子通道是所有行为的基础，因为它们介导神经元的兴奋性。首个被克隆的电压门控离子通道是 果蝇 电压门控钾通道 Shaker1,2为了理解离子通道和膜兴奋性在神经系统功能中的作用，结合在 果蝇 与 原位 膜片钳记录。多年来，此类记录一直受限于细胞尺寸过小 果蝇 中枢神经系统。此外，由胶质细胞和胶原构成的坚固鞘膜成为膜片钳电极接触中枢神经元的障碍。去除该鞘膜是进行成年个体任意神经元膜片钳记录的必要前提 果蝇 中枢神经系统。近年来，科学家已能够开展 原位 成年大脑神经元的膜片钳记录3,4 胚胎的腹神经索5,6幼虫7,8,9,10，以及成年个体 果蝇11,12,13,14稳定的吉欧密封是获得良好膜片记录的主要前提，其关键在于膜片钳电极与细胞膜之间保持清洁的接触，以避免漏电流的产生。因此，在全细胞记录中 原位 成年个体的膜片钳记录 果蝇 神经元必须彻底清洗。第一步，需对神经节鞘进行酶解处理，并通过机械方法将其去除，以暴露目标细胞。第二步，需对细胞膜进行抛光处理，确保无胶质细胞层、胶原或其他物质干扰吉欧封接（giga-seal）的形成。本文介绍如何制备一个已鉴定的中枢神经元 黑腹果蝇 腹神经索，飞行运动神经元5（MN5）15），用于体细胞全细胞膜片钳记录。通过在MN5中特异性表达GFP，实现神经元的识别与可视化。本文不旨在解释膜片钳技术本身。
方案
以下描述不针对某一特定运动神经元，可适用于任何神经元。在本示例中，我们使用支配背侧纵肌（DLM）最背侧两根肌纤维的飞行运动神经元5（MN5）。为了识别和观察MN5，我们采用UAS/GAL4系统在飞行运动神经元（以及少数其他神经元）中表达GFP。
1. 解剖成年 Drosophila 以获取腹神经索（VNC）的背侧部分
- 解剖一只成年个体 果蝇 背腹面朝上，沿其背侧中线置于硅胶包被的培养皿（直径35 mm）中，具体方法见Ryglewski和Duch（2009）13）。该解剖过程的视频可通过 JoVE 在线获取（Boerner 和 Godenschwege16以下是解剖步骤的简要说明。
- 将成年果蝇置于冰上冷却约1分钟以进行麻醉。可将一个无食物的空果蝇小瓶预先在冰上冷却，然后将果蝇放入已冷却的小瓶中。使用剪刀去除翅膀和腿部。
- 将果蝇背侧朝上固定于涂有硅胶的培养皿中（我们使用直径35 mm培养皿的皿盖，内盛硅胶至边缘）； 图1A、B用凡士林将塑料环（内径 9 mm，厚 1.3 mm）粘附于硅胶表面。
- 使用35 mm培养皿的皿盖有助于在水浸物镜观察下通过膜片钳玻璃微电极接近腹神经索（VNC），从而实现微电极的浅层插入，避免触碰培养皿壁。
- 塑料环可通过在薄塑料片（我们使用厚度....
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讨论
在使用GFP等荧光蛋白观察细胞时，应避免样品暴露于过强的光照下，以免造成光损伤。我们采用100 W HBO短弧汞灯作为照明光源，并使用0.8的中性密度（ND）滤光片（Chroma ND滤光片0.3和0.5组合）。为了准确判断清洗效果，良好的可视性至关重要。因此，可在短时间内（约20秒）多次暂时移除ND滤光片以提高亮度。
施加一定正压时，细胞体会轻微“摆动”，这有助于判断清洁的质量。腹神经索的对比度很低，而细胞的运动对于观察细胞极为有帮助。用于清洁操作（以及膜片钳制）的电极 holder 必须密封严密，否则无法实现可控的压力施加。压力泄漏会影响组织和碎片的有效清除，并阻碍吉欧封接（giga-seal）的形成。
如果在清理细胞后需要进行in situ膜片钳记录，请注意：不仅腹神经索整体被一层鞘膜包裹（对成年果蝇任何中枢神经元进行膜片钳记录时均需去除该鞘膜），细胞本身也可能被一层鞘膜包围。例如，MN5细胞即被一层非细胞性鞘膜包裹，该鞘膜仅在短暂高强度光照下可见。此外，细胞可能位于气管下方。若细胞无法接触，需将气.......
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白酶类型 XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil 灵活注射针 | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管，外径 1.5 mm，内径 1.0 mm，无纤维 | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard 弹性体试剂盒 184（Dow Corning） | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND 滤光片组（未安装） | Chroma Technology Corp. | 22000b 系列 | |
| 电极夹持器 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
参考文献
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y.
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