一种用于可视化和量化小鼠肝门静脉或肝内胆管三维结构的方法。该树脂铸型技术还可应用于其他导管或血管系统，并能够实现 原位 系统完整通信结构的可视化或量化
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摘要
摘要
在器官中，血管和导管结构的正确构架对于正常的生理功能至关重要，而这些结构的形成与维持是一个高度受调控的过程。对这些复杂的三维结构的分析，在很大程度上依赖于切片的二维观察或染料注射研究。然而，这些技术无法提供其所旨在阐明的导管或血管结构的完整且可量化的表征。相比之下，三维塑料树脂铸型技术能够永久记录系统的形态，是一种新颖且广泛应用的可视化与量化三维结构及网络的有效方法。
树脂铸型技术的一个关键优势在于能够确定血管或导管的完整、连通或相互交通的结构。血管和导管网络的结构对器官功能至关重要，该技术有望从多个方面辅助研究这些网络系统。树脂铸型可用于分析管腔结构的正常形态与功能构架，识别发育过程中的形态发生改变，并揭示正常状态与疾病状态下组织结构的形态学差异。已有研究应用树脂铸型技术，例如：发现小鼠肝内胆管系统中未在二维结构分析中体现的结构与功能缺陷1,2，阿尔茨海默病小鼠模型脑血管系统的改变3，门静脉高压及肝硬化小鼠的门静脉异常4，大鼠淋巴系统在未成熟肺与成年肺之间发育过程中的阶段性变化5，以及大鼠肝脏、胰腺和肾脏在化学损伤刺激下发生的即时微血管改变6。
本文介绍一种生成小鼠血管或导管网络三维树脂铸型的方法，重点针对门静脉和肝内胆管。通过组织透明化或离解处理后，可对这些铸型进行观察和分析。该技术几乎适用于任何血管或导管系统，可直接应用于研究三维导管或血管结构的发育、功能、维持或损伤的相关课题。
方案
1. 准备套管
- 用手指尖加热一段约1英寸长的PE10管，然后拉伸，使其变细。
注意：需要插管的血管或导管的尺寸将决定所需的拉伸程度。胆管铸型需要充分拉伸导管，而较大的门静脉则可能只需适度拉伸即可。 - 将拉伸后的管子一端斜向剪切，形成斜面尖端。
- 将管子的另一端剪断，制成一段5-6英寸长的管段。
- 将一根32号、½英寸长的皮下注射针插入管子的非斜面端。
2. 准备含有 PBS 的注射器
- 用 PBS 填充一支 3 ml 注射器。
- 将注射器旋接到已连接先前制备的拉细 PE10 管的皮下注射针头上。
- 轻弹注射器并推动活塞，确保 PBS 已充满针头和导管，且注射器内无气泡。
- 将装有 PBS 的注射器放入用油泥塑成的注射器固定架中。该固定架可在导管插入导管时保持注射器稳定。
3. 其他设置
- 称取0.1 g催化剂置于小容器中， 例如24 孔板中的一个孔
- 将1 ml树脂吸入3 ml注射器中。
注意：可调整催化剂与树脂的相对用量以改变固化时间。然而，减少催化剂用量可能会增加铸型收缩，并导致铸型质量下降。
注意：操作树脂时，应采取预防措施，避免与树脂直接接触或吸入树脂烟雾。操作时务必佩戴手套，并在通风良好的区域（如化学通风橱）中进行涉及树脂的步骤。 - 剪取一段长约5英寸的5.0号丝线，用作结扎线。
4. 准备小鼠
- 处死成年小鼠。将小鼠仰卧位放置，打开腹腔。
- 将小鼠置于解剖显微镜载物台上。在小鼠下方垂直放置一个15 ml圆锥形离心管，以增加肝脏的可见度和操作可及性。
- 用PBS润湿棉签，将其用于将肝脏向上并向远离操作者的方向翻转，以暴露肝脏的背侧以及肝外门静脉或胆总管。
- 进行门静脉灌注造影时，可通过用室温PBS冲洗血管来防止血液凝固。将一针头连接至装有PBS的3 ml注射器，尽可能远离肝脏插入肝外门静脉。轻柔地将PBS推入门静脉。在颈总静脉处做一个小切口以引流血液。使用湿润的棉签按摩肝脏，促进血液排出。此步骤不推荐用于胆管灌注，且可能并非所有血管系统均需执行。
注意：此步骤也可使用4%多聚甲醛替代PBS。使用4%多聚甲醛可能增强血管完整性，从而获得更精确的血管铸型，尤其是对较小的血管结构。
5. 插管肝外门静脉或胆总管
- 使用弯头镊子将手术缝合线从门静脉或胆管下方穿过，位置约距肝脏¼英寸处。
- 将缝线打成一个松散的普通结。切勿拉紧该结。
- 若使用开放式系统，可在系统的另一端结扎并收紧一条结扎线。如果已切开前主静脉以引流门静脉中的血液，则需在其周围结扎，以增加门静脉内的压力，并防止树脂渗漏至肝中央静脉。
- 使用弹簧剪在门静脉或胆管上距缝合结下方约¼英寸处做一个小切口。切口深度不应超过门静脉或胆管直径的一半。
- 使用#5镊子夹住门静脉或胆管的切口部位，并将导管的斜面端插入胆管中。
- 将导管尖端推过预先打好的结扎线，并朝向肝脏方向推进。
- 通过导管注入磷酸盐缓冲液（PBS），观察液体是否进入门静脉或胆管，以检测插管位置是否准确。
- 拉紧结扎线，固定导管位置。
6. 门静脉或肝内胆管树脂铸型
- 将预先量取的1 ml树脂加入预先量取的0.1 g催化剂中，充分混合。避免产生气泡。
- 将树脂-催化剂混合物重新吸入3 ml注射器中。通过轻轻弹击注射器并排出气泡以去除任何气泡。
注意：在浇铸小型结构时，使用真空室去除树脂中的微小气泡以提高铸型质量可能有所帮助。为了留出足够时间完成此步骤，有必要降低上述建议的催化剂/树脂比例，以减缓树脂固化速度。 - 小心地将含PBS的注射器替换为含树脂的注射器，保持32号针头仍连接在套管上。
- 缓慢而轻柔地将树脂推入门静脉或胆管，直至阻力增加且肝脏完全充填。
- 用湿润的棉签轻轻按摩肝脏，促进均匀充填。
- 从结构中移除套管，并迅速重新扎紧结扎线，防止树脂泄漏。
- 让小鼠平放于室温下20分钟，使树脂固化，然后取出肝脏。
- 继续进行肝脏的透明处理或腐蚀处理。
7. 透明肝脏以供观察 原位
- 在4%多聚甲醛中于4℃固定肝脏过夜 4 °C，振荡。
- 用 PBS 洗涤肝脏，至少 4 小时，期间持续摇动。此时可根据需要将肝脏叶分离。
- 在50%甲醇中脱水，然后在100%甲醇中脱水，每步至少4小时，室温摇动。
- 在苯甲醇与苯甲酸苄酯（BABB）的1:2溶液中振荡孵育肝脏组织至少24小时以实现透明化。可能需要更长的孵育时间。若肝脏在2–3天后仍未完全透明，将其转移回100%甲醇中处理24小时，随后重复BABB透明化步骤。
- 将肝脏置于玻璃培养皿中的BABB试剂中浸泡以进行成像 原位
8. 匀浆肝脏组织
- 取出小鼠肝脏并放入含有水的50 ml锥形管中。等待1小时以完成树脂固化。如有需要，可分离肝叶。
- 倒去水，将肝脏转移至玻璃瓶中，浸入15% KOH溶液。室温下静置过夜。勿摇动。
- 小心倒去KOH溶液，用蒸馏水清洗铸型。注意：铸型非常脆弱，应极为小心地操作。在向管中添加或移除液体时，避免破坏铸型。
- 当树脂铸型清洗干净后，轻轻将其置于无尘纸（Kimwipe）上晾干，然后转移至容器中保存。
9. 代表性结果
门静脉或胆管的成功造影将显示从肝门延伸至肝脏外周的连续网络，其分支逐渐变细。
图1 显示门静脉铸型的可视化结果 原位 经BABB透明化处理后。 图1A 显示整个左肝叶铸型及其形状和大小。 图1B 展示了同一铸型的特写视图，显示树脂已渗入肝脏边缘最小的门静脉分支。
图2显示经KOH腐蚀处理后的门静脉铸型。图2A显示整个左侧肝叶，图2B为外周小分支的放大图像。
该技术也已成功应用于肝内胆管，并结合BABB透明化和KOH腐蚀技术发表过相关研究1,2,7。
常见问题包括灌注不完全、树脂中出现气泡，以及树脂溢出至周围系统或组织。图3展示了如何识别灌注不完全（图3A）、气泡（图3A）以及树脂从门静脉溢出至中央静脉的情况（图3B）。
所有图像均使用 Leica MZ 16 FA 体视显微镜和 QImaging RETIGA 4000R 相机拍摄。
图 1. 经BABB透明处理的肝脏左叶门静脉树脂铸型。A. 树脂铸型显示从肝门延伸至肝外周的分级分支结构。树脂铸型在带蓝色调的肝叶中呈黄色。B. 放大图像显示树脂填充延伸至肝外周的小分支。经透明处理的肝脏中，树脂呈灰白色。比例尺 = 1 mm。
图 2. 肝左叶门静脉的组织研磨树脂铸型。A. 整个肝叶的树脂铸型显示了多种不同大小的分支。B. 放大图像显示肝组织周边的小分支。小分支呈羽毛状，代表树脂填充了肝窦间隙，该结构在树脂铸型中可能可见也可能不可见，若存在则会增加表观分支密度。树脂呈白色。比例尺 = 1 mm。
图 3. 树脂铸型中的常见问题。A. 左叶门静脉灌注不全表现为部分或全部铸型分支未能延伸至肝脏外周。该铸型还存在气泡，表现为铸型连续性中断（箭头所示）。B. 由于在某些区域门静脉与中央静脉分支位置邻近，门静脉树脂常会进入并填充中央静脉。当观察到两条明显不同的门区分支（箭头所示）以及具有不同分支模式且相互重叠的两种结构时，即可识别此现象。区分技术性误差与真实的形态学改变可通过两种方式实现：第一，应将铸型结构与基于二维分析或其他方法所预期的结构进行比较；第二，必须进行多次重复实验，且在可能的情况下对结构进行量化，并进行统计学分析，以确定结果的可重复性，以及不同实验组与对照组之间是否存在具有统计学意义的形态学差异。
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讨论
我们已描述了如何对肝脏的门静脉和肝内胆管系统进行铸型的具体实例，但该技术经过稍加改进，几乎可应用于任何其他导管或血管系统。以往的研究已在多种物种中证实了该技术的可行性，包括小鼠1,2,7-9、雏鸭10,11、兔12,13、犬14和猪15，以及多个器官，如鼻腺14、心脏16、膀胱12,13和肝脏1,2,7,8。这些铸型可用于比较同一组织内的多个系统（例如门静脉与胆管）、不同发育阶段间的相同结构5，或基因型或环境因素改变对某一结构的影响1-4,6,7。该技术在多种物种和器官中的广泛应用，使树脂铸型成为研究血管和导管结构形态的极为有价值的工具，并有望极大增进我们对这些结构正常功能的理解，以及它们在动物疾病模型中如何受到或如何影响器官功能的认识。
使用树脂制作三维铸型可对导管或血管系统提供永久性的结构记录，相较于类似技术具有多项优势。首先，铸型在腐蚀...
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）向 S.S.H. 提供的资助（R01-DK078640），霍华德·休斯医学研究所（HHMI）通过 HHMI/范德堡大学分子医学证书项目向 T.J.W. 提供的资助（GRDOT56006779），以及范德堡糖尿病研究与培训中心（P30-DK020593）和范德堡消化疾病研究中心（P30-DK058404）提供的核心服务支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| PE10 聚乙烯导管 | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 外科黑色编织丝线 | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm 针头 | Air-tite | TSK3213 | |
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 5 号镊子 | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II 套件 | Ladd Research | 21247 | |
| 苯甲醇 | Fisher Scientific | 1816-04 | 仅用于 BABB 透明化处理 |
| 苯甲酸苄酯 | MP Biomedicals, LLC | 154839 | 仅用于 BABB 透明化处理 |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | |||
| 模型黏土 | |||
| 天平 | |||
| 实验室剪刀 | |||
| 15 ml 带盖聚丙烯管 | |||
| 4% 多聚甲醛 | |||
| 15% 氢氧化钾 (KOH) | 仅用于组织软化处理 | ||
| 剃须刀片 | |||
| 100% 甲醇 | |||
| 3 ml 鲁尔锁注射器 |
参考文献
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