小鼠复发性疱疹性间质性角膜炎，一种研究人类HSK的模型

摘要

大多数关于疱疹性角膜病的研究采用原发感染模型。然而，HSV-1的原发感染通常不会导致人类疾病。本文描述了一种更接近人类疾病的疱疹性角膜病复发模型。

摘要

单纯疱疹性眼病，称为单纯疱疹性间质性角膜炎（HSK），是一种可能导致失明的角膜感染，每年因此接受治疗的临床就诊人数超过30万人次。在患有临床疾病的患者中，有1%至2%将出现感染角膜的视力丧失。绝大多数此类病例是由单纯疱疹病毒1型（HSV-1）潜伏感染的再激活所致，而非急性疾病引起。有趣的是，目前最常用于研究该疾病的模型是急性感染模型。然而，人们认为HSK的复发模型更能反映临床疾病的实际过程。目前用于HSK的复发动物模型包括兔和小鼠模型。兔模型的优点在于，其潜伏感染可在无已知刺激的情况下发生再激活。但缺点是，由于缺乏小鼠所具备的丰富免疫学与遗传学研究资源，难以深入探究多种免疫因子在复发性HSK中的作用。我们选择使用小鼠的复发性HSK模型，因其具有资源丰富且再激活时间可控的优势——再激活可通过暴露于UV-B光诱导而精确控制。迄今为止，该模型已帮助使用它的实验室鉴定了多个对该疾病具有重要意义的免疫学因子，同时也使我们能够评估治疗手段和疫苗的有效性。

方案

动物护理说明：本模型中不使用镇痛剂，因为镇痛剂具有抗炎作用，可能使模型失效。

1. 病毒的制备

1. 在Vero细胞（80%汇合度）中培养HSV-1，起始感染复数为0.01（在T-150培养瓶中，约5 × 10⁵个空斑形成单位），培养3-4天，直至所有细胞变圆，轻敲培养瓶即可脱落。
2. 将培养基转移至无菌离心管中，在Sorvall Legend RT离心机中于4 °C、3,500 rpm离心15分钟。弃去上清液（见步骤1.3），将每个50 ml离心管中的大沉淀物用总共5 ml培养基重悬。分两次、每次30秒进行超声处理，共1分钟。
3. 将上清液转移至50 ml无菌Oak Ridge管中，在Beckman J2-21离心机中于4 °C、9,000 rpm离心1小时，以获得少量病毒沉淀。弃去上清液。
4. 将步骤1.2中的超声产物与步骤1.3获得的沉淀混合，再次超声处理45秒。在Sorvall Legend RT离心机中于4 °C、1,500 rpm离心5分钟。保留上清液，即为病毒原液，分装后储存于-70 °C。
5. 在Vero细胞上测定病毒滴度。通常从10⁰至10^-8进行连续10倍稀释，每种稀释度设两个复孔，共两套独立稀释系列。病毒滴定在12孔无菌培养板中进行。

2. 小鼠感染....

讨论

本文所述的疱疹性间质性角膜炎（HSK）复发模型使研究者能够在更接近人类疾病实际情况的体系中研究人类HSK。因此，该模型的优势在于，疾病发生时所处的免疫系统已在初次感染过程中被激活。由于这些小鼠已对HSV-1产生免疫应答，再次激活该免疫应答的因素可能与最初引发免疫应答的因素不同。因此，用于预防原发性HSK的治疗干预措施并不总能改善复发性HSK，我们在先前多篇文献中已证实了原发性与复发性HSK之间的差异^6,8,10-13,15。如前所述，这一现象在开发预防人类HSK的疫苗时尤为明显。大多数疫苗可预防原发性HSK的发生，但极少有疫苗被证明能有效减少复发性HSK^6,10,11。

该模型的缺点是实验耗时较长。在初次感染后，小鼠需要近6周的时间进入潜伏感染状态，且所给予的人血清已被代谢。此外，并非所有潜伏感染的小鼠都会向感染眼的泪膜中释放可检测到的病毒。这并不意味着它们没有发生再激活，而仅说明我们无法通过病毒培养检测到其再激活。很可能大多数甚至全部小鼠都发生了再激活，但产生的病毒数量不足以通过蚀斑法检测到。

....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma	D5796
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150
人血清	Sigma	S7023
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-C1
青霉素-链霉素溶液	Sigma	P4333
两性霉素B（Fungizone）	Invitrogen	15290018
离心机	Sorvall	Legend RT
离心机	Beckman	52-21
透射紫外灯	UVP	95-0452-02
超声破碎仪	Branson	Sonifier 450
橡树岭离心管	Nalgene	Z 720410
培养瓶 - 7150	Corning	430823
培养板 - 12孔	Corning	CLS 3513
培养板 - 48孔	Corning	CLS 3548
无菌锥形离心管 - 30 ml	Corning	CLS 430828
无菌棉签	Fisher	23-400-125
30G针头	Becton-Dickinson	305106
25G针头	BD	305122
10 ml注射器	BD	309602
10 ml注射器	BD	309604