大多数关于疱疹性角膜病的研究采用原发感染模型。然而，HSV-1的原发感染通常不会导致人类疾病。本文描述了一种更接近人类疾病的疱疹性角膜病复发模型。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
单纯疱疹性眼病，称为单纯疱疹性间质性角膜炎（HSK），是一种可能导致失明的角膜感染，每年因此接受治疗的临床就诊人数超过30万人次。在患有临床疾病的患者中，有1%至2%将出现感染角膜的视力丧失。绝大多数此类病例是由单纯疱疹病毒1型（HSV-1）潜伏感染的再激活所致，而非急性疾病引起。有趣的是，目前最常用于研究该疾病的模型是急性感染模型。然而，人们认为HSK的复发模型更能反映临床疾病的实际过程。目前用于HSK的复发动物模型包括兔和小鼠模型。兔模型的优点在于，其潜伏感染可在无已知刺激的情况下发生再激活。但缺点是，由于缺乏小鼠所具备的丰富免疫学与遗传学研究资源，难以深入探究多种免疫因子在复发性HSK中的作用。我们选择使用小鼠的复发性HSK模型，因其具有资源丰富且再激活时间可控的优势——再激活可通过暴露于UV-B光诱导而精确控制。迄今为止，该模型已帮助使用它的实验室鉴定了多个对该疾病具有重要意义的免疫学因子，同时也使我们能够评估治疗手段和疫苗的有效性。
方案
动物护理说明：本模型中不使用镇痛剂，因为镇痛剂具有抗炎作用，可能使模型失效。
1. 病毒的制备
- 在Vero细胞（80%汇合度）中培养HSV-1，起始感染复数为0.01（在T-150培养瓶中，约5 × 105个空斑形成单位），培养3-4天，直至所有细胞变圆，轻敲培养瓶即可脱落。
- 将培养基转移至无菌离心管中，在Sorvall Legend RT离心机中于4 °C、3,500 rpm离心15分钟。弃去上清液（见步骤1.3），将每个50 ml离心管中的大沉淀物用总共5 ml培养基重悬。分两次、每次30秒进行超声处理，共1分钟。
- 将上清液转移至50 ml无菌Oak Ridge管中，在Beckman J2-21离心机中于4 °C、9,000 rpm离心1小时，以获得少量病毒沉淀。弃去上清液。
- 将步骤1.2中的超声产物与步骤1.3获得的沉淀混合，再次超声处理45秒。在Sorvall Legend RT离心机中于4 °C、1,500 rpm离心5分钟。保留上清液，即为病毒原液，分装后储存于-70 °C。
- 在Vero细胞上测定病毒滴度。通常从100至10-8进行连续10倍稀释，每种稀释度设两个复孔，共两套独立稀释系列。病毒滴定在12孔无菌培养板中进行。
2. 小鼠感染
- 按每20克小鼠体重注射0.1毫升麻醉剂混合液（氯胺酮60 mg/kg + 塞拉嗪5 mg/kg，用HBSS稀释）。该混合液因在正确剂量下具有较高的安全性，且药效持续时间较短，是常用的麻醉方法之一。
- 当小鼠进入麻醉状态后，在解剖显微镜下用30号针头轻划右眼角膜，注意避免角膜穿孔。
- 每只小鼠接受1毫升人混合血清（Sigma, Temecula, Calif.；抗HSV活性，50%病毒中和效价为1:800）的腹腔注射，以保护角膜在初次感染期间免受损伤。
- 使用耳夹或耳孔标记对小鼠进行编号。
- 所有小鼠编号完成后，使用20 μl移液器对每只小鼠的一只眼睛（通常为右眼）接种106 PFU（5 μl）。另一只眼睛滴加5 μl HBSS以保持湿润，因操作过程少于10分钟，此量足以维持眼部水合状态，且麻醉剂量已相应调整。感染后第3天，用无菌棉签蘸取1 ml Vero培养基润湿后擦拭小鼠眼部以确认感染情况，随后将100 μl拭子样本接种至48孔板中培养的Vero细胞。每日观察细胞病变效应（cpe）。
3. 小鼠潜伏感染的再激活
- 小鼠在初次感染后至少5周进行麻醉。需要注意的是，我们在初次感染后长达一年内对小鼠进行了再激活实验，未观察到反应存在显著差异。
- 麻醉后，将小鼠置于TM20 Chromato-Vu透射仪上，该仪器发射峰值波长为302 nm的UV-B，使仅单侧眼睛暴露于UV-B光下。每只小鼠暴露于250 mJ的UV-B光/cm2。
- 通过使用无菌棉拭子采集眼睛样本以确定再激活情况：首先在第0天（UV-B照射前，用于排除自发排毒小鼠）将拭子置于1 ml Vero培养基中，随后在UV-B照射后的第1至第7天重复采样。拭子样本的检测方法如2.5节所述。对于检测到感染性病毒的拭子，采用12孔板进行标准蚀斑实验测定病毒滴度。
4. 临床评估
- 由经过盲法训练的观察者使用双目解剖显微镜对小鼠的临床眼部疾病进行评估。
- 角膜混浊程度按0至4级评分，其中0表示基质透明，1表示轻度基质混浊，2表示中度混浊但虹膜结构仍可辨认，3表示重度混浊，除瞳孔边缘外虹膜细节消失，4表示完全混浊，无法观察眼后部结构。
- 新生血管化按1至8级评分，将角膜分为四个相等的象限，分别评估每个象限内血管化的范围。
- 睑缘炎的评分标准如下：0分，无病变；1分，眼睑轻度肿胀；2分，中度肿胀伴结痂性眼部分泌物；3分，重度肿胀、中度眶周脱毛及皮肤病变；4分，眼睑重度肿胀伴眼睑被分泌物粘连闭合、严重眶周脱毛及皮肤病变。
- 脑炎的征象包括弓背、毛发竖立及明显的神经系统异常。当小鼠出现显著脑炎症状时，予以实施安乐死。
5. 代表性结果
上述循环模型最初由 Shimeld 发表， 等. 1-3他们进行了测试，且多年来我们的实验室一直使用该模型的改进版本发表了大量论文。 4-15该模型用于定义细胞因子干扰素-γ在复发性HSV-1疾病中的作用 10如图所示 图3缺乏IFNγ的小鼠比野生型小鼠表现出更严重的角膜疾病 14它还被成功用于确定多种不同疫苗构建物的治疗价值 6,10,11请注意，在一个案例中，所测试的疫苗在预防性应用时效果良好，但未能证明具有治疗效果 6然而，当测试一种复制缺陷型病毒疫苗时，它不仅具有良好的预防效果，还表现出很强的治疗作用。 10,11，参见参考文献10中的图5。最近，我们已使用该模型来确定在经历复发性HSK的小鼠中是否存在可检测到的性别差异。如 图1 表明，雄性C57BL/6小鼠的角膜混浊程度显著低于雌性C57BL/6小鼠。同样，在评估角膜新生血管化时，雄性小鼠角膜中新血管生成也显著少于雌性小鼠（图2）。我们目前正在其他品系的小鼠中进行类似分析，以检测该表型是否具有品系特异性。我们还将确定这种差异是由于缺乏睾酮还是由于雌激素的存在所致。
图1. UV-B诱导潜伏感染再激活后，雄性和雌性C57BL/6小鼠品系的角膜病变情况。将潜伏感染的小鼠通过UV-B照射诱导病毒再激活，并在35天内监测其角膜混浊程度。本研究使用的小鼠数量如下：雄性，n = 15；雌性，n = 15。结果以均值±标准误表示。*在第14至35天期间，雌性C57BL/6小鼠的病毒诱导疾病显著更严重（P = 0.001 至 0.01）。
图2. C57BL/6小鼠品系在UV-B诱导再激活后雄性和雌性个体的角膜疾病表现。将潜伏感染的小鼠通过UV-B照射诱导病毒再激活，并在35天内监测其角膜新生血管的形成情况。本研究使用的小鼠数量如下：雄性，n = 15；雌性，n = 15。结果以均值±标准误表示。*在第14至28天期间，雌性C57BL/6小鼠的病毒诱导疾病显著更严重（P = 0.001 至 0.01）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的疱疹性间质性角膜炎（HSK）复发模型使研究者能够在更接近人类疾病实际情况的体系中研究人类HSK。因此，该模型的优势在于，疾病发生时所处的免疫系统已在初次感染过程中被激活。由于这些小鼠已对HSV-1产生免疫应答，再次激活该免疫应答的因素可能与最初引发免疫应答的因素不同。因此，用于预防原发性HSK的治疗干预措施并不总能改善复发性HSK，我们在先前多篇文献中已证实了原发性与复发性HSK之间的差异6,8,10-13,15。如前所述，这一现象在开发预防人类HSK的疫苗时尤为明显。大多数疫苗可预防原发性HSK的发生，但极少有疫苗被证明能有效减少复发性HSK6,10,11。
该模型的缺点是实验耗时较长。在初次感染后，小鼠需要近6周的时间进入潜伏感染状态，且所给予的人血清已被代谢。此外，并非所有潜伏感染的小鼠都会向感染眼的泪膜中释放可检测到的病毒。这并不意味着它们没有发生再激活，而仅说明我们无法通过病毒培养检测到其再激活。很可能大多数甚至全部小鼠都发生了再激活，但产生的病毒数量不足以通过蚀斑法检测到。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Jay Pepose 博士帮助我们学习该模型。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 EY11885（PMS）、EY21247（PMS），以及由“预防盲症研究”组织向眼科系提供的非限制性资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 人血清 | Sigma | S7023 | |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro | 25-005-C1 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma | P4333 | |
| 两性霉素B（Fungizone） | Invitrogen | 15290018 | |
| 离心机 | Sorvall | Legend RT | |
| 离心机 | Beckman | 52-21 | |
| 透射紫外灯 | UVP | 95-0452-02 | |
| 超声破碎仪 | Branson | Sonifier 450 | |
| 橡树岭离心管 | Nalgene | Z 720410 | |
| 培养瓶 - 7150 | Corning | 430823 | |
| 培养板 - 12孔 | Corning | CLS 3513 | |
| 培养板 - 48孔 | Corning | CLS 3548 | |
| 无菌锥形离心管 - 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| 无菌棉签 | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G针头 | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G针头 | BD | 305122 | |
| 10 ml注射器 | BD | 309602 | |
| 10 ml注射器 | BD | 309604 |
参考文献
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
