生化定义的大单层囊泡（LUVs）是一种便捷的模型系统，可用于分析BCL-2家族蛋白的相互作用，有助于深入理解线粒体介导的细胞凋亡通路。本文介绍了一种制备LUVs的方法，以及用于检测LUVs通透化的标准BCL-2家族蛋白组合和对照体系。
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摘要
摘要
BCL-2（B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤）家族由大约二十种蛋白质组成，这些蛋白质协同作用以维持细胞存活或启动细胞凋亡1。在细胞应激（例如，DNA损伤）后，促凋亡的BCL-2家族效应蛋白BAK（BCL-2拮抗性杀伤因子1）和/或BAX（BCL-2相关X蛋白）被激活，并通过线粒体外膜通透化（MOMP）过程破坏线粒体外膜（OMM）的完整性1。MOMP发生后，促凋亡蛋白（例如，细胞色素c）进入细胞质，促进半胱天冬酶（caspase）的活化，从而迅速引发细胞凋亡2。
为了诱导线粒体外膜透化（MOMP），BAK/BAX 需要与 BCL-2 家族另一促凋亡亚群——仅含 BCL-2 同源结构域 3（BH3-only）蛋白（如 BID（BH3 相互作用结构域激动剂））发生短暂相互作用3-6。抗凋亡 BCL-2 家族蛋白（例如，BCL-2 相关基因长亚型 BCL-xL；骨髓细胞白血病蛋白 1，MCL-1）通过严格调控 BAK/BAX 与能够直接激活 BAK/BAX 的 BH3-only 蛋白之间的相互作用，来调节细胞存活7,8。此外，抗凋亡 BCL-2 蛋白的可用性还受到敏感化/去阻遏型 BH3-only 蛋白（如 BAD（细胞死亡的 BCL-2 拮抗剂）或 PUMA（p53 上调的凋亡调节因子））的调控，这些蛋白可结合并抑制抗凋亡成员7,9。由于大多数抗凋亡 BCL-2 家族成员定位于线粒体外膜（OMM），细胞是维持存活还是启动 MOMP 的决策，由此膜上多种 BCL-2 家族成员间的相互作用共同决定。
大单层囊泡（LUVs）是一种生化模型，用于研究BCL-2家族蛋白相互作用与膜通透化之间的关系10。LUVs由明确组成的脂质构成，其比例依据从溶剂提取的非洲爪蟾线粒体中获得的脂质组分研究结果确定（46.5%磷脂酰胆碱、28.5%磷脂酰乙醇胺、9%磷脂酰肌醇、9%磷脂酰丝氨酸和7%心磷脂）10。该模型系统便于直接探究BCL-2家族蛋白的功能，因为其蛋白质和脂质组分完全明确且易于操控，而原代线粒体并不总是具备这些优势。尽管心磷脂在真实的外膜（OMM）中通常不会达到如此高的比例，但该模型仍能真实模拟OMM以促进BCL-2家族蛋白的功能。此外，上述方案的最新改进版本允许对蛋白质相互作用进行动力学分析，并实时测量膜通透化过程，其原理基于含有多阴离子染料（ANTS：8-氨基萘-1,3,6-三磺酸）和阳离子猝灭剂（DPX：p-二甲苯双吡啶溴化物）的LUVs11。当LUVs发生通透化时，ANTS与DPX扩散分离，从而检测到荧光信号增强。本文描述了利用含ANTS/DPX的LUVs进行实验时常用的重组BCL-2家族蛋白组合及对照设置。
方案
1. 混合脂质并制备脂质膜
- 在通风橱内且光照最小的条件下，使用经氯仿冲洗过的 Hamilton 气密玻璃注射器，将溶于氯仿的脂质加入 1.5 ml 棕色玻璃小瓶中。此混合物将得到约 4 mg 脂质（图 1A）。
- 心磷脂 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- 磷脂酰胆碱 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- 磷脂酰乙醇胺 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- 磷脂酰肌醇 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- 磷脂酰丝氨酸 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- 为去除氯仿，向小瓶中通入温和的惰性气体（例如，氮气或氩气）。干燥后，小瓶底部和壁面将出现可见的脂质薄膜，通常需要 2 - 3 小时（图 1A）。
2. 准备脂质体溶液
- 在1.7 ml 微量离心管中，用LUV缓冲液（0.2 mM EDTA、10 mM HEPES [pH 7]、200 mM KCl、5 mM MgCl2 ）配制500 μl 12.5 mM ANTS溶液，以及500 μl 45 mM DPX溶液（图1B）。
- 将ANTS溶液与DPX溶液混合，涡旋1分钟，并在室温下超声处理1分钟。超声处理在超声水浴中进行（例如 Branson 3510MTH，无需设置参数，仅开启即可）。此步骤可确保溶液完全溶解且均匀。
- 将ANTS/DPX溶液加入脂质膜中，并用封口膜密封小瓶（图1B）。
- 将含有脂质膜的样品在上述水浴中超声处理5分钟。超声后溶液呈乳白色。需确保脂质膜完全溶解，因为残留的小脂质聚集体将对后续步骤产生不利影响。同时检查小瓶的内壁和底部，确认无残留脂质膜（图1B）。
3. 脂质体的挤出与纯化
- 根据制造商的说明，使用LUV缓冲液润湿滤膜支撑物和聚碳酸酯膜来组装挤出器。拧紧装置外壳，以确保挤出过程中无体积损失，但不要过度拧紧以免损坏膜。建议先用LUV缓冲液测试挤出器，确保无泄漏或其他问题。
- 将脂质溶液置于右侧注射器中开始操作，将脂质溶液来回挤出31次，最终大单层囊泡（LUVs）将位于左侧注射器中；此步骤可确保所有脂质至少一次通过膜。最初几次通过膜时可能需要稍大的压力。若溶液突然快速通过膜，请检查膜是否破裂，并在必要时更换（图1C）。
- 准备一个10 ml Sepharose S-500重力流柱（1.0 cm × 20 cm，凝胶体积为10 ml）。用3倍柱体积的LUV缓冲液洗涤，待柱流停止后加盖密封。由于此步骤耗时较长，建议在脂质混合物干燥过程中即开始洗涤。在使用前保持柱子密封即可。
- 一次性将挤出后的LUVs加至柱顶，注意避免扰动凝胶界面。让缓冲液自然流出，待流速停止后塞住出口。轻轻用LUV缓冲液重新充满柱子。再次加缓冲液时需小心操作，避免扰动凝胶颗粒（图1C）。
- 移除塞子，收集6个1 ml的洗脱组分。LUVs通常在第3和第4组分中洗脱，可通过浑浊外观进行识别。收集完组分后，用5倍柱体积的水和2倍柱体积的20%乙醇洗涤柱子。将柱子保存于4 °C（图1C）。
- 将收集的组分避光保存于4 °C，直至进行检测。
4. 检测层析柱组分
- 现在通过比较含有0.5% CHAPS的LUV缓冲液与不含CHAPS的LUV缓冲液的荧光情况来检测柱层析组分。由于CHAPS存在而使荧光增强的组分即含有LUV。分别向六孔中各加入100 μl LUV缓冲液或含0.5% CHAPS的LUV缓冲液，并向每孔加入5 μl相应组分，混匀。所有LUV实验均使用不透明、黑色、未经处理的96孔板（图1D）。
- 在37 °C下读取酶标板，参数设置如下：激发波长：355 nm；发射波长：520 nm；增益（电压）：125；光学位置：顶部；读取高度：5.5 mm。该设置适用于使用Gen 5 2.0软件的BioTek H1 Synergy酶标仪（图1D）。
- 通常第3和第4组分的荧光强度会增加5至10倍。分析完成后，合并含有LUV的组分，并在避光条件下于4 °C保存；可获得约2 ml浓度约为2 mM的纯化脂质（图1D）。
5. 使用大单层囊泡研究BCL-2家族蛋白
- 检测BCL-2蛋白是否能够直接诱导LUV通透化及其对通透化活性的调控作用。LUV实验通常在100 μl体积中进行，反应温度为37 °C，可选择在30–60分钟后单次时间点检测（图2A-C，3A-B），或在长达1小时的时间内每1–2分钟进行一次动力学分析（图2D）。此处提供了一个代表性实验设计方案，列出了反应组分、储备液/终浓度以及添加顺序（表1）。建议在每次读数前让酶标仪对微孔板进行轻柔振荡混匀。动力学实验中最初几分钟的数据常出现波动（可能由于温度变化、混合不均等因素），因此通常在前2–3个读数点之后的数据点才用于分析。由于LUV批次间的差异，以及在激活或抑制的临界浓度下蛋白相互作用效率的波动，部分实验条件可能出现较大的误差范围，这是常见现象。
- BCL-2家族蛋白储备液应使用LUV缓冲液稀释至100倍浓度，随后对BAX、BID及其他所有蛋白进行必要的滴定，以确定在无BID存在时可检测到最低水平BAX依赖性LUV通透化的最低蛋白浓度，以及BAX与BID之间显著协同效应的条件。此外，对所有其他蛋白进行滴定也有助于减少蛋白浪费，并最大限度降低后续蛋白添加的浓度。
6. 代表性结果
观察和检测BCL-2家族依赖性调控LUV通透化的方法有多种选择。为建立LUV通透化的阳性对照，我们采用去污剂激活的BAX12。去污剂正辛基-β-D-葡萄糖苷（OG）可人工诱导BAX活化（配制100 μl含2.3 μM OG-BAX的溶液：将5 μg BAX加入含0.7% OG的LUV缓冲液中，4 °C孵育60分钟，分装后于-80 °C保存），因此OG-BAX（10–100 nM）可作为可靠的阳性对照。需要注意的是，OG浓度低于0.025%时不会直接影响LUV的通透化。使用0.5% CHAPS处理以确定每次实验中LUV荧光的最大释放量，该值定义为100%。所有处理均应设置三个重复。一个典型的LUV对照实验设置如表1所示，相应数据见图2A。
研究BCL-2家族蛋白对LUV通透化作用的一个必要起点是确定促进最佳释放的BAX和BID浓度。由于不同批次的蛋白制剂可能表现出不同的背景通透化活性，因此在开展更复杂的分析之前，建议先进行滴定实验。BAX（50 - 200 nM）和BID（0 - 10 nM）应分别进行滴定，以实现最小背景释放和最佳协同效应，如图2B-C所示。多种形式的BID蛋白可从R&D Systems公司购买； alternatively，BID BH3结构域肽段可从Anaspec公司获得。目前尚无适用于LUV实验的商业化BAX蛋白，因此必须采用已发表的方法3,13进行表达与纯化。
在确定 BAX 和 BID 的浓度及其协同作用后，常见的实验是测定抗凋亡蛋白对 BAX 和 BID 依赖性大单层囊泡（LUV）通透化的影响。BCL-xL 是一种抗凋亡的 BCL-2 家族成员，可商业获取，能够以剂量依赖的方式抑制 BAX 和 BID 的活性，通常需要比 BAX 或 BID 高 5 - 10 倍的摩尔过量（图 3A）。这种抑制作用可通过后续添加 BH3-only 蛋白（相对于 BCL-xL 为 2 - 5 倍摩尔过量）或 BH3 结构域肽段（相对于 BCL-xL 为 5 - 10 倍摩尔过量）而逆转；这些分子可结合 BCL-xL，从而释放 BAX 和 BID，使其协同作用并通透 LUV（图 3B）。在图 3B中，我们展示了全长重组人源 PUMAβ 的作用，而 PUMA BH3 结构域肽段的功能与其相似（数据未显示）8。该实验通常被称为“去抑制实验”（de-repression assay），因为 PUMA 蛋白解除了 BCL-xL 对 BAX 和 BID 的抑制作用。理想情况下，用于去抑制的 BH3-only 蛋白或肽段应对 BAX 的激活本身影响甚微14。
图 1. (A) 将氯仿溶解的脂质混合，干燥形成脂质膜，并加盖密封。(B) 配制 ANTS 与 DPX 溶液，混合后超声处理，以确保完全溶解并均质化。将该溶液加入脂质膜中，用封口膜密封小瓶，在水浴中超声处理 5 分钟，溶液此时将呈现乳白色。 (C) 将超声处理后的脂质溶液装入微型挤出器，反复挤出 31 次，随后加入预先准备的 Sepharose S-500 柱进行后续纯化。(D) 通过尺寸排阻色谱获得的各组分，通过比较 LUV 缓冲液与 LUV 缓冲液 + 0.5% CHAPS 中的相对荧光单位（RFUs）进行分析。“LUV 缓冲液”读数表示完整大单层囊泡（LUVs）的背景荧光；“LUV 缓冲液 + 0.5% CHAPS”条件则显示因裂解释放内容物而引起的荧光增强，表明 LUVs 的存在。通常第 3 和第 4 组分含有 LUVs，经分析后合并。第 5 和第 6 组分含有未包封的 ANTS（i.e., 挤出后未被包入 LUVs 的 ANTS），其荧光强度较高，且不受 CHAPS 影响。 点击此处查看高清大图。
图 2. 使用 LUV 进行的 BCL-2 家族对照实验及 BAX/BID 滴定。 (A) 对照实验。LUV 分别用 LUV 缓冲液、0.025% 辛基葡萄糖苷（OG）、50 nM BAX 或 50 nM OG-BAX 处理。LUV 在 37 °C 下孵育 60 分钟。通过从所有样品中减去缓冲液处理组的荧光值来确定通透化百分比（%），0.5% CHAPS 溶解样品定义为 100% 通透化；将实验值除以 CHAPS 样品的值，即可得到 LUV 通透化的百分比。OG-BAX 是去垢剂活化的 BAX，可作为 LUV 通透化实验的可靠阳性对照。 (B) 确定最佳 BAX 浓度。在存在 10 nM C8-BID（“BID”）或仅缓冲液的条件下，用递增浓度的 BAX（50–200 nM）处理 LUV。 (C) 确定最佳 BID 浓度。在存在 100 nM BAX 的条件下，用递增浓度的 BID（0–10 nM）处理 LUV。 (D) LUV 通透化动力学数据集示例。LUV 用 BAX（100 nM）± BID（10 nM）处理。每 2 分钟读数一次，持续 30 分钟，每次读数前进行 2 秒的轻微板振荡。图中未包含前三个读数（0、2 和 4 分钟）。最小和最大相对荧光单位（RFU）的确定方法见第 4.3 节。 图 2A–C 中的误差棒表示三次重复数据的标准差。图 2D 的数据来自两次重复实验。
图 3. 使用大单层囊泡（LUV）研究 BCL-2 家族蛋白相互作用的常见示例。（A） BCL-xL 抑制 BAX 和 BID 介导的 LUV 渗透化。LUV 与 100 nM BAX、10 nM BID 以及递增浓度的 BCL-xL（0–500 nM）共同孵育，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。（B） PUMA 解除 BCL-xL 的抑制作用，从而促进 BAX 和 BID 的功能。LUV 与 100 nM BAX、10 nM BID、500 nM BCL-xL 以及不同浓度的 PUMA（0–2.5 μM）组合孵育，孵育条件为 37 °C、60 分钟。单独使用 BAX 时，PUMA 的浓度为 2.5 μM。误差线表示三次重复实验数据的标准差。
| 添加顺序： | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 条件 | LUV 缓冲液 | OG (0.7%) | BAX (2.3 μM) | OG-BAX (2.3 μM) | CHAPS (10%) | LUVs (2 mM) | 总体积 |
| 缓冲液 | 95 μl | 5 μl | 100 μl | ||||
| OG (0.015%) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| BAX (50 nM) | 92.83 μl | - | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | ||
| OG-BAX (50 nM) | 92.83 μl | 2.17 μl | 5 μl | 100 μl | |||
| CHAPS (0.5%) | 90 μl | 5 μl | 5 μl | 100 μl |
表1. 一个对照实验示例，用于确定OG-BAX对LUV通透化的影响。
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讨论
所述生成大单层囊泡（LUV）的方法提供了一种快速且高效的方式，可在生化定义的膜环境中检测各种BCL-2家族蛋白、多肽及相关试剂的功能，该环境类似于线粒体外膜（OMM）。若采用终点值来测定LUV的通透化程度，可在同一天内设置多块微孔板，以分析数百种不同条件。我们发现，此类实验中的限制性因素通常是重组蛋白的质量和数量，因此投入充足的时间和资源进行蛋白纯化，将有助于获得可重复的LUV实验结果。
根据我们的经验，当大单层囊泡（LUV）在避光条件下于4 °C保存时，通常在两周内仍能对BAX和BID产生响应。然而，重组BCL-2蛋白更不稳定，在多次冻融后其活性可能发生显著变化。我们建议将蛋白储备液以尽可能高的浓度分装成小份，于-80°C保存，并在使用前即刻稀释。这样做可显著提高蛋白的使用效率，并减少实验结果的偶然性。确保检测孔中不存在气泡，因为气泡会导致酶标仪读数错误。此外，去垢剂可能会影响多种BCL-2蛋白的构象以及LUV的完整性，因此需谨慎操作，避免任何潜在的污染12。
关于BCL-2家族及其相互作用蛋白，仍...
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致谢
我们感谢Chipuk实验室所有成员的同事情谊与支持。此外，我们感谢Tomomi Kuwana和Donald Newmeyer为本研究奠定了实验基础。本研究获得以下资助：NIH CA157740（资助J.E.C.），NIH P20AA017067的试点项目（资助J.E.C.）。本研究还部分得到了March of Dimes基金会研究资助5-FY11-74（资助J.E.C.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 –乙醇胺 "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-磷脂酰胆碱（鸡蛋，鸡源）"PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-磷脂酰肌醇（肝脏，牛源）"PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）"PS" | Avanti | 8400320 | |
| 心磷脂（心脏，牛源 - 钠盐）"CL" | Avanti | 840012C | |
| 微型挤出器套装 | Avanti | 610023 | |
| PC膜，0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar黑色96孔板 | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| 人源切割型Caspase-8 BID蛋白 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| 人源BCL-xL蛋白（缺失C末端） | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3结构域多肽 | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1杂合多模式微孔板读板仪 | BioTek | None |
参考文献
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
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- Gavathiotis, E. BAX activation is initiated at a novel interaction site. Nature. 455, 1076-1081 (2008).
- Dewson, G. To trigger apoptosis, Bak exposes its BH3 domain and homodimerizes via BH3:groove interactions. Mol. Cell. 30, 369-380 (2008).
- Dewson, G. Bak activation for apoptosis involves oligomerization of dimers via their alpha6 helices. Mol. Cell. 36, 696-703 (2009).
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- Hsu, Y. T., Youle, R. J. Nonionic detergents induce dimerization among members of the Bcl-2 family. J Biol Chem. 272, 13829-13834 (1997).
- Suzuki, M., Youle, R. J., Tjandra, N. Structure of Bax: coregulation of dimer formation and intracellular localization. Cell. 103, 645-654 (2000).
- Du, H. BH3 domains other than Bim and Bid can directly activate Bax/Bak. J Biol Chem. 286, 491-501 (2011).
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