在Live哺乳动物细胞中质粒复制多代荧光显微镜监测

摘要

观察单个活细胞中的DNA分子的方法，进行说明。该技术是基于对一个荧光标记的lac阻遏物蛋白质设计到感兴趣的DNA结合位点的结合。此方法可适于后续许多随着时间的推移在活细胞中的重组DNA。

摘要

保持在哺乳动物细胞中很少有天然存在的质粒。其中γ-疱疹病毒的基因组，包括Epstein-Barr病毒（EBV）和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），这会导致多种人类恶性肿瘤的^1-3。在有执照的方式，每使用一个单一的病毒蛋白和细胞复制机制，这两个基因组复制传递到子代细胞在细胞分裂过程中，尽管他们缺乏传统的着丝粒^4-8。

已经做了许多工作，这些质粒基因组的复制特性，使用方法，如Southern杂交和荧光原位杂交（FISH）。是有限的，虽然这些方法。定量PCR和Southern杂交提供的每个细胞质粒细胞的人口平均数的信息。 FISH技术是一种单细胞的检测，揭示的平均数量和分布的质粒 s的细胞的细胞群，但是是静态的，允许任何信息的父母或研究细胞的后代。

在这里，我们描述了一个可视化的质粒在活细胞中的方法。这种方法是基于上的荧光标记的景点⁹的质粒中的多个站点的乳糖阻遏蛋白的结合。感兴趣的DNA的设计，以约250包括乳糖运算符（LACO）序列的串联重复序列。 LACO特异性结合由乳糖阻遏蛋白（LacI的），它可以是稠合的荧光蛋白质。的融合蛋白可以从工程质粒或引进由逆转录病毒载体表达。在这种方式中，该DNA分子是荧光标记的，并因此成为可见的，通过荧光显微镜。的融合蛋白被阻止质粒是通过在IPTG存在下培养细胞中的质粒DNA的绑定，直到准备好以进行查看。 ontent">此系统允许被监视的质​​粒通过几代人在活细胞中，揭示其合成的属性和分区子细胞。理想的细胞粘附，容易转染，并具有大的细胞核。这种技术已经被使用，以确定84％的EBV-来源质粒合成每一代和88％的新合成的质粒分区忠实地对这些EBV质粒在HeLa细胞中的子细胞。看到被拴或与姐妹染色单体在S之后所合成阶段，直到他们被视为分开的姐妹染色单体分离，后期¹⁰的方法目前正在研究的KSHV在HeLa细胞中的基因组和SLK细胞的复制。HeLa细胞的永生化人上皮细胞，SLK细胞永生化人脐静脉内皮虽然SLK细胞最初来自一个KSHV病变的细胞。，本HeLa细胞也SLK细胞系自然哈布口服补液盐KSHV基因组的^11。除了研究病毒的复制，该可视化技术可用于调查其他重组质粒DNA的合成，定位，和分区的各种DNA序列上的元素的添加，删除，或突变的影响。

方案

1。可见质粒的细胞工程

1. 使用标准的限制性消化或同源重组技术引入到质粒加以可视化的DNA片段，它含有约250份的乳糖操纵子序列（LACO）。我们的质粒Bacmid的是一个约170 kbp的，并包含了整个基因组的卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）编码的抗潮霉素^12。
2. 介绍法律咨询及田土转易处含有质粒DNA，脂质体2000转染哺乳动物细胞中。转染HeLa细胞和SLK细胞在60毫米菜为4小时10μg纯化的质粒DNA与25μL脂质体2000，0.5毫升OptiMEM，和3.5毫升DMEM。
3. 变更至5毫升的DMEM培养基中，用10％胎牛血清和孵育细胞48小时。
4. 板中的细胞低密度大的菜肴和培养细胞在含抗生素的选择对引进的解放军SMID;我们选择细胞与300微克/毫升潮霉素的3周，用10％的牛胎儿血清的DMEM中。
5. 使用无菌，胰蛋白酶浸泡过的滤纸片，潮霉素抗性菌落转移到新的培养皿中。
6. 当转染的克隆生长填补菜，分离DNA，限制性酶切分析和Southern印迹，以确保LACO质粒，该聚合物是均匀和预期大小。
7. 如果质粒并没有被设计，以表达融合的LacI的，编码乳糖阻遏（LacI的）稠合到一个红色荧光蛋白，如LacI的-tdTomato用反转录病毒感染合适的克隆。我们使用tdTomato，而不是蛋白质的荧光绿色，以尽量减少光毒性，会发生在很长的时间的多重曝光^13。
8. 一旦被引入的LacI融合蛋白，培养细胞在200微克/毫升异丙基-BD-硫代半乳糖苷（IPTG）以阻止从结合的融合蛋白的存在下DNA。
9. 至少3天的培养细胞，以允许的LacI-tdTomato蛋白的表达。
10. 屏幕克隆（通过洗去IPTG和查看（如下文所述）的细胞）为那些与最佳水平的LacI的-tdTomato揭示不同的信号与未结合的融合蛋白的最小的背景水平。

2。成像系统的发展的

我们的成像系统包括配备机动化的阶段和计划Aochromat 63x/1.4油物镜的Zeiss Axiovert 200M。由"中性白光LED的科利柏系统提供荧光的激发光。发射由CascadeII检测:1024 EMCCD相机。这是一个水冷，薄型背照式的摄像头，用于放大信号的增益寄存器;每秒每像素，暗电流为0.061电子的量子效率是大于0.90。该系统是由Axiovision 4.8软件，包括SmartExperiments模块。有关检测的tdToma的我们使用的Zeiss滤波器组75HE将通过所传递的光的85％的氟和95％的发射光可激发的发射滤波器。

1. 用倒置显微镜和敏感的检测信号，LED光源，用于特定的激发和快速模板，机动化阶段和焦点臂，和软件控制的自动化收购图像EMCCD相机组装的成像系统，在很长的时间间隔与多个Z-堆栈。该系统应该坐在空气表与振动隔离。
2. 装配一个阶段顶孵化器，以保持细胞在37℃，5〜10％CO _2的加湿室中。让系统有足够的时间来一个稳定的温度，以减少运动伪影，在实验过程中。
3. 使用温水领的目标，防止目标从样品虹吸热。

3。标记的DNA的可视化

1. 在一个35毫米的板细胞玻璃底皿的密度小于10％汇合，这将允许对细胞分为8-16细胞菌落的不重叠。执行此操作前至少24-48小时的活细胞成像所以有时间来划分。
2. 成像开始之前的一至三个小时，冲洗该板3次，用缺乏选择性的药物和IPTG的培养基。此过程洗去非活细胞，并允许LacI的融合蛋白结合的质粒的法律咨询及田土转易处网站。
3. 更换用2ml的DMEM培养基中，用10％胎牛血清和25mM的HEPES。
4. 拉伸更换培养皿CultFoil的顶部安装环为35 mm的菜。此盖会抑制蒸发的培养基中，这将增加盐的浓度随着时间的推移和杀死细胞。
5. 使用微分干涉相差（DIC）的成像，以查看的细胞，并确定多个的视场中的单元格的顶部和底部的焦平面。在每个字段中，将移动到一个焦平面，约1/3的方式，从细胞的顶部。保存的x，y，z坐标列表中保存的舞台位置。
   注:通过目镜观察时照明的发光二极管的波长适当的LacI融合蛋白的细胞质粒的信号可能是不可见的。弱信号可能只与EMCCD相机，它允许集成的信号随着时间的推移，从而有效地放大弱信号的使用可见。
6. 在的显微镜控制软件，定义堆栈的图像，来执行在每个保存的台位置的z-。选择AZ步长为0.35-0.50微米，这将允许您以近似奈奎斯特采样在z方向^14。中包括的"额外"的切片平面的上方和下方，其中的细胞都位于这些片的允许检测后，在细胞周期的细胞运动，并还用在采集后的处理（去卷积）的图像栈。这包含导致堆栈40-60图像，这取决于细胞的厚度上。
7. 在的显微镜控制软件中，定义一个时间系列实验，以在30分钟的时间间隔（在很长的时间用于跟踪的细胞分裂和迁移）和荧光图像，在10-60分钟的时间间隔收集明亮视场图像的z栈（用于可视化的质粒在细胞内）。 DIC成像在实验过程中，不要使用，因为它需要更多的光线比标准的明场成像，可长期实验的过程中不必要的光毒性的细胞暴露。
8. 启动软件控制的实验。确保该系统在实验过程中不被干扰（碰撞，暴露于过量的室内光线下，等）。
9. 如果有必要，在实验过程中补充水的加湿系统中。

4。收购后处理图像

1. 检查每个Z-Stack与时间点的图像。裁剪出任何不必要的领域的图像以减少计算机处理时间在下一步骤中。
2. 使用去卷积算法重新分配信号强度的像素的原产地每个z-堆垛¹⁵中。虽然这可以基于解卷积的理论为您的成像系统的点扩散函数，它是优选由成像荧光微球测量您的特定系统的点扩散函数，并使用此测量中去卷积算法。我们测量我们的成像系统的点扩散函数和应用约束迭代在AxioVision软件（AxioVision软件的描述，蔡司）的最大似然算法。
3. 检查图像跟踪的强度变化和变动的质粒在细胞周期中的分区子细胞的质粒。

结果

在图3中示出在一个有代表性的实验中获得的z-堆栈的最大强度投影。典型的质粒的信号都出现在3-8片的z-堆栈，这取决于它们是否代表单或簇的质粒。在EBV-和KSHV衍生质粒的情况下，在细胞内信号慢慢地移动，直到电池达到的有丝分裂。细胞本身迁移的实验过程。他们也变成球形，并在有丝分裂过程中脱离的菜。健康的HeLa细胞和SLK细胞的细胞周期约24小时，;这些类型超过30小时，以完成细胞周期的细胞被认为是不健康的。子细胞通常附加彼此靠近，并划分在同一时间在接下来的细胞周期。仅可以显示，以完成一个细胞周期的细胞进行分析。

05/4305fig1.jpg"ALT ="图1"/>
图1。计划使质粒可见的。 （A）的乳糖操纵子序列（LACO）的串联重复序列被克隆到质粒的兴趣。 （LACI）中的乳糖阻遏蛋白特异性结合这些​​序列融合荧光蛋白招募荧光标记的质粒的兴趣。 （B和C）的HeLa细胞的核表达LacI的-tdTomato荧光由于本地化到...

讨论

这里描述的方法可以被用来追踪跨越多个世代的随着时间的推移在活的哺乳动物细胞中的质粒。通过限制暴露于激发光，我们已经使用了这些技术，按照新划分对16-32细胞的殖民地，在至少72个小时和3个细胞分裂的细胞。这些实验提供不能获得的信息，可以从静态试验，如定量PCR，Southern杂交，和FISH。

关键是要筛选的细胞克隆具有均匀的结构的质粒，作为重排时，可能会发生使用质粒的重复序列，如串联LACO重复。此外，它是有用的，以优化为最佳的信号强度的逆转录病毒感染的细胞的感染和屏幕克隆。 LacI的蛋白质太多的表达具有较高的背景荧光在细胞核中，表达过少都会有微弱的信号。最后，我重要的是要研究在细胞形态和标志使用在他们的可视化的视野时，选择健康的细胞。

此技术可用于几乎任何可视化的DNA分子，只要它可以被设计，以包括的LACO序列的串联重复序列。例子包括细胞自然发生和人工染色体，质粒，病毒颗粒包装内的病毒基因组。在图3中所示的类似的实验中，我们发现，我们的KSHV衍生的质粒在细胞分裂过程中出现随机进行分...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO	11965
OptiMEM	GIBCO	31985
胎牛血清	Hyclone公司	SH30910.03
青霉素	西格玛	P3032
硫酸链霉素	西格玛	S9137
潮霉素	Calbiochem公司	400050	400微克/毫升的SLK; 300微克/毫升的HeLa细胞
异丙基-BD-硫代半乳糖苷（IPTG）	罗氏公司	10 724 815 001	最终浓度200微克/毫升
脂质体2000	Invitrogen公司	11668-027
HEPES	GIBCO	15630
玻璃底菜	MatTek	P35G-1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
Axiovert 200M	蔡司
科利柏	蔡司	423052-9500-000
中性白色LED	蔡司	423052-9120-000
过滤器立方75 HE	蔡司	489075-0000-000
计划复消色差63x/1.4目标	蔡司	440762-9904-000
CascadeII:1024 EMCCD相机	光度	B10C892007
Tempcontrol小	蔡司/ Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37-2数字	蔡司/ Pecon	000000-1052-320
CTI控制器3700数字	蔡司/ Pecon	411856-9903
目的加热器	蔡司/ Pecon	440760-0000-000
第一阶段加热插入P	蔡司/ Pecon	411861-9901-000
舞台顶部孵化器小号	蔡司/ Pecon	411860-9902-000
加湿系统	蔡司/ Pecon	000000-1116-065