方法文章

在Live哺乳动物细胞中质粒复制多代荧光显微镜监测

DOI：

10.3791/4305

⸱

2012年12月13日

 ,  , 
1Department of Oncology, University of Wisconsin - Madison

本文内容

摘要

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观察单个活细胞中的DNA分子的方法，进行说明。该技术是基于对一个荧光标记的lac阻遏物蛋白质设计到感兴趣的DNA结合位点的结合。此方法可适于后续许多随着时间的推移在活细胞中的重组DNA。

摘要

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保持在哺乳动物细胞中很少有天然存在的质粒。其中γ-疱疹病毒的基因组，包括Epstein-Barr病毒（EBV）和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV），这会导致多种人类恶性肿瘤的1-3。在有执照的方式，每使用一个单一的病毒蛋白和细胞复制机制，这两个基因组复制传递到子代细胞在细胞分裂过程中，尽管他们缺乏传统的着丝粒4-8。

已经做了许多工作，这些质粒基因组的复制特性，使用方法，如Southern杂交和荧光原位杂交（FISH）。是有限的，虽然这些方法。定量PCR和Southern杂交提供的每个细胞质粒细胞的人口平均数的信息。 FISH技术是一种单细胞的检测，揭示的平均数量和分布的质粒 s的细胞的细胞群，但是是静态的，允许任何信息的父母或研究细胞的后代。

在这里，我们描述了一个可视化的质粒在活细胞中的方法。这种方法是基于上的荧光标记的景点9的质粒中的多个站点的乳糖阻遏蛋白的结合。感兴趣的DNA的设计，以约250包括乳糖运算符（LACO）序列的串联重复序列。 LACO特异性结合由乳糖阻遏蛋白（LacI的），它可以是稠合的荧光蛋白质。的融合蛋白可以从工程质粒或引进由逆转录病毒载体表达。在这种方式中，该DNA分子是荧光标记的，并因此成为可见的，通过荧光显微镜。的融合蛋白被阻止质粒是通过在IPTG存在下培养细胞中的质粒DNA的绑定，直到准备好以进行查看。 ontent">此系统允许被监视的质​​粒通过几代人在活细胞中，揭示其合成的属性和分区子细胞。理想的细胞粘附，容易转染，并具有大的细胞核。这种技术已经被使用，以确定84％的EBV-来源质粒合成每一代和88％的新合成的质粒分区忠实地对这些EBV质粒在HeLa细胞中的子细胞。看到被拴或与姐妹染色单体在S之后所合成阶段，直到他们被视为分开的姐妹染色单体分离，后期10的方法目前正在研究的KSHV在HeLa细胞中的基因组和SLK细胞的复制。HeLa细胞的永生化人上皮细胞，SLK细胞永生化人脐静脉内皮虽然SLK细胞最初来自一个KSHV病变的细胞。，本HeLa细胞也SLK细胞系自然哈布口服补液盐KSHV基因组的11。除了研究病毒的复制，该可视化技术可用于调查其他重组质粒DNA的合成，定位，和分区的各种DNA序列上的元素的添加，删除，或突变的影响。

方案

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1。可见质粒的细胞工程

  1. 使用标准的限制性消化或同源重组技术引入到质粒加以可视化的DNA片段，它含有约250份的乳糖操纵子序列（LACO）。我们的质粒Bacmid的是一个约170 kbp的，并包含了整个基因组的卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）编码的抗潮霉素12。
  2. 介绍法律咨询及田土转易处含有质粒DNA，脂质体2000转染哺乳动物细胞中。转染HeLa细胞和SLK细胞在60毫米菜为4小时10μg纯化的质粒DNA与25μL脂质体2000，0.5毫升OptiMEM，和3.5毫升DMEM。
  3. 变更至5毫升的DMEM培养基中，用10％胎牛血清和孵育细胞48小时。
  4. 板中的细胞低密度大的菜肴和培养细胞在含抗生素的选择对引进的解放军SMID;我们选择细胞与300微克/毫升潮霉素的3周，用10％的牛胎儿血清的DMEM中。
  5. 使用无菌，胰蛋白酶浸泡过的滤纸片，潮霉素抗性菌落转移到新的培养皿中。
  6. 当转染的克隆生长填补菜，分离DNA，限制性酶切分析和Southern印迹，以确保LACO质粒，该聚合物是均匀和预期大小。
  7. 如果质粒并没有被设计，以表达融合的LacI的，编码乳糖阻遏（LacI的）稠合到一个红色荧光蛋白，如LacI的-tdTomato用反转录病毒感染合适的克隆。我们使用tdTomato，而不是蛋白质的荧光绿色，以尽量减少光毒性，会发生在很长的时间的多重曝光13。
  8. ....

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结果

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在图3中示出在一个有代表性的实验中获得的z-堆栈的最大强度投影。典型的质粒的信号都出现在3-8片的z-堆栈，这取决于它们是否代表单或簇的质粒。在EBV-和KSHV衍生质粒的情况下，在细胞内信号慢慢地移动，直到电池达到的有丝分裂。细胞本身迁移的实验过程。他们也变成球形，并在有丝分裂过程中脱离的菜。健康的HeLa细胞和SLK细胞的细胞周期约24小时，;这些类型超过30小时，以完成细胞周期的细胞被认为是不健康的。子细胞通常附加彼此靠近，并划分在同一时间在接下来的细胞周期。仅可以显示，以完成一个细胞周期的细胞进行分析。

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图1。计划使质粒可见的。 （A）的乳糖操纵子序列（LACO）的串联重复序列被克隆到质粒的兴趣。 （LACI）中的乳糖阻遏蛋白特异性结合这些​​序列融合荧光蛋白招募荧光标记的质粒的兴趣。 （B和C）的HeLa细胞的核表达LacI的-tdTomato荧光由于本地化到.......

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讨论

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这里描述的方法可以被用来追踪跨越多个世代的随着时间的推移在活的哺乳动物细胞中的质粒。通过限制暴露于激发光，我们已经使用了这些技术，按照新划分对16-32细胞的殖民地，在至少72个小时和3个细胞分裂的细胞。这些实验提供不能获得的信息，可以从静态试验，如定量PCR，Southern杂交，和FISH。

关键是要筛选的细胞克隆具有均匀的结构的质粒，作为重排时，可能会发生使用质粒的重复序列，如串联LACO重复。此外，它是有用的，以优化为最佳的信号强度的逆转录病毒感染的细胞的感染和屏幕克隆。 LacI的蛋白质太多的表达具有较高的背景荧光在细胞核中，表达过少都会有微弱的信号。最后，我重要的是要研究在细胞形态和标志使用在他们的可视化的视野时，选择健康的细胞。

此技术可用于几乎任何可视化的DNA分子，只要它可以被设计，以包括的LACO序列的串联重复序列。例子包括细胞自然发生和人工染色体，质粒，病毒颗粒包装内的病毒基因组。在图3中所示的类似的实验中，我们发现，我们的KSHV衍生的质粒在细胞分裂过程中出现随机进行分.......

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披露

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没有利益冲突的声明。

致谢

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这项工作是由美国国立卫生研究院和ACS，包括T32CA009135，CA133027，CA070723，和CA022443补助。比尔萨格登是美国癌症学会的研究教授。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
的试剂的名称 公司 目录编号 评论
DMEM GIBCO 11965
OptiMEM GIBCO 31985
胎牛血清 Hyclone公司 SH30910.03
青霉素西格玛 P3032
硫酸链霉素西格玛 S9137
潮霉素 Calbiochem公司 400050 400微克/毫升的SLK; 300微克/毫升的HeLa细胞
异丙基-BD-硫代半乳糖苷（IPTG） 罗氏公司 10 724 815 001 最终浓度200微克/毫升
脂质体2000 Invitrogen公司 11668-027
HEPES GIBCO 15630
玻璃底菜 MatTek P35G-1.5-10-C
CultFoil Pecon 000000-1116-08
Axiovert 200M 蔡司
科利柏蔡司 423052-9500-000
中性白色LED 蔡司 423052-9120-000
过滤器立方75 HE 蔡司 489075-0000-000
计划复消色差63x/1.4目标蔡司 440762-9904-000
CascadeII:1024 EMCCD相机光度 B10C892007
Tempcontrol小蔡司/ Pecon 000000-1116-070
Tempcontrol 37-2数字蔡司/ Pecon 000000-1052-320
CTI控制器3700数字蔡司/ Pecon 411856-9903
目的加热器蔡司/ Pecon 440760-0000-000
第一阶段加热插入P 蔡司/ Pecon 411861-9901-000
舞台顶部孵化器小号蔡司/ Pecon 411860-9902-000
加湿系统蔡司/ Pecon 000000-1116-065

参考文献

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  1. Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
  2. Chang, Y., et al.

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